金釵石斛眼用溫敏凝膠的制備及評價

陳 莉，吳玉梅，王 森，熊永愛，呂佳佳，劉永鴻，申志林，譚道鵬

(遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099)

金釵石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]，其性甘、微寒，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，主治熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟等病癥[2]。現(xiàn)代研究表明，金釵石斛對白內障[3]、青光眼[4]、視疲勞[5]、干眼癥[6-7]等眼部疾病亦具有突出的治療效果，因此開發(fā)出高生物利用度的金釵石斛眼用制劑將有利于提高其療效以及在臨床眼科領域的利用價值。

目前，金釵石斛已作為原材料用于多種眼用制劑的開發(fā)，如“石斛夜光丸”、“石斛明目丸”、“石斛爽目顆粒”等，這類制劑多以口服給藥為主，需通過機體吸收進入全身循環(huán)系統(tǒng)才能到達治療部位，而針對眼部疾病而言，口服給藥的靶向性不強，無法實現(xiàn)快速有效的治療作用。因此，基于眼用溫敏凝膠[8]是一種優(yōu)于傳統(tǒng)滴眼液和眼膏劑的新型給藥系統(tǒng)，具有生物利用度高、使用方便、患者依從性好等獨特優(yōu)勢，本文以泊洛沙姆188和407為溫敏凝膠基質將金釵石斛提取物制成眼用溫敏凝膠劑，希望通過直接與眼部接觸，延長作用時間，進而提高其療效。貴州是金釵石斛的主產地之一，本研究不僅為金釵石斛新產品的開發(fā)提供了參考和依據(jù)，也為推動其種植產量、帶動地方經濟做出了貢獻。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫7820A型氣相色譜儀，安捷倫科技(上海)有限公司；FA2004型電子分析天平，上海菁華；PHS-3B型精密pH計，上海平軒科學儀器有限公司；NDJ-8S型旋轉黏度計，上海魅宇儀器科技有限公司；SHZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器，金壇市朗博儀器制造有限公司；GH-15型高精度恒溫水槽，上海舜制儀器制造有限公司；TGL-16C型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；XW-80A旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DN-36A氮吹儀，無錫沃信儀器有限公司。

1.2 試藥 金釵石斛提取物，由遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室贈送，石斛堿含量為9.16 %；石斛堿對照品，98.19 %，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，批號19120910；萘，92.9 %，西格瑪奧德里奇貿易有限公司，批號111516-1809；鹽酸丁卡因，98 %，四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq20102607；泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，江西仁恒藥業(yè)有限公司；甲醇和乙腈，色譜純，上海躍勝貿易有限公司；磷酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和碳酸氫鈉均為分析純。

1.3 實驗動物 新西蘭兔，購于遵義醫(yī)科大學實驗動物中心，普通級，健康無眼疾，雄性，體重2.4～2.6 kg，許可證號SYXK(黔)2021-0004。

2 方法與結果

2.1 金釵石斛溫敏凝膠的制備 根據(jù)預試驗結果，稱取0.20 g泊洛沙姆188和2.50 g泊洛沙姆407撒入11 g人工淚液中，置4 ℃冰箱過夜使其充分溶脹，即得到空白溫敏凝膠溶液。另取Labrasol 100 μL，加入金釵石斛提取物0.25 g，超聲使其完全溶解，在磁力攪拌作用下，將空白溫敏凝膠以細流狀加入提取物溶液，充分混勻后于4 ℃高速離心即得含藥溫敏凝膠，經氣相色譜分析測得凝膠中石斛堿的含量為1.81 mg/g，樣品置4 ℃冰箱密閉儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 金釵石斛溫敏凝膠的體外性質評價

2.2.1 pH值的測定 取0.10 g含藥溫敏凝膠于燒杯中加水50 mL使溶解，采用pH計測定其pH值。重復3 次，測得其平均值為6.65±0.15，符合眼用制劑pH值6.0～8.0的要求。

2.2.2 黏度的測定 取含藥溫敏凝膠適量于50 mL量筒中并將其置于冰水浴中，采用旋轉黏度計的3號轉子、轉速調至45 rpm測定其黏度。重復3次，測得其平均值為(230.01±1.74)mPa·s，此時溫敏凝膠的流動性較好、可方便使用。

2.2.3 膠凝溫度與膠凝時間的測定 取5 mL含藥溫敏凝膠溶液于10 mL玻璃試管并放入20 ℃恒溫水浴，每升溫0.2 ℃則保溫3 min，然后迅速翻轉試管觀察凝膠溶液的流動情況，記錄溶液不流動、形成凝膠時的溫度，即膠凝溫度T1[9]。將水浴溫度調至35 ℃，傾斜試管使之與水平面夾角成60 °，然后沿一個方向緩慢轉動，以試管內液體不流動作為成膠判定依據(jù)，記錄膠凝時間t[10]。于上述試管中，按40∶7的體積比加入人工淚液[8]混勻，同膠凝溫度T1的測定法測定膠凝溫度T2。各實驗重復3 次，測得含藥溫敏凝膠加人工淚液前、后的膠凝溫度分別為(26±0.2、36±0.2)℃，膠凝時間僅需(24±1.5)s，可滿足給藥后在眼部快速形成凝膠的要求。

2.2.4 體外溶蝕性及釋藥性能考察 采用無膜溶出法。稱取1.00 g含藥溫敏凝膠溶液置于已稱重的具塞試管中，放入35 ℃恒溫振蕩器使其完全膠凝后用移液器沿管壁小心加入2.0 mL等溫人工淚液，以100 rpm開始振蕩。達30 min時將試管中全部人工淚液立即轉移至塑料離心管中，并用濾紙迅速拭干試管外水分、稱重，再將其快速放回恒溫振蕩器中，重復以上操作。如此反復，直至試管中剩余凝膠量少于起始量的10 %為止[8]。

根據(jù)相鄰取樣點的重量差異，計算凝膠累積溶蝕量和累積溶蝕率(Y)，以Y對時間(t)作圖，得到凝膠累積溶蝕曲線。精密吸取100 μL各時間點收集的人工淚液加200 μL甲醇渦旋混勻后以10 000 rpm離心10 min，再取上清液240 μL按2.3.4項下方法進行后續(xù)處理后進行氣相色譜分析，計算藥物含量和累積釋藥率(Q)，以(Q)對時間(t)作圖，得到累積釋放曲線。結果見圖1。

圖1 金釵石斛溫敏凝膠的累積溶蝕及釋放曲線

結果表明，在考察時間內凝膠溶蝕與藥物釋放均近似遵循零級動力學方程。經線性擬合，得到累積溶蝕方程為：Y=0.196 1t+7.790 4(r=0.992 6)，累積釋放方程為Q=0.189 6t+9.932 8(r=0.993 9)。將Q對Y進行線性回歸，可得Q=0.994 7Y+12.924(r=0.990 3)，表明凝膠溶蝕與藥物釋放的線性關系良好，石斛堿的釋放速度與程度幾乎與溫敏凝膠的溶蝕過程同步。

2.3 金釵石斛溫敏凝膠的房水藥動學初步評價

2.3.1 色譜條件 DB-1毛細管柱(100 %二甲基聚硅氧烷為固定相，柱長30 m，內徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm)，程序升溫：初始溫度80 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持5 min，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃，載氣(N2)流速2 mL/min，進樣量1 μL，分流比1∶1。

2.3.2 方法學考察 (1)溶液的制備：對照品溶液的制備：精密稱取石斛堿對照品5.00 mg，用甲醇溶解，制成濃度為50.00 μg/mL的石斛堿對照液。內標溶液的制備：精密稱取內標物萘2.40 mg，用甲醇溶解，制成濃度為24.00 μg/mL的內標溶液?？瞻追克畼悠返闹苽洌喝?00 μL空白房水，加入200 μL甲醇渦旋、離心。再取上清240 μL經N2吹干后加100 μL甲醇復溶，即得。空白房水+對照品+內標樣品的制備：取100 μL空白房水，加入60 μL石斛堿對照液和140 μL甲醇，按標曲的制法制得石斛堿濃度為16.00 μg/mL，內標濃度為3.84 μg/mL的樣品。房水樣品+內標樣品的制備：取眼部給藥20 min的房水樣品100 μL，按2.3.4項下方法進行前處理，即得。

(2)專屬性考察：將空白房水、空白房水+對照品+內標、房水樣品+內標三份樣品，按2.3.1項下色譜條件進行分析，考察房水成分及內標對石斛堿含量測定是否有干擾。由圖2可知，石斛堿的出峰時間約為18.41 min，萘的出峰時間約為9.41 min，兩者分離度良好，且空白房水對樣品的含量測定無干擾。

A：空白房水；B：空白房水+對照品+內標；C：房水樣品+內標；1：石斛堿；2：萘。

(3)線性考察：取7份100 μL空白房水于離心管中，分別加入10、20、30、40、50、60、80 μL濃度為50.00 μg/mL的石斛堿對照液和190、180、170、160、150、140、120 μL的甲醇，渦旋混勻后離心。取上清液240 μL經N2吹干后加16 μL內標溶液和84 μL甲醇復溶，得石斛堿濃度為4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、16.00、32.00 μg/mL，內標濃度為3.84 μg/mL的混合對照液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析。記錄石斛堿和內標物的峰面積Ai、As，以石斛堿濃度為縱坐標(Y)、Ai/As為橫坐標(X)繪制標準曲線(見圖3)，得出回歸方程為Y=8.191X-0.2536，r=0.9989，表明石斛堿在4.00～32.00 μg/mL的濃度范圍內，線性關系良好。

圖3 石斛堿標準曲線

(4)精密度考察：按標曲制備方法分別制備石斛堿濃度為4.00、16.00、32.00 μg/mL，內標濃度為3.84 μg/mL的混合對照液，按2.3.1色譜條件分析。平行測6次，連測3天，計算日內和日間精密度。由表1可知，儀器精密度良好。

(5)回收率考察：取3份100 μL空白房水于離心管中，加甲醇200 μL渦旋離心后取上清240 μL N2吹干，分別加入8、32、64 μL石斛堿對照液，16 μL內標溶液和76、52、20 μL甲醇復溶，制得石斛堿濃度為4.00、16.00、32.00 μg/mL，內標濃度為3.84 μg/mL的溶液，渦旋混勻后高速離心，取上清進樣分析。另取3份100 μL兔眼空白房水于離心管中，按標曲的制法分別制備具有相同石斛堿濃度和內標濃度的溶液，進樣分析，計算其回收率。由表1可知，方法回收率結果符合石斛堿樣品的定量要求。

表1 精密度和方法回收率試驗結果

綜上，本文所建立的氣相色譜方法適用于石斛堿相關樣品的含量分析。

2.3.3 動物分組、給藥及取樣 將32只雄性新西蘭兔隨機分8組，每組4只兔子(8只眼睛)對應一個采樣時間點，給藥前禁食不禁水12 h。固定兔子頭部，用生理鹽水沖洗雙眼并用紗布蘸干后于雙眼各滴100 μL金釵石斛溫敏凝膠溶液，輕輕閉合雙眼瞼30 s，分別于給藥前和給藥后5、10、20、40 min，1、2、3 h用生理鹽水沖洗結膜囊及角膜，紗布蘸干后滴入適量1 %的鹽酸丁卡因溶液進行表麻，再以1 mL注射器自角膜緣刺入前房緩慢抽取200 μL房水，置-20 ℃凍存?zhèn)溆肹11-12]。實驗結束后，從兔子耳緣靜脈注入空氣進行處死，尸體運到遵義醫(yī)科大學新浦校區(qū)動物尸體冷藏室由學校統(tǒng)一處理。

2.3.4 樣品前處理 樣品經10 000 r/min離心10 min后，取100 μL上清加200 μL甲醇渦旋混勻，再次離心后取上清240 μL經N2吹干，隨后加16 μL內標溶液和84 μL甲醇復溶，經高速離心后取上清80 μL于進樣瓶中按2.3.1項下色譜條件進樣分析。通過標曲計算各個時間點房水樣本中的藥物濃度，繪制藥-時曲線，采用DAS 2.0藥動學軟件估算藥物的主要藥動學參數(shù)。

兔眼房水中石斛堿的藥動學結果如圖4所示。結果表明，金釵石斛溫敏凝膠經眼部給藥后石斛堿的組織通透性較好，可迅速穿過角膜進入房水(Tmax=0.17±0.07 h)并達到較高的峰濃度(Cmax=24.53±6.42 μg/mL)，且在1 h后藥物濃度已降至Cmax的2.22 %，其藥動學過程整體表現(xiàn)出吸收快、消除快(t1/2=0.75±0.11 h)的特點。AUC值采用梯形面積法計算，得到AUC0-3為10.56±0.84 μg·h/mL。

圖4 兔眼房水中石斛堿藥-時曲線(n=8)

2.4 安全性評價

2.4.1 單次給藥眼部刺激試驗 取健康無眼疾新西蘭兔8只，雌雄各半，左眼滴入金釵石斛溫敏凝膠0.1 mL，右眼滴入等量生理鹽水作為對照，被動閉合10 s。給藥24 h后用溫水去除殘留受試物，觀察并記錄去除受試物后1周內對眼睛角膜、虹膜、鞏膜及結膜等的刺激情況。

2.4.2 多次給藥眼部刺激試驗 操作方法同單次給藥。每天給藥2次，持續(xù)7 d；每天末次給藥后1 h觀察對眼睛的刺激情況。停藥后，持續(xù)觀察7 d，眼睛對刺激恢復情況和時間。

依照《中華人民共和國衛(wèi)生部新藥研究指導原則匯編》中的眼刺激試驗評分標準[13]打分并求得綜合評分，滿分16分。當綜合評分為0～3分表示無刺激性，4～8分表示有輕度刺激性，9～12分表示有中度刺激性，13～16分表示有強度刺激性。

評分結果見表2，經單次給藥后兔子雙眼角膜無渾濁，虹膜無異常，結膜無充血、腫脹、僅見少量分泌物，綜合評分為1。經多次給藥后，除結膜有輕微水腫和少量分泌物外其余無異常，停藥后該異常現(xiàn)象消失，這可能與溫敏凝膠給藥溫度較低造成的眼睛刺激性有關，其綜合評分小于3。由此表明金釵石斛溫敏凝膠制劑性質溫和、無明顯刺激性。

表2 金釵石斛眼用溫敏凝膠連續(xù)給藥對家兔眼刺激性實驗結果(n=8)

2.5 穩(wěn)定性評價 取本品適量置于離心管中，測定初始膠凝溫度，再分別于60 ℃和-20 ℃儲存48 h[14]。由表3可知，金釵石斛溫敏凝膠在高溫及低溫環(huán)境放置48 h后外觀性狀、膠凝溫度等無明顯變化，性質穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性考察結果(n=3)

3 討論

石斛堿是金釵石斛的主要活性成分之一，也是《中國藥典》規(guī)定的定量指標成分[2]，其含量測定方法包括氣相色譜法[15]、酸性染料分光光度法[16]和液相色譜法[17]等。經預實驗結果發(fā)現(xiàn)，溫敏凝膠基質泊洛沙姆存在較高的紫外吸收易對石斛堿的含量測定造成干擾，故酸性染料分光光度法和液相色譜法都不宜用于溫敏凝膠樣品中石斛堿的含量測定，因此本實驗首選氣相色譜法。本文建立的氣相色譜條件操作簡單、專屬性好、儀器靈敏度高，適于體內外樣品中石斛堿的含量分析。

藥動學評價是考察眼用制劑體內吸收情況的重要依據(jù)，而角膜是眼用制劑中藥物吸收的主要屏障。本文藥動學結果顯示，金釵石斛溫敏凝膠經眼部給藥后可快速穿透角膜進入房水并達到峰濃度，該結果可能與泊洛沙姆和Labrasol的增溶與促滲透作用[18]有關，從而也提示了金釵石斛用于眼部給藥的可行性。藥動學結果還表明，石斛堿具有吸收快、消除快、整體生物利用度較低的特點，推測其原因可能與以下影響因素有關：(1)制劑因素：溫敏凝膠依靠溶蝕機制釋藥，但在頻繁眨眼的剪切作用和淚液的稀釋作用下，可能會升高其膠凝溫度并降低黏附性，從而導致角膜滯留時間縮短，達不到理想的緩釋作用；(2)生理因素：房水是眼的重要內容物之一，能夠維持眼內壓并始終處于動態(tài)循環(huán)中[19]，由此已吸收入眼的藥物可能在房水固有的壓力作用下沿房水循環(huán)途徑轉移至血液循環(huán)中，使得房水中剩余的藥物濃度降低；(3)藥物性質：石斛堿的體內穩(wěn)定性質尚不明確，有可能被房水中存在的酶所代謝，導致含量降低[20]，具體原因還有待進一步研究。藥動學研究結果為處方優(yōu)化、提高生物利用度、探索量效關系等深入研究奠定了重要基礎。

金釵石斛治療眼部疾病的歷史悠久、療效突出，且在貴州省資源豐富。本文對金釵石斛眼用制劑的研究不僅有利于提高金釵石斛的療效、提升其利用價值，也為金釵石斛類似產品的開發(fā)提供了參考依據(jù)，有助于提高地方經濟效益、推動中藥材產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。