四君子湯治療胃黏膜損傷的機(jī)制探究

孫玉婷，劉明暉，方 爽，王長(zhǎng)宏*

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六五醫(yī)院，吉林 吉林 132011）

胃潰瘍（gastric ulcer, GU）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，其發(fā)病與病原體感染、非甾體類(lèi)藥物和心理因素等相關(guān)[1-2]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與了GU的形成，GU發(fā)生的高危因素中，如HP感染[3]、NSAIDs損傷[4]、乙醇破壞[5]，有ROS的產(chǎn)生參與。當(dāng)體內(nèi)的活性氧簇（ROS）的過(guò)度產(chǎn)生破壞細(xì)胞內(nèi)源性氧化平衡后，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激應(yīng)答[6-7]。Keap1/Nrf2/ARE 是目前研究較熱門(mén)的抗氧化信號(hào)通路之一，Nrf2是維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體受到大量ROS刺激時(shí)，Nrf2會(huì)與Keap1分離，游離狀態(tài)下的Nrf2會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化元件ARE結(jié)合，啟動(dòng)很多下游的抗氧化基因和解毒基因的激活轉(zhuǎn)錄，如血紅素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO1）等，從而發(fā)揮清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡等作用，避免機(jī)體免到受氧化損傷[8-9]。因此我們可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化機(jī)制來(lái)改善治療GU。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草組成。在臨床上治療消化道潰瘍（PU）、慢性胃炎、消化不良等疾病，在治療安全性、降低西藥副作用以及減少?gòu)?fù)發(fā)率方面[10-11]，都被證實(shí)有良好的效果。但四君子湯治療GU是否可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來(lái)達(dá)到治療GU的效果尚不明確。本研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用乙醇誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞氧化損傷，檢測(cè)氧化調(diào)節(jié)因子Nrf2及其下游調(diào)控的HO1、NQO1的表達(dá)量，從而來(lái)探究SJZD保護(hù)胃黏膜的抗氧化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1）四君子湯：藥物均經(jīng)專家鑒定符合藥典要求，按照人參12 g，茯苓12 g，白術(shù)12 g，炙甘草8 g，藥物來(lái)源及藥液制作方法參考如下[12]，制備母液濃度為1 g·mL-1，濃縮后配制含生藥2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1藥液備用。2）試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；青霉素鏈霉素雙抗、顯影液、0.22 μm PVDF膜、RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR?Premix Ex Taq? II購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。3）試劑盒：CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RNA抽提試劑盒（柱式）、cDNA合成試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。4）細(xì)胞系：人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%血清和1%雙抗），培養(yǎng)在37 ℃，5%二氧化碳 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，確保無(wú)污染。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

將GES-1細(xì)胞接種到96孔板（4×104/孔），分6個(gè)濃度梯度組及1個(gè)空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換為100 μL濃度分別為2 000 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1、500 mg·mL-1、100 mg·mL-1、50 mg·mL-1、0 mg·mL-1的 SJZD藥物培養(yǎng)24 h，棄藥物培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 h后，每孔加入10 μL CCK工作液，再培養(yǎng)2 h后，檢測(cè)各孔OD值，選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)最適SJZD濃度。

細(xì)胞接種及分組同上，分別在0 mg·mL-1、500 mg·mL-1的 含SJZD藥物培養(yǎng)基中24 h，加入100 μL 含 0%、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。按照上述CCK-8試劑步驟檢測(cè)，選擇最佳無(wú)水乙醇濃度。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率（%） = （對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）÷（對(duì)照組OD值－空白孔OD值）×100%。

1.4 凋亡檢測(cè)

將GES-1細(xì)胞接種到6孔板（1×105/孔），貼壁后，更換為含藥物的培養(yǎng)基，24 min后，加入2 mL含0%或5%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞（含上清），按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡染色并送流式分析。凋亡細(xì)胞定義為Annexin V陽(yáng)性的細(xì)胞。

1.5 ROS流式檢測(cè)

將1×105個(gè)GES-1細(xì)胞接種到6孔板，貼壁后，換含藥物或PBS的培養(yǎng)基，24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入含5%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ROS染色并送流式分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞用藥物處理24 h，用5%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，4 h后，按實(shí)際說(shuō)明書(shū)操作，用RNA提取試劑盒提取RNA，并進(jìn)行cDNA合成，隨后將cDNA產(chǎn)物與指定引物和SYBR?Premix Ex Taq? II進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。利用ΔCT值相對(duì)定量法分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。公式為：ΔCT對(duì)照=CT對(duì)照目標(biāo)基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因；ΔCT樣本= CT樣本目標(biāo)基因-CT樣本內(nèi)參基因；ΔΔCT=ΔCT樣本-ΔCT對(duì)照；基因相對(duì)表達(dá)量= 2^-ΔΔCT。

1.7 Western Blot

細(xì)胞用藥物處理24 h，用5%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，4 h后，收集細(xì)胞，加入5倍體積的RIPA細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上裂解30 min。用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，用SDS上樣緩沖液與樣本混合并在100℃加熱10 min，隨后進(jìn)行SDS凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后進(jìn)行封閉、一抗和二抗孵育后，用ECL顯影液在顯影儀下顯影并拍照記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并用t檢驗(yàn)分析組間差異；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分比（%）表示，并用χ2檢驗(yàn)分析組間差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SJZD降低乙醇誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的凋亡和ROS含量

為進(jìn)一步研究四君子湯保護(hù)急性胃黏膜損傷的機(jī)制，首先研究了不同濃度四君子湯和不同濃度的無(wú)水乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響（見(jiàn)表1、表2）。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇了最適濃度500 mg·L-1SJZD以及5%的無(wú)水乙醇。圖1可以看出SJZD治療組的凋亡水平明顯低于模型組，但并達(dá)到至正常組水平。表3、表4可以看出，SJZD治療組對(duì)比模型組顯著降低了GES-1細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）以及細(xì)胞內(nèi)ROS含量（P＜0.05），SJZD可抑制乙醇誘導(dǎo)下產(chǎn)生的GES-1細(xì)胞的凋亡水平和ROS強(qiáng)度。

表1 不同濃度SJZD對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響（n= 6）

表2 不同濃度無(wú)水乙醇下SJZD對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響（n= 6）

表3 SJZD對(duì)5%乙醇誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率的影響（n= 6）

表4 SJZD對(duì)5%乙醇誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的ROS的影響（n= 6）

圖1 SJZD對(duì)5%乙醇誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 SJZD對(duì)GES-1細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)量的影響

Nrf2是重要的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因，是目前已知的抗氧化系統(tǒng)中最重要的基因，其激活可提高細(xì)胞抵抗氧化損傷的能力[13]。圖2所示，SJZD治療組的Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)量對(duì)比模型組顯著上升（P＜0.05），提示四君子湯可激活Nrf2信號(hào)通路。如表5所示，SJZD 治療組細(xì)胞中Nrf2及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA表達(dá)量均較模型組有顯著上調(diào)（P＜0.05），有趣的是我們發(fā)現(xiàn)SJZD組中的3組基因的表達(dá)亦有所上調(diào)。Western Blot與RT-qPCR的結(jié)果一致，都表明在SJZD治療組（5%無(wú)水乙醇與500 mg·L-1SZJD的藥物培養(yǎng)），激活了Nrf2信號(hào)通路，增強(qiáng)了GES-1細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)能力，改善了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化環(huán)境，促進(jìn)GES-1細(xì)胞生存。

表5 SJZD對(duì)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA影響（n= 6）

圖2 SJZD對(duì)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白影響

2.3 ML385聯(lián)合實(shí)驗(yàn)抑制了SJZD的保護(hù)作用

為了驗(yàn)證SJZD對(duì)GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用是否依賴于Nrf2，我們用Nrf2選擇性抑制劑ML385[14]與SJZD聯(lián)合處理。結(jié)果如下：在5%的無(wú)水乙醇作用下，對(duì)比SJZD組，SJZD+ML385組的細(xì)胞生長(zhǎng)活力（表6）明顯受到了抑制（P＜0.05），細(xì)胞凋亡水平（表7、圖3）明顯上升（P＜0.05）和ROS水平（表8）顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。ML385可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激通路Nrf2及其下游基因表達(dá)，從而消除了SJZD對(duì)GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖3 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用

表6 ML385影響SJZD對(duì)無(wú)水乙醇損傷GES-1細(xì)胞活力的保護(hù)作用（n= 6）

表7 ML385抑制SJZD的抗凋亡作用（n= 6）

表8 ML385抑制SJZD的抗ROS作用（n= 6）

3 討論

GU屬于中醫(yī)“痞滿、胃脘痛”范疇，2017年中醫(yī)消化道潰瘍指南專家共識(shí)中指出[15]，根據(jù)其胃黏膜病理特點(diǎn)增加了“胃瘍”一名。中醫(yī)認(rèn)為GU的發(fā)病與飲食、情志、久病、體虛等相關(guān)，致使脾胃運(yùn)化失司，脾胃乃后天之本，脾胃虛弱會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，削弱其保護(hù)防御作用。SJZD作為補(bǔ)脾胃的第一方，現(xiàn)代研究證實(shí)可以發(fā)揮促進(jìn)黏膜恢復(fù)[16]、抗炎[17]、抗氧化應(yīng)激[18]等作用。有研究報(bào)道，SJZD可以改變胃黏膜黏蛋白含量、胃黏膜免疫細(xì)胞亞群等，從而恢復(fù)黏膜屏障功能[19]。王東旭等也報(bào)道SJZD可以通過(guò)影響多胺防治胃黏膜損傷[20]。

乙醇是誘發(fā)GU中較為常見(jiàn)的因素。通過(guò)乙醇誘發(fā)的潰瘍與人胃黏膜損傷非常相似且重復(fù)性好[21]，已成為研究GU廣泛使用的經(jīng)典模型[22]。其機(jī)制是主要通過(guò)減弱胃黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，增加ROS產(chǎn)生，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]，而細(xì)胞的持續(xù)凋亡也會(huì)破壞胃黏膜的完整性，導(dǎo)致其功能的障礙。本研究結(jié)果顯示，SJZD可以抑制乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞的凋亡和ROS產(chǎn)生，提高了抗氧化標(biāo)記物Nrf2、HO-1、NQO1的表達(dá)，對(duì)GES-1細(xì)胞起到了保護(hù)作用。

在GU的發(fā)生研究中，胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡對(duì)胃潰瘍發(fā)生和愈合具有重要作用[24-25]。本研究首次報(bào)道SJZD可以有效減少乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，降低乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞內(nèi)的ROS水平和細(xì)胞凋亡率。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)主要的應(yīng)激應(yīng)答基因，其激活可以促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)能力，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本研究結(jié)果顯示，乙醇處理后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1均有較低程度的激活，這可能是細(xì)胞對(duì)乙醇損傷的適應(yīng)性反應(yīng)。SJZD可以在mRNA水平和蛋白水平有效激活Nrf2及其下游靶基因HO-1和NQO1表達(dá)，這可能是SJZD保護(hù)GES-1細(xì)胞免受乙醇損傷的機(jī)制。因此，我們又用Nrf2的選擇性抑制劑ML385進(jìn)行研究，結(jié)果顯示ML385消除了SJZD湯對(duì)GES-1細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，表明SJZD對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用依賴于Nrf2的激活。我們的研究結(jié)果也支持了之前的假設(shè)。

本研究通過(guò)四君子湯在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外效應(yīng)機(jī)制研究，驗(yàn)證了四君子湯通過(guò)激活Nrf2相關(guān)的抗氧化通路應(yīng)答，減輕乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜損傷。