趙海茵 駱紅飛 王華剛 吳美蘭
1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005
2 浙江景岳堂藥業(yè)有限公司 浙江 紹興 312025
芪冬活血飲由黃芪、麥冬、虎杖及當(dāng)歸四味中藥組成,其復(fù)方符合清熱解毒、祛瘀通腑、益氣養(yǎng)陰的治療原則。通過(guò)長(zhǎng)期臨床研究與實(shí)踐,證實(shí)其對(duì)急性肺損傷患者有良好的治療效果[1,2]。目前芪冬活血飲主要以中藥湯劑的形式用于臨床治療,其煎煮過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且口服劑量大,久置易發(fā)霉變質(zhì),攜帶與儲(chǔ)存不便,很難適應(yīng)現(xiàn)代化生活的需要。研究表明,將中藥材經(jīng)過(guò)提取、濃縮、干燥、制粒包裝制成顆粒劑,可以極大地提高中藥的安全、方便和有效性。同時(shí)建立以湯劑為基準(zhǔn)的指紋圖譜,可以很好地保證顆粒劑與湯劑質(zhì)量的一致性[3-6]。本課題收集黃芪、麥冬、虎杖及當(dāng)歸飲片各10批,制成芪冬活血飲中藥湯劑進(jìn)行指紋圖譜研究,為芪冬活血飲顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
1.1 儀器:賽默飛vanquish UPLC(HPG-3400);電子天平[BT-125D,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];煎藥壺30B2(康雅順電器有限公司)。
1.2 對(duì)照品:虎杖苷對(duì)照品(批號(hào):111575-201603,純度87.3%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào):111920-201907,純度96.8%)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201614,純度99.0%),對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。
1.3 試劑:甲醇、乙腈為色譜純,水為純凈水,其他試劑均為分析純。
1.4 飲片:?jiǎn)挝讹嬈魇占?0批,飲片信息見(jiàn)表1。飲片均由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供。
表1 飲片信息表
2.1 芪冬活血飲中藥湯劑的制備:依照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)文),取黃芪、虎杖各20g,當(dāng)歸、麥冬各12g,第一次加水576ml,浸泡30分鐘,煎煮30分鐘,過(guò)濾藥液;第二次加水448ml,煎煮20分鐘,過(guò)濾藥液。合并兩次濾液,作為中藥湯劑樣品,共制成10批中藥湯劑樣品,制備信息見(jiàn)表2。
表2 中藥湯劑制備信息表
2.2 指紋圖譜方法:分述如下。
2.2.1 色譜條件:色譜柱:Shim-pack GIST-HP C18-AQ(2.1mm×100mm,1.9μm);乙腈為流動(dòng)相A,0.1%甲酸為流動(dòng)相B,按以下梯度進(jìn)行洗脫,具體見(jiàn)表3。檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,流速0.2ml/min,柱溫30℃。
表3 色譜條件
2.2.2 對(duì)照品溶液制備:取虎杖苷對(duì)照品適量,加甲醇制成15μg/ml的溶液;取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量,加甲醇制成50μg/ml的溶液;取阿魏酸對(duì)照品適量,加甲醇制成12μg/ml的溶液,作為對(duì)照品溶液。
2.2.3 供試品溶液制備:取中藥湯劑樣品,過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
2.3 方法學(xué)考察:取ZYTJ-001樣品進(jìn)行特征圖譜方法學(xué)考察,分述如下。
2.3.1 專(zhuān)屬性:精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各1μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。色譜圖見(jiàn)圖1。供試品溶液中共分離出9個(gè)特征峰,通過(guò)對(duì)照品比對(duì),其中3個(gè)峰分別與阿魏酸、虎杖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰,計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 指紋圖譜結(jié)果表
2.3.2 精密度:精密吸取供試品溶液1μl,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰,計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<2%,表明儀器精密度良好。
2.3.3 溶液穩(wěn)定性:取供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12小時(shí)進(jìn)樣,記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰,計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果RSD<2%,表明供試品溶液12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.4 重復(fù)性:依照“2.2.3”項(xiàng)下供試品處理方法制備6份供試品溶液,精密吸取1μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰,計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果RSD<2%,表明此方法重復(fù)性良好。
依法處理10批中藥湯劑樣品,記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0版,以10批中藥湯劑樣品的超高效液相色譜(UPLC)圖進(jìn)行自動(dòng)匹配,建立對(duì)照品指紋圖譜,結(jié)果見(jiàn)圖2。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。從相似度結(jié)果可知,不同批次間芪冬活血飲中藥湯劑的指紋圖譜相似度均大于0.90%,相似度較高。
表5 指紋圖譜相似度結(jié)果
取ZYTJ-001中藥湯劑對(duì)應(yīng)的當(dāng)歸、虎杖和黃芪飲片,依照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)文)煎煮,制成中藥湯劑樣品,同法進(jìn)樣,記錄色譜圖,與ZYTJ-001中藥湯劑樣品進(jìn)行比較,確認(rèn)色譜峰歸屬。詳見(jiàn)圖3。經(jīng)色譜圖比對(duì),峰1和峰2屬于當(dāng)歸與黃芪,峰3、峰5和峰9屬于黃芪,峰4和峰7屬于當(dāng)歸,峰6和峰8屬于虎杖。
通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸)的比較,選擇乙腈-0.1%甲酸按梯度進(jìn)行洗脫,分離效果最佳。在柱溫25℃、30℃、35℃條件下洗脫,35℃條件下峰1與峰2分離效果較差,柱溫25℃條件下虎杖苷峰峰形較差,30℃條件下各峰的分離效果優(yōu)于其他柱溫。流速0.2ml/min條件色譜峰分離效果明顯優(yōu)于流速0.3ml/min與0.4ml/min。通過(guò)3D光譜圖分析,在254nm波長(zhǎng)下能較好的分離出更多的色譜峰。
建立合適的指紋圖譜可以較好地體現(xiàn)中藥湯劑的總體質(zhì)量及有效成分的傳遞關(guān)系,為中藥湯劑的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。該方法通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證,證明方法可行,并對(duì)10批樣品相似度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
該方法對(duì)芪冬活血飲湯劑中當(dāng)歸、虎杖和黃芪進(jìn)行了色譜峰歸屬。麥冬中有效成分有甾體皂苷、高異黃酮及多糖等[7],在此色譜圖中未得到體現(xiàn),還需采取其他方法進(jìn)行研究。