超聲輔助分子印跡固相萃取-HPLC-熒光法測(cè)定豬血丸子中苯并（a）芘

◎ 王亮亮，邱 宇，向 俊，荊輝華，王 凱，言 劍，黃 斌

(1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410000；2.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410000）

豬血丸子也稱“寶慶豬血丸子”“血粑”“豆腐丸子”等，在湘菜標(biāo)準(zhǔn)中稱之為“黑珍珠”[1-2]。是湖南邵陽有名的小吃，是邵陽的傳統(tǒng)特色食物之一，它有著長達(dá)千年的文化歷史，蘊(yùn)含了別具一格的工藝傳統(tǒng)。豬血丸子主要以豆腐為主，配上豬血、豬肉以及其他輔料，經(jīng)熏燒烤制成，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛。其制作工藝為：大豆→清洗→浸泡→磨漿→濾漿→煮漿→點(diǎn)漿→養(yǎng)腦→破腦澆制→壓榨成型→研磨揉散→加入切碎的豬血、豬肉→攪拌→成型（呈橢圓，厚度約10 cm）→熏烤→高壓殺菌→真空包裝→質(zhì)檢→成品[1]。豬血丸子一般采用熏烤工藝，熏烤時(shí)間越長，風(fēng)味越濃厚，但是在熏烤過程中容易產(chǎn)生苯并（a）芘等有害物質(zhì)。

苯并（a）芘（Benzo(a)pyrene，BaP），分子式為C20H12，屬多環(huán)芳烴，是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)和高活性的突變?cè)?，其毒性?qiáng)于黃曲霉毒素，長期接觸可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變和DNA受損[3]。目前BaP的主要提取凈化方法為有機(jī)溶劑分散液-液微萃取（Dispersive Liquid-Liquid Microextraction，DLLME）、有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料固相微萃（Solid-Phase Microextraction，SPME）、中性氧化鋁柱萃?。∟eutral alumina column extraction，NACE），檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）、液相色譜-熒光法（Liquid Chromatography Fluorescence Method，LC-RF）及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS/MS）。但現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27—2016檢測(cè)范圍并不包括豬血丸子，且因?yàn)樨i血丸子的分類不清晰，在GB 2762—2017中無明確的BaP限量要求，造成豬血丸子的監(jiān)管漏洞，無法達(dá)到食品安全監(jiān)管的目的，存在食品安全隱患。考慮到分子印跡技術(shù)是利用分子印跡聚合物，通過模擬酶-抗體-抗原的相互作用，對(duì)印跡分子有專一識(shí)別的特點(diǎn)[4]，特異性強(qiáng)，操作簡單，因此試驗(yàn)通過優(yōu)化豬血丸子中BaP的前處理及分子印跡固相萃取（Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，MISPE）凈化方法，開展對(duì)豬血丸子中BaP的LC-RF定性定量分析研究，尋求一種快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測(cè)方法，為豬血丸子的品質(zhì)控制及安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：BaP（10 mg，純度：99.0%，CAS：50-32-8，編號(hào)：G147406），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH Germany；色譜柱Thermo Scientific Hypersil Green PAH，賽默飛；中性氧化鋁柱，迪馬科技；分子印跡固相萃取柱Cleanert Bap-3 500 mg/6 mL cartridge，博納艾杰爾（Agela Technologies）科技；乙腈（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技；試驗(yàn)用水為超純水。

豬血丸子樣品，均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀，配RF-M20熒光檢測(cè)器，日本島津公司；BK-900C數(shù)控超聲波清洗器，濟(jì)寧豐鑫超聲設(shè)備有限公司；TG16-WS 高速離心機(jī)，長沙市湘儀儀器有限公司；TTL-10A實(shí)驗(yàn)室專用超純水系統(tǒng)，北京國泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；MV-5全自動(dòng)多樣品快速濃縮儀，萊伯泰科；電子天平，賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱?。ň_至0.000 1 g）苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.02 mg，用甲苯溶解定容至10.0 mL，得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液102 μg·mL-1。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液0.1 mL，用乙腈溶解定容至10.0 mL，得1.02 μg·mL-1中間液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。再準(zhǔn)確移取1.02 μg·mL-1中間液1.0 mL，用乙腈稀釋定容至10.0 mL，得102 ng·mL-1中間液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。最后分別取0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL的102 ng·mL-1中間液用乙腈稀釋定容至10.0 mL，得 0.51 ng·mL-1、1.02 ng·mL-1、5.10 ng·mL-1、10.20 ng·mL-1、20.40 ng·mL-1工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Scientific Hypersil Green PAH柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈∶水=88∶12；流速1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

1.3.3 樣品前處理方法

（1）BaP的提取。準(zhǔn)確稱取粉碎好的樣品1 g左右于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，超聲提取，離心后，轉(zhuǎn)移上清液，再加入5 mL正己烷重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。

（2）BaP的凈化。分子印跡固相萃取柱活化：依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化。上樣：將合并的上清液用吸管轉(zhuǎn)移至小柱中，并用少量正己烷淋洗離心管，將淋洗液一并轉(zhuǎn)移至小柱中。淋洗：待樣液降至柱床時(shí)，用5 mL正己烷淋洗柱子。洗脫：用5 mL二氯甲烷洗脫并收集凈化液于10.0 mL塑料離心管中。濃縮：將凈化液于全自動(dòng)多樣品快速濃縮儀中氮吹至干，水浴溫度為40 ℃。定容：吸取1 mL乙腈復(fù)溶，渦旋均勻，上機(jī)測(cè)定。

1.3.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)HPLC-RF系統(tǒng)分析，以標(biāo)樣質(zhì)量濃度為X軸，目標(biāo)物的峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)信噪比（S/N）=3，計(jì)算方法檢出限（LOD），信噪比（S/N）=10，計(jì)算方法定量限（LOQ）。

1.3.5 加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取1份樣品作為空白，進(jìn)行加標(biāo)驗(yàn)證試驗(yàn)，并分別稱取該樣品2份，一份作為本底值檢測(cè)，另一份作為加標(biāo)回收，加入適量標(biāo)準(zhǔn)液，添加0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。同時(shí)為考察方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性，進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)，于不同時(shí)間分別測(cè)定不同加標(biāo)濃度為的豬血丸子樣品，每次進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用與LC-20AT儀器配套R(shí)F-20A（熒光檢測(cè)器）進(jìn)行樣品分析，軟件LabSolution-LCSolution進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。采用Excel進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值表示，用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用T檢驗(yàn)比較，P＜0.05視為有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取方式及時(shí)間的選擇

考察了超聲、振蕩不同提取方式及在2 min、5 min、10 min、20 min和30 min不同提取時(shí)間對(duì)豬血丸子中BaP提取效率的影響，如圖1。結(jié)果顯示，超聲和振蕩提取效率基本一致，提取效果在10 min內(nèi)隨時(shí)間的增加而升高，時(shí)間為10.0 min，提取效率最佳，10.0 min后，提取效率趨于平穩(wěn)。考慮到樣品批量處理的便捷性，以及試驗(yàn)過程中若振蕩方式不合理或者振蕩速度過大造成樣品提取液溢出等因素，試驗(yàn)采用超聲提取。試驗(yàn)同時(shí)比較了超聲提取次數(shù)對(duì)0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13 個(gè)不同質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品BaP提取效率的影響，如圖2。結(jié)果表明，提取2次的檢測(cè)值及回收率基本與提取1次的保持一致，經(jīng)方差分析T檢驗(yàn)，提取次數(shù)之間無差異顯著性（P＞0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，視為提取次數(shù)對(duì)提取效率影響小。綜上，試驗(yàn)最佳提取方式為超聲提取，提取時(shí)間為10.0 min，提取次數(shù)1次即可。

圖1 提取方式及時(shí)間的選擇圖（n=3）

圖2 提取次數(shù)的選擇圖（n=3）

2.1.2 固相萃取條件優(yōu)化

（1）不同固相萃取柱比較。試驗(yàn)比較了親水親脂固相萃取柱（Waters Oasis，HLB，60 mg/3 mL）、中性氧化鋁柱（Cleanert Alumina N，AL，100 mg/3 mL）、BaP分子印跡柱（Cleanert BAP-3，MISPE，500 mg/6 mL）在 0.51 μg·kg-1、5.10 μg·kg-1、10.20 μg·kg-13 個(gè)不同濃度水平下萃取柱的提取效率，以加標(biāo)回收率表示，如圖3。

圖3 固相萃取柱的選擇圖（n=3）

結(jié)果顯示，各固相萃取柱表現(xiàn)基本穩(wěn)定，MISPE提取效率高于其他2種，HLB相對(duì)較差。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用中性氧化鋁柱時(shí)，試劑消耗量大，而分子印跡柱試劑消耗小，操作更加簡便。因此試驗(yàn)采用分子印跡柱進(jìn)行凈化處理。

（2）淋洗液比較。分子印跡柱具有專一識(shí)別的特點(diǎn)，但在富集BaP目標(biāo)物的時(shí)候也可能存在非特異性吸附，為提高分析印跡填料結(jié)合位點(diǎn)和BaP分子之間的選擇性作用，試驗(yàn)優(yōu)化淋洗液的條件，考察了甲醇、乙腈、正己烷3種常見的淋洗液對(duì)質(zhì)量濃度為10.20 μg·kg-1的加標(biāo)樣品BaP提取效率的影響。結(jié)果顯示，正己烷的淋洗效果最好，回收率為94.6%，保留分子印跡對(duì)BaP的吸附能力，且能有效去除油脂等雜質(zhì)，甲醇和乙腈選擇性不佳，回收率分別為82.2%、86.9%，可能是淋洗液洗脫強(qiáng)度太強(qiáng)，造成了一定量目標(biāo)分析物的損失，故試驗(yàn)選擇正己烷為最佳淋洗液[5]。

（3）洗脫液比較。洗脫液是為了解除目標(biāo)物BaP和分子印跡填料結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用，從而獲取高富集因子（EFs）[6]。EFs表示在樣品萃取前后，洗脫液中目標(biāo)物的濃度（Cexp）與初始樣品中目標(biāo)物的濃度（C0）的比值，即EFs=Cexp/C0[7]。試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷3種常見的洗脫液對(duì)質(zhì)量濃度為10.20 μg·kg-1的加標(biāo)樣品BaP的提取效率的影響。結(jié)果顯示，甲醇、乙腈的洗脫效果不佳，回收率僅為80%左右，二氯甲烷效果最好，回收率為98.5%，可能是二氯甲烷與BaP有較好的相似相溶性，選擇性強(qiáng)，且分子印跡柱在該萃取條件下，BaP的富集因子（EFs）為20，表明優(yōu)化后的萃取方法有良好的濃縮效果，故試驗(yàn)選擇二氯甲烷為最佳洗脫液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

為使目標(biāo)分析物有更好的分離度，試驗(yàn)考察了95%、88%、85%和80%不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈溶液對(duì)樣品的分離效果。結(jié)果表明，流動(dòng)相的乙腈水比例為88∶12效果最好，目標(biāo)物與干擾物的分離度好，出峰時(shí)間在11 min左右。

2.2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了TC-C18柱、Scientific Hypersil Green PAH柱對(duì)BaP色譜圖出峰的影響情況。結(jié)果顯示，Scientific Hypersil Green PAH對(duì)BaP具有較好的保留，其高碳載量的特殊定制烷基鍵合硅，適合用于分析BaP等分子極性小得多環(huán)芳烴類物質(zhì)，得到的色譜圖基線噪音小、峰形對(duì)稱、寬度較窄及不拖尾。

根據(jù)2.1和2.2優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和色譜條件，對(duì)BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.40 ng·mL-1）和豬血丸子實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，得到圖4的色譜圖，故試驗(yàn)采用PAH柱。

圖4 BaP色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

對(duì)MISPE結(jié)合LC-RF方法的線性、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）進(jìn)行研究，結(jié)果見表1。結(jié)果表明BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液在 5 個(gè)濃度水平 0.51 ng·mL-1、1.02 ng·mL-1、5.10 ng·mL-1、10.20 ng·mL-1、20.40 ng·mL-1的峰面積和質(zhì)量濃度的回歸方程線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 66，BaP 的LOD和LOQ分別是 0.2 μg·kg-1和 0.5 μg·kg-1。

表1 方法的線性方程、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）表

2.3.2 精密度和回收率

按照上述優(yōu)化后的前處理方法及色譜條件進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行，結(jié)果如表2所示，3個(gè)濃度水平下BaP的日內(nèi)精密度RSD為2.7%～3.6%，日間精密度RSD為3.9%～4.4%，表明方法的精密度和重復(fù)性良好。通過樣品加標(biāo)，BaP的方法回收率在97.3%～102.8%，回收率較高，RSD為3.1%～4.6%。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F.4要求，添加水平小于100 μg·kg-1時(shí)，加標(biāo)回收率范圍應(yīng)在60%～120%，其精密度應(yīng)＜15%，試驗(yàn)表明，該方法的加標(biāo)回收、日內(nèi)和日間精密度符合要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 方法的精密度及回收率表（n=6）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

由表3知，采用試驗(yàn)開發(fā)的MISPE結(jié)合HPLC-RF方法對(duì)市售的20批次豬血丸子中BaP進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，市售豬血丸子的BaP檢出率為80.0%，1批次高達(dá)17.7 μg·kg-1。以《豬血丸子》（DB 43/346—2007）的限量要求≤ 5.0 μg·kg-1為判定依據(jù)，豬血丸子樣品問題檢出率為30.0%。圖4為空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)工作液（20.40 ng·mL-1）及樣品色譜圖，標(biāo)準(zhǔn)圖譜和樣品圖的相對(duì)保留時(shí)間保持一致，符合定性要求。

表3 豬血丸子實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表（n=3）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了MISPE結(jié)合HPLC-RF檢測(cè)豬血丸子中BaP的方法，對(duì)樣品的提取條件及MISPE凈化條件進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到顯著的富集及凈化效果，同時(shí)優(yōu)化了色譜條件，得到較高的檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明BaP在0.51～20.40 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 66，加標(biāo)回收率在97.3%～102.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均小于5%，方法定量限（S/N=10）為0.5 μg·kg-1。通過實(shí)際樣品檢測(cè)，豬血丸子中BaP檢出率達(dá)80.0%，樣品問題檢出率為30.0%，最高檢測(cè)值高達(dá)17.7 μg·kg-1。綜上所述，方法操作簡單，靈敏度高，精密度好，試劑消耗小，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于豬血丸子中BaP的日常檢測(cè)分析，相關(guān)數(shù)據(jù)可為行政監(jiān)管部門提供依據(jù)及參考，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。