miR-204-3p通過靶向SIRT1對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和遷移的影響

閆 剛，陳坤菊，陳曼玲

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 婦科，海南 ?？?571700)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的一組惡性腫瘤，主要發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性[1]。該病占生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的30%左右，且趨于年輕化趨勢，死亡率也比較高，嚴重威脅女性的身心和健康[2]。目前80%左右的子宮內(nèi)膜癌局限于宮體，早期癥狀明顯，較容易診斷治療，預后良好，但是仍有20%左右的患者會出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后不佳[3]。子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生在腫瘤細胞、宿主細胞、細胞外基質(zhì)及周圍組織環(huán)境，并且受多種因素的制約，是一個多步驟的連續(xù)復雜過程，包括子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、浸潤、血管形成、遠處定植生長等[4]。相關(guān)研究表明，腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移是兩個密切相關(guān)的過程，是腫瘤進一步發(fā)展的主要表現(xiàn)[5]。細胞侵襲是腫瘤發(fā)展、組織或者器官轉(zhuǎn)移的主要因素，病變大量轉(zhuǎn)移最終會導致器官衰竭乃至患者死亡。因此，研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制對疾病早期診斷和靶向治療具有非常重要的作用。

miRNA是非編碼小RNA，在細胞通路中具有重要的調(diào)節(jié)作用，與腫瘤和心血管障礙等很多疾病的關(guān)系密切[6]。相關(guān)研究表明，miR-204-3p可通過靶向下調(diào)EphB2來抑制非小細胞肺癌的增殖、侵襲、遷移，誘導細胞凋亡[7]。也有研究表明，INC00483在結(jié)直腸癌中表達增高且可通過抑制miR-204-3p的方式促進結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[8]。但miR-204-3p在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)報道較為罕見。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Silent mating type information regulation 2 homologue 1，SIRT1)具有廣泛的生理病理學生物作用，參與細胞新陳代謝、細胞增殖、凋亡、衰老和應激反應以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 在腫瘤中通過作用于各種癌基因或抑癌基因發(fā)揮著重要作用， SIRT1在子宮內(nèi)膜癌中表達增加并與子宮內(nèi)膜癌患者生存期相關(guān)[10]，但關(guān)于miR-204-3p和SIRT1在子宮內(nèi)膜癌中的關(guān)系尚無法證實，所以本研究明確miR-204-3p和SIRT1在子宮內(nèi)膜癌中的作用和機制，為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供新的指導方向。

1 材料與方法

1.1 組織樣本選取 2018～2019年在本院婦產(chǎn)科行子宮切除的子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織標本65例，所有參與本次研究的標本均經(jīng)過病理證實，所有子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前未接受放化療、靶向治療或者激素治療。取出的標本均經(jīng)過10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，制成蠟塊，備實驗使用。

1.2 實驗材料 人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa購自于中國科學院上海細胞庫；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、PBS購自Gibco公司；陰性對照物(NC)、miR-204-3p mimics、anti-陰性對照(anti-NC)、miR-204-3p inhibitors由中國上海生工生物工程有限公司合成；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher scientific 公司；Trizol、RIPA 裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa培養(yǎng)和分組 將人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa放在含有10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液、90% RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，5% CO2，當融合度達到80%時替換培養(yǎng)基。將Ishikawa細胞分為N組、miR-204-3p mimics組、anti-NC組、miR-204-3p inhibitors組，使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將NC、miR-204-3p mimics、anti-NC、miR-204-3p inhibitors轉(zhuǎn)染到每組的Ishikawa細胞中。通過NCBI查詢到SIRT1基因轉(zhuǎn)錄本(NM_001357129)，得到CDS序列，克隆在pcDNA3.1(-)+GFP載體中，構(gòu)建SIRT1 (3`UTR的區(qū)域)過表達pcDNA3.1(+)-SIRT1質(zhì)粒，將miR-204-3p mimics和過表達pcDNA3.1(+)-SIRT1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到Ishikawa細胞中為miR-204-3p mimics +SIRT1組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 qRT-PCR檢測組織中miR-204-3p和SIRT1 mRNA的表達 將組織放在液氮中研磨成粉狀，利用Trizol法提取子宮內(nèi)膜癌組織和正常組織的總RNA，用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀釋，利用紫外分光光度計測定A260和 A280值，根據(jù)1OD=40 μg定量，并計算 A260/A280比值，A260/A280比值均在2.0以上；RNA電泳實驗檢測RNA提取物的完整性(用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠；在超凈工作臺上，用移液器吸取總RNA樣品4 μL于封口膜上。在實驗臺上再加入5 μL 1×TAE電泳緩沖液及1 μL的10×載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結(jié)果)；將提取好的RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，將各樣品cDNA稀釋處理，取2μL樣品擴增，按照qRT-PCR試劑盒使用說明檢測miR-204-3p和SIRT1 mRNA的水平，miR-204-3pmRNA上游5′-CCUCGGGUGACACCCUCCCAGA-3′,下游5′- UGCAGGGAAACGGAAGGGUC-3′；SIRT1 mRNA上游5′- GUACAGGAAUUGUUCCACCAGCA-3′,下游5′- GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA-3′；引物序列作為內(nèi)參，異物序列為上游5′- UCAAAAAGAAUGUGAAUGUU-3′,下游5′- GUUCCACCAGAAUGA-AUGUC-3′,PCR反應體系為20μL,PCR反應條件為95°C，5 min變性40 s、72 ℃退火30 s、62 °C延伸10 s，40個循環(huán)，用相對定量2-ΔΔCT計算組織中miR-204-3p和SIRT1 mRNA的水平。

1.3.3 Western blot檢測SIRT1蛋白 取子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織剪碎，勻漿，BCA法定量并提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液中封閉，孵育抗體，加入SIRT1(1∶1 000稀釋)抗體，孵育過夜，加入山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，孵育2 h。滴加化學發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞愈合情況 將轉(zhuǎn)染后的4組Ishikawa細胞以1.5×105個/孔接種于12孔板中，置于培養(yǎng)箱中過夜，將配置好的混合液分別加入，培養(yǎng) 6～8 h后，更換液體1次，細胞培養(yǎng) 24 h 后，取出培養(yǎng)板，用 20 μL 槍頭在每孔底部劃“十”字，劃完后用 PBS 沖洗，加入無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，此時記為0 h，然后放到37 ℃、5 % CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h鏡下觀察傷口愈合情況。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 將各組轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細胞按 3×105個/孔接種于6孔板中,將Matrigel 4 ℃溶化，采用無血清培養(yǎng)基稀釋，取稀釋后的Matrigel溶液，鋪于Transwell小室的上室濾膜上,使Matrigel膜凝固,將Matrigel凝固好的小室取出，放入 24孔板，加入FBS培養(yǎng)基，經(jīng)胰酶消化，將濃度調(diào)整為8×105個/mL細胞加入小室中，培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定，每孔加入 600 μL 0.1%結(jié)晶紫染色，染色15 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 Transwell實驗檢測細胞遷移 將各組轉(zhuǎn)染后的Ishikawa細胞PBS清洗，離心后重懸細胞，對細胞進行計數(shù)，每個Transwell小室加入1.5×105個細胞，Transwell小室加入20%的600 μL胎牛血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，24 h后，采用4%多聚甲醛固定，加入 600 μL 0.1%結(jié)晶紫染色，染色15 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 熒光素酶報告分析 經(jīng)Targetscan網(wǎng)站http://www.targetscan.org/vert_72/進行生物學分析，預測了結(jié)合位點，熒光素酶報告基因檢測證實了這一點。構(gòu)建pGL3-SIRT1-3-UTR-MUT和pGL3-SIRT1-3-UTR-WT質(zhì)粒，將Ishikawa細胞培養(yǎng)于24 孔板中，100 ng的pGL3-SIRT1-3-UTR-MUT和 pGL3-SIRT1-3-UTR-WT使用Lipofectamine 2000和miRNA對照及過表達載體分別共轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞。48 h后獲得細胞，用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)測定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-204-3p和SIRT1在癌組織和癌旁組織中的表達 電泳圖譜應可清晰看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的3條帶，且28s rRNA的亮度為18s rRNA的兩倍，表明本實驗提取的RNA未降解，可用于后續(xù)實驗(見圖1A)；癌組織中miR-204-3p mRNA的表達顯著低于癌旁組織(P<0.05，見圖1B); 癌組織中SIRT1 mRNA的表達明顯高于癌旁組織(P<0.05，見圖1C)。

*：與癌組織相比，P<0.05。

2.2 miR-204-3p對Ishikawa細胞劃痕愈合能力的影響 miR-204-3p mimics組中的細胞劃痕愈合率顯著低于NC組(P<0.05，見圖2A、B); miR-204-3p inhibitors組中的細胞劃痕愈合率明顯高于anti-NC組(P<0.05，見圖2A、B)。

*：與NC組、anti-NC組相比，P<0.05。

2.3 miR-204-3p對Ishikawa細胞遷移和侵襲能力的影響 miR-204-3p mimics組中的細胞遷移和侵襲能力顯著低于NC組(P<0.05，見圖3A、B); miR-204-3p inhibitors組中的細胞遷移和侵襲能力明顯高于anti-NC組(P<0.05，見圖3A、B)。

圖3 miR-204-3p對Ishikawa細胞侵襲和遷移能力的影響

2.4 miR-204-3p對SIRT1蛋白的影響 miR-204-3p mimics組中的SIRT1蛋白表達顯著低于NC組(P<0.05); miR-204-3p inhibitors組中的SIRT1蛋白表達明顯高于anti-NC組(P<0.05，見圖4)。

圖4 miR-204-3p對SIRT1蛋白的影響

2.5 miR-204-3p和SIRT1靶向關(guān)系 經(jīng)Targetscan網(wǎng)站進行生物學分析，miR-204-3p可與SIRT1載體點位相互結(jié)合，通過熒光素酶報告分析，HNRNPA2B1 mRNA的3′-UTR 是miR-204 的直接結(jié)合位點(P<0.05，見圖5B)。對于野生型來說，miR-204-3模擬組中SIRT1載體的熒光素酶活性較空白組明顯降低(P<0.05)，突變型無顯著性差異(P>0.05，見圖5)。

*：與NC組相比，P<0.05。

2.6 miR-204-3p靶向SIRT1對Ishikawa細胞遷移和侵襲能力的影響 miR-204-3p mimics組中的細胞遷移和侵襲能力顯著低于NC組和miR-204-3p mimics+SIRT1組(P<0.05); NC組和miR-204-3p mimics+SIRT1組細胞遷移和侵襲能力對比無顯著性差異(P>0.05，見圖6)。

*：與NC、miR-204-3p mimics+SIRT1組相比，P<0.05；#：NC組與miR-204-3p mimics+SIRT1組相比，P>0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是比較常見的婦科腫瘤，宮腔積液、陰道流血、流液或積膿是子宮內(nèi)膜癌的主要癥狀[11]。另外，子宮內(nèi)膜癌晚期有可能出現(xiàn)浸潤壓迫髂血管引起同側(cè)下肢水腫疼痛，還有可能浸潤不同的部位出現(xiàn)不同的癥狀[12]。該病的病因目前尚不清楚，根據(jù)研究和臨床觀察，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生可能與子宮內(nèi)膜增生過長、絕經(jīng)后延、晚絕經(jīng)、不育、家族史等具有一定的相關(guān)性，月經(jīng)不調(diào)、肥胖、過度補充雌激素和腫瘤家族史等是誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的主要因素[13]。子宮內(nèi)膜癌的預后受多種因素的影響，包括腫瘤分級和分期。根治性手術(shù)是早期子宮內(nèi)膜癌的有效治療手段，但是術(shù)后仍有將近40%的患者在短時間內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，為了改善這種情況，在早期診斷的情況下，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子和信號通路對早期診斷和靶向治療具有非常重要的意義[14]。

目前針對于miRNA的研究多集中于腫瘤細胞，miRNA是廣泛存在于多種生物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，在細胞侵襲和遷移中發(fā)揮著非常重要的作用，同時也和人類的各種疾病關(guān)系密切[15]。根據(jù)其調(diào)控的作用可分為癌基因和抑癌基因。miR-204-3p參與了特定類型細胞侵襲和遷移的調(diào)控，被認為是一種腫瘤抑制因子，可以抑制多種類型癌細胞侵襲和遷移，比如食管鱗癌[16]和非小細胞肺癌等[17]。相關(guān)研究報道，miR-204-3p對肝癌內(nèi)皮細胞具有抑制生長的作用[18]，而miR-204-3p在子宮內(nèi)膜癌細胞中的作用機制尚不明確。SIRT1在人體組織細胞中廣泛分布，影響著細胞的多種生物學過程[19]，相關(guān)研究報道，SIRT1在骨肉瘤和肝癌中表達升高，表明預后不良，屬于癌基因[20-21]。研究表明，SIRT1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)[22]。相關(guān)研究報道，糖尿病患者子宮內(nèi)膜組織中SIRT1的表達增加，提示發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風險增加[23]。SIRT1在腫瘤中的作用機制比較復雜，但關(guān)于miR-204-3p通過靶向SIRT1對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響未見相關(guān)報道，所以在本研究中，我們首先驗證了miR-204-3p和SIRT1在癌組織和癌旁組織中的表達，為了證明miR-204-3p在Ishikawa細胞中的作用，又繼續(xù)驗證了miR-204-3p對Ishikawa細胞侵襲、遷移的影響和miR-204-3p與SIRT1的靶向關(guān)系。

研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-204-3p mRNA的表達顯著低于癌旁組織，癌組織中SIRT1 mRNA的表達明顯高于癌旁組織；過表達miR-204-3p細胞劃痕愈合率顯著降低，抑制miR-204-3p 表達，細胞劃痕愈合率明顯升高；過表達miR-204-3p，細胞遷移和侵襲能力顯著降低，抑制miR-204-3p 表達，細胞遷移和侵襲能力明顯升高，miR-204-3p和SIRT1具有一定的靶向關(guān)系；過表達miR-204-3p，Ishikawa細胞中的SIRT1蛋白表達明顯降低，抑制miR-204-3p 表達，Ishikawa細胞中的SIRT1蛋白表達明顯升高；且同時轉(zhuǎn)染miR-204-3p mimics+SIRT1的表達顯著低于過表達miR-204-3p組中的細胞遷移和侵襲能力。從而說明miR-204-3p可能屬于抑癌基因，而SIRT1屬于癌基因，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。相關(guān)研究表明，miR-204-3p信號轉(zhuǎn)導的改變能夠促進腎透明細胞癌的侵襲[24]。也有研究報道，miR-204-3p也可抑制口腔鱗癌的發(fā)生[25]。

綜上所述，miR-204-3p可以通過下調(diào)SIRT1的表達來抑制Ishikawa細胞遷移和侵襲，可能與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，后續(xù)研究將構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌小鼠模型，在體內(nèi)實驗，進一步探討miR-204-3p通過靶向SIRT1對子宮內(nèi)膜癌移植瘤生長的影響。