復(fù)方菊花總黃酮大孔樹脂純化工藝研究*

周衡樸 任敏霞 吳素香 石森林

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 浙江 杭州 310053

復(fù)方菊花以臨床經(jīng)驗方為依據(jù)，由杭白菊和紅花等配伍組成，具有預(yù)防和治療視疲勞的作用[1，2]，黃酮是其中的主要有效組分。但復(fù)方提取物黃酮類成分含量低，服用劑量大，因此，需要對復(fù)方中的黃酮類成分進行富集純化。本文采用大孔吸附樹脂法對復(fù)方菊花總黃酮進行純化富集，并篩選出了最佳純化工藝，為復(fù)方菊花總黃酮的分離純化提供了實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：JA2003N電子天平（上海精密儀器有限公司）；XS105分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；UV-2450紫外可見分光光度計（日本SHIMADZU公司）；DZF6050型真空干燥箱（上海頓克儀器科技有限公司）；Avznti J-26 XP貝克曼離心機（貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；METTLER TOLEDO pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試劑：杭白菊、紅花（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，批號：190301，181201，經(jīng)鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花）；蘆丁（純度98.00%，成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-19010202）；HPD600，LSA-10（鄭州和成新材料科技有限公司）；磷酸、甲醇、乙腈為色譜純（美國TFDIA公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方菊花浸膏中總黃酮的含量測定：具體如下。

2.1.1 對照品溶液的配制：精確稱取蘆丁對照品1.18mg，置于10ml容量瓶中，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.118mg·ml-1的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取蘆丁對照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、3.0ml，分別置 10ml量瓶中，加10%氯化鋁溶液2ml，0.1mol·L-1醋酸鉀溶液3ml，加入70%乙醇至10ml，搖勻，放置15min。同法以對照品溶液吸取0ml配制成的10ml溶液作為空白，采用分光光度法在403nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度x（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程：y=0.0278x+0.0001，r=0.9997，表明蘆丁在5.90～35.40μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 總黃酮含量測定：取干浸膏約0.12g，精密稱定，置50ml量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取0.25ml（或直接精密量取洗脫液0.25ml），置于10ml容量瓶中，加入10%氯化鋁溶液2ml，0.1mol·L-1醋酸鉀溶液3ml，加入70%乙醇至10ml，搖勻，放置15min后在403nm波長處測定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

2.2 上樣液的制備：稱取處方藥材40%醇提取物配制成0.2g·ml-1生藥的上樣液。

2.3 靜態(tài)吸附試驗：稱取經(jīng)預(yù)處理后的6種大孔樹脂各4g，置100ml具塞錐形瓶中，加入上樣液20ml，置恒溫振蕩器中（100r·min-1，37℃）震蕩24h，過濾，分別測定上樣液及濾液中總黃酮的含量，計算吸附率和洗脫率。結(jié)果：HPD600、H1020、LSA-10、LS206四種大孔樹脂具有較好的洗脫能力和吸附能力。

2.4 動態(tài)吸附試驗：稱取 HPD600、H1020、LSA-10、LS206四種大孔樹脂各10g，濕法裝柱，以2BV·h-1速度上樣20ml，先用5BV超純水以2BV·h-1速度沖洗，再用5BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量，計算比吸附量、吸附率、比洗脫量、洗脫率。結(jié)果：LS206型大孔樹脂吸附和洗脫性能較好，可達(dá)99.30±0.02%、70.90±1.19%。

2.5 LS206型大孔樹脂的純化工藝考察：具體如下。

2.5.1 上樣量及上樣速度考察：將LS206樹脂濕法裝柱（徑高比1∶3），上樣液（總黃酮濃度為11.69mg·ml-1）分別以1BV·h-1、2BV·h-1、3BV·h-1各上樣120ml（約2BV），每份10ml收集流出液，測定總黃酮含量，并繪制泄漏曲線，見圖1。當(dāng)流出液中目標(biāo)產(chǎn)物的泄漏量達(dá)到上樣濃度的10%，視為吸附終點。由圖可知，當(dāng)上樣速度為1BV·h-1時，第12份流出液出現(xiàn)明顯的泄漏；當(dāng)上樣速度為2BV·h-1、3BV·h-1時，第9份流出液中總黃酮濃度超過上樣濃度的10%，出現(xiàn)明顯的泄漏?？紤]效率及時間成本，最終選擇上樣量為80ml（約1.3BV），上樣速度為2BV·h-1。

2.5.2 徑高比考察：將LS206樹脂以1∶3、1∶5、1∶7徑高比濕法裝柱，以2BV·h-1速度分別上樣80ml、133ml、187ml（約1.3BV）上樣液，分別用2BV超純水以2BV·h-1速度除雜，用3BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量，并進行真空干燥，計算總黃酮的浸膏得率、純度。結(jié)果顯示，徑高比為1∶3～1∶7時，總黃酮的轉(zhuǎn)移率均在80%以上，且徑高比為1∶5得到的總黃酮純度最高，可達(dá)(84.40±2.80)%。因此，選擇徑高比為1∶5。

2.5.3 除雜溶劑的選擇：將LS206樹脂以1∶5徑高比濕法裝柱，以 2BV·h-1速度上樣 133ml（約 1.3BV），以2BV·h-1速度分別用2BV的超純水、10%乙醇、0.1mol·L-1NaCl溶液、0.1mol·L-1HCl溶液、0.1mol·L-1NaOH溶液除雜，收集除雜流出液，測定總黃酮的含量，取50ml除雜流出液真空干燥并計算固化物的重量，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，用0.1mol·L-1NaCl溶液和0.1mol·L-1HCl溶液除雜時，總黃酮損失率最低，但NaCl溶液在工業(yè)生產(chǎn)中使用方便，環(huán)境友好，因此選擇0.1mol·L-1NaCl溶液作為除雜溶劑。

表1 不同除雜溶劑下固化物重及總黃酮損失率（±s，n=3）

表1 不同除雜溶劑下固化物重及總黃酮損失率（±s，n=3）

除雜固化物中雜質(zhì)含量（%）94.60±0.05 91.93±0.04 98.48±0.01 99.81±0.01 83.78±0.26除雜溶劑超純水10%乙醇0.1mol·L-1NaCl溶液0.1mol·L-1HCl溶液0.1mol·L-1NaOH溶液總固化物重（g）4.77±0.01 5.52±0.07 5.78±0.07 4.78±0.24 6.83±0.04總黃酮損失率（%）16.57±0.18 28.65±0.46 5.66±0.06 0.60±0.04 71.27±1.53

2.5.4 除雜溶劑用量考察：將LS206樹脂以1∶5徑高比濕法裝柱，以 2BV·h-1速度上樣 133ml（約 1.3BV），以0.1mol·L-1NaCl溶液為除雜溶劑，每份20ml收集流出液，真空干燥，稱重，測定總黃酮含量，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，0.1mol·L-1NaCl溶液用量達(dá)100ml后，固化物的增重趨緩，而固化物中總黃酮的含量大幅增加，因此選擇0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液除雜。

表2 除雜流出液固化物重量及固化物中總黃酮含量（±s，n=3）

表2 除雜流出液固化物重量及固化物中總黃酮含量（±s，n=3）

固化物中總黃酮含量（%）0.144±0.005 0.261±0.006 0.417±0.025 0.664±0.007 1.012±0.011 1.837±0.061 2.284±0.032 2.585±0.011 2.678±0.037 2.664±0.079序號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0固化物重量（g）1.253±0.008 1.231±0.013 1.054±0.006 0.610±0.030 0.357±0.031 0.254±0.006 0.197±0.007 0.184±0.004 0.174±0.004 0.159±0.004固化物中總黃酮總量（g）0.002±0.000 0.003±0.000 0.004±0.000 0.004±0.000 0.004±0.000 0.005±0.000 0.004±0.000 0.005±0.000 0.005±0.000 0.004±0.000

2.5.5 洗脫溶劑及用量考察：將LS206樹脂以1∶5徑高比濕法裝柱，以2BV·h-1速度上樣133ml（約1.3BV），用0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液以2BV·h-1速度除雜，分別用40%、60%、80%乙醇為洗脫溶劑以2BV·h-1速度洗脫，每20ml收集一份洗脫液，測定總黃酮的含量，真空干燥，測定浸膏純度，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，乙醇濃度越高，洗脫速度越快，但80%乙醇總黃酮的洗脫量比60%乙醇少，因此，選擇60%乙醇為洗脫溶劑。第1、2個流份中，雜質(zhì)含量過高，第14個流份中總黃酮含量很低，且前13個流份總黃酮含量約占上樣液的95%，因此選擇2.5BV 60%的乙醇洗脫。

表3 總黃酮洗脫量及純度（±s，n=3）

表3 總黃酮洗脫量及純度（±s，n=3）

流份 總黃酮洗脫量（mg） 浸膏中總黃酮純度（%）1 2 3 4 567 8 9 1 0 11 12 13 14 15 40%乙醇7.76±0.45 8.52±0.21 62.54±1.66 334.67±1.03 344.27±11.70 217.04±1.19 122.30±5.78 81.04±4.28 59.77±0.91 39.43±1.43 30.66±1.04 16.49±0.67 13.66±0.13 10.61±0.19 7.29±0.08 60%乙醇5.90±0.20 7.25±0.21 70.29±1.36 462.13±20.74 427.80±9.17 223.90±8.67 124.40±1.80 66.71±0.96 35.85±1.21 22.95±0.46 23.41±0.31 12.66±0.08 5.54±0.05 3.78±0.16 2.66±0.11 80%乙醇3.84±0.15 8.37±0.27 46.14±1.16 47.38±1.85 48.90±0.42 49.52±0.73 51.08±1.63 51.55±0.72 51.91±0.34 51.56±0.76 43.47±1.69 29.52±1.57 22.76±1.65 21.45±1.60 17.78±0.53 80%乙醇9.50±0.29 21.61±0.40 345.13±9.29 481.47±12.34 271.47±23.16 112.23±1.01 58.89±0.81 32.83±1.33 15.75±0.31 8.59±0.17 5.36±0.16 3.04±0.01 1.97±0.10 1.35±0.03 0.89±0.03 40%乙醇3.23±0.04 4.39±0.14 24.12±0.62 51.04±1.24 52.45±1.04 55.89±0.49 58.52±0.28 64.14±2.77 64.50±0.59 64.63±0.67 60.52±0.98 44.58±1.25 44.08±0.42 43.04±1.40 36.43±0.39 60%乙醇2.26±0.07 3.71±0.06 23.61±0.41 50.72±1.36 52.56±0.90 52.63±0.65 53.14±1.64 53.51±0.68 56.60±1.62 58.34±0.32 78.04±1.02 62.28±1.85 40.55±1.52 37.76±1.56 36.29±1.41

2.6 復(fù)方菊花中總黃酮的純化：將LS206樹脂以1∶5徑高比濕法裝柱，以2BV·h-1速度上樣1.3BV上樣液，用0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液以2BV·h-1速度除雜，用2.5BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脫。棄去前0.6BV洗脫液，收集后續(xù)洗脫液，回收乙醇，真空干燥得干浸膏，測定總黃酮的含量，計算轉(zhuǎn)移率和純度，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，大孔樹脂純化后總黃酮的純度達(dá)60%左右，純化過程的轉(zhuǎn)移率為80%左右，純化效果較好。

表4 LS206大孔樹脂純化復(fù)方菊花總黃酮（n=3）

3 分析與討論

本實驗采用靜態(tài)和動態(tài)吸附實驗，對六種大孔樹脂進行篩選，最終選擇了LS206型大孔樹脂。由于大孔樹脂對乙醇溶液的吸附能力較差，故上樣液需旋蒸至無醇味，但這會導(dǎo)致上樣液中有部分物質(zhì)沉淀下來，故需要離心取上清液作為上樣液。細(xì)小顆粒的大孔樹脂會使分離柱的流速變慢甚至液體不能流出，而將細(xì)小顆粒的大孔樹脂篩去，流速能調(diào)整到2BV·h-1。另外，再生后的大孔樹脂保存在純化水中易發(fā)霉，故需及時更換純化水。上樣液pH4～5時，LS206大孔樹脂對總黃酮的吸附能力和洗脫能力較強，而提取液本身pH在4～5之間，故不需要調(diào)節(jié)提取液的pH。純化過程中，目前普遍采用純水或低濃度乙醇進行除雜，本實驗考察了不同的除雜溶劑，發(fā)現(xiàn)用NaCl溶液除雜時，總黃酮損失率比用純水和低濃度乙醇除雜時更低，具有一定的創(chuàng)新性?？疾炝朔侄问占南疵撘?，發(fā)現(xiàn)前0.6BV洗脫液中雜質(zhì)含量過多，導(dǎo)致洗脫液整體純度較低。棄去前0.6BV的洗脫液，有效提高了總黃酮純度。