鎘脅迫下苧麻水培苗生理生化變化特征

牟攀，陳坤梅，朱愛(ài)國(guó)，陳平，高鋼，王曉飛，馮新康，劉寧，邵德義，喻春明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

重金屬鎘（Cd）是植物生長(zhǎng)的非必需元素，是生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一。土壤中Cd通過(guò)地上部植物經(jīng)食物鏈不斷地在人體內(nèi)富集，易引起慢性中毒，對(duì)人體健康造成危害［1］。土壤中重金屬Cd的主要來(lái)源為礦物自然風(fēng)化和人類工業(yè)活動(dòng)，工業(yè)采礦冶金在生產(chǎn)中將含Cd污水排入土壤造成重金屬污染，不正當(dāng)?shù)厥褂昧追屎臀⒘吭胤柿弦矔?huì)造成農(nóng)田Cd污染［2］。Cd以水溶態(tài)、交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)、殘留態(tài)等形式存在于土壤中［3］。土壤改良劑、淋洗劑洗脫法、生物修復(fù)技術(shù)等方法先后應(yīng)用于重金屬鎘污染的修復(fù)研究中［4-5］。隨著綠色可持續(xù)發(fā)展觀的提出，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注土壤重金屬污染的生物修復(fù)技術(shù)。

苧麻（Boehmeria nivea L.）生物量較Cd超富集植物大，且為多年生植物，對(duì)重金屬有較強(qiáng)的忍耐力和吸收能力，在植物修復(fù)Cd污染土壤的應(yīng)用中有很大發(fā)展?jié)摿Γ?］。但在對(duì)Cd污染的研究中發(fā)現(xiàn)，苧麻對(duì)Cd的敏感度以及忍耐閾值存在較大分歧［7］。另外苧麻品種間的差異對(duì)根系吸收的重金屬在植株中的分配產(chǎn)生影響，Cd在苧麻各器官中的積累也存在差異［8］。因此明確Cd耐性強(qiáng)且對(duì)Cd有較強(qiáng)富集能力的苧麻品種至關(guān)重要。本試驗(yàn)選用不同苧麻品種中苧1號(hào)、中苧3號(hào)以及中苧4號(hào)，探究其在不同Cd濃度梯度下的響應(yīng)特征，明確3個(gè)品種耐Cd性差異，旨在為苧麻應(yīng)用于重金屬修復(fù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的中苧1號(hào)、中苧3號(hào)［9］、中苧4號(hào)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所選育的苧麻品種，其中，中苧1號(hào)是湖南地區(qū)主栽品種，中苧3號(hào)、中苧4號(hào)是近年來(lái)選育而成的品種。試驗(yàn)所用材料取自國(guó)家種質(zhì)長(zhǎng)沙苧麻圃，選取同一時(shí)期長(zhǎng)勢(shì)一致的嫩梢進(jìn)行水培扦插。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苧麻嫩梢水培扦插與鎘脅迫處理

扦插苗制備參考李玉蘭［10］的方法：試驗(yàn)前先去除所選種質(zhì)苧麻苗主莖，待側(cè)枝長(zhǎng)到10～15 cm后選取生長(zhǎng)旺盛且長(zhǎng)勢(shì)一致的嫩梢苧麻苗，使用刀片削除末端，使每株長(zhǎng)大約為10 cm，剔除老葉，保留頂端2～3片展開(kāi)葉，浸入500倍百菌靈消毒液中消毒30 s。處理好的側(cè)枝扦插于裝有自來(lái)水的卡蓮（Karen）水培儀中培養(yǎng)，每盆裝12 L水，每盆15株。扦插苗培養(yǎng)15 d后去除長(zhǎng)勢(shì)不好的幼苗，留10株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗在盆中。加入 CdCl2溶液，使鎘濃度分別為0、10、30、80、150 mg／L。繼續(xù)培養(yǎng)，記錄苧麻生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 葉片SPAD值測(cè)定

鎘處理15 d后采用SPAD-502型葉綠素儀測(cè)定葉片SPAD值，取底端最后一片葉遠(yuǎn)離葉脈兩端5～7個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)鎘濃度處理下測(cè)3株，取平均值。

1.2.3 光合參數(shù)測(cè)定

鎘處理10 d后采用CI-340便攜式光合儀［11］測(cè)定葉片光合特征，統(tǒng)一選擇植株底端最后一片葉測(cè)定光合參數(shù)，每個(gè)處理測(cè)3株，取平均值。測(cè)定時(shí)選擇手動(dòng)測(cè)量，利用外界光源進(jìn)行測(cè)定，光照強(qiáng)度在 400～800μmol／m2／s。

1.2.4 酶活力測(cè)定

鎘處理10 d后取葉片頂端向下第三片新鮮葉片，裝入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）。3種酶活測(cè)定時(shí)均統(tǒng)一取研磨成粉末狀的0.2 g新鮮葉片進(jìn)行測(cè)定，不同品種以及不同鎘濃度處理葉片均設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。酶活采用南京建成生物公司試劑盒測(cè)定。

1.2.5 苧麻生物量測(cè)定

鎘處理25 d后收獲苧麻整株，先用去離子水浸泡根部15 min，去除附著在根系表面的Cd2+以及各種雜物，然后將根、莖、葉分裝于袋中置于烘箱，105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重，稱干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖使用Excel 2019，采用IBM SPSS statistics 25進(jìn)行單因素方差分析（one-way，ANOVA）。p＜0.05為顯著水平。使用SPSS完成主成分分析，并利用隸屬函數(shù)值對(duì)3個(gè)苧麻品種的耐鎘性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［12-13］，計(jì)算公式如下：

式中：Xj表示第j個(gè)公因子的得分值；Xmin為第j個(gè)因子得分的最小值；Xmax為第j個(gè)因子得分的最大值。

式中：Wj表示第j個(gè)公因子在所有公因子中的重要程度；Pj為各品種第j個(gè)公因子的貢獻(xiàn)率。

式中：Di表示苧麻在鎘處理?xiàng)l件下用綜合指標(biāo)所得的耐鎘綜合評(píng)價(jià)值；k為樣本個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘脅迫下苧麻生物量變化特征

由表1可知，中苧1號(hào)、中苧3號(hào)以及中苧4號(hào)各個(gè)鎘濃度處理組鮮重和干重均顯著低于對(duì)照。苧麻生物量總體變化趨勢(shì)為隨著鎘濃度的增加而逐漸降低。隨著鎘濃度的增加，不同品種苧麻受到影響程度不同，具體表現(xiàn)為生物量的下降程度不同：與對(duì)照相比，10 mg／L鎘處理，中苧1號(hào)鮮重下降了13.58%，中苧3號(hào)鮮重下降了58.53%，中苧4號(hào)鮮重下降了39.70%。隨著鎘濃度的增加，苧麻生物量下降程度表現(xiàn)為中苧3號(hào)＞中苧4號(hào)＞中苧1號(hào)。

表1 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻生物量的影響Table 1 Effect of different cadmium concentration treatments on the biomass of ramie

2.2 不同鎘濃度脅迫下葉片SPAD值變化特征

由圖1可知，苧麻葉片SPAD值隨著鎘濃度的增加先升高后降低，與對(duì)照相比，低鎘濃度（10 mg／L）顯著促進(jìn)中苧1號(hào)葉片葉綠素的合成，而80 mg／L鎘濃度處理顯著增加中苧3號(hào)葉片SPAD值。不同鎘濃度處理下，中苧4號(hào)葉片SPAD值差異不顯著。低濃度鎘處理可以顯著提高葉片葉綠素含量，高濃度鎘處理對(duì)苧麻葉片SPAD值的抑制作用并不明顯。與中苧1號(hào)相比，中苧3號(hào)以及中苧4號(hào)葉片的SPAD值分別下降了7.54%和2.04%。

圖1 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻葉片SPAD值的影響Fig.1 Effect of different cadmium concentrations on SPAD values of ramie leaves

2.3 不同鎘濃度脅迫下葉片光合特征

2.3.1 凈光合速率

由圖2可知，與對(duì)照相比，不同鎘濃度處理對(duì)中苧1號(hào)和中苧4號(hào)葉片凈光合速率并無(wú)顯著性影響，對(duì)中苧3號(hào)影響較大，隨著鎘濃度的增加中苧3號(hào)葉片凈光合速率顯著降低，與對(duì)照相比，10、30、80、150 mg／L鎘濃度處理葉片凈光合速率分別下降了 38.76%、44.50%、76.08%、75.12%。中苧4號(hào)和中苧1號(hào)葉片凈光合速率隨著鎘濃度的增加先增加后降低，可以看出低濃度鎘處理對(duì)葉片凈光合速率有一定的促進(jìn)作用。與中苧1號(hào)相比，中苧3號(hào)葉片凈光合速率更強(qiáng)，而中苧4號(hào)葉片凈光合速率低于中苧1號(hào)。

2.3.2 蒸騰速率

由圖3可知，低濃度鎘處理（30 mg／L、10 mg／L）分別對(duì)中苧1號(hào)和中苧3號(hào)葉片蒸騰速率有明顯促進(jìn)作用，30 mg／L鎘處理顯著促進(jìn)中苧1號(hào)葉片蒸騰速率。中苧4號(hào)葉片蒸騰速率隨著鎘濃度的增加而降低，但其下降程度并不顯著，3個(gè)苧麻品種蒸騰速率均值為中苧4號(hào)＞中苧3號(hào)＞中苧1號(hào)。

圖3 不同鎘處理對(duì)苧麻葉片蒸騰速的影響Fig.3 Effect of different cadmium treatments on transpiration rate of ramie leaves

2.3.3 葉片胞間二氧化碳濃度

由圖4可知，隨著鎘濃度的增加，中苧1號(hào)葉片胞間二氧化碳濃度有所增加，0、10、30 mg／L鎘處理葉片胞間二氧化碳濃度顯著（p＜0.05）高于對(duì)照。中苧3號(hào)葉片胞間二氧化碳濃度隨著鎘濃度的增加而增加，其中150 mg／L鎘處理顯著（p＜0.05）高于對(duì)照，其余處理均高于對(duì)照但未達(dá)到顯著水平。中苧4號(hào)葉片胞間二氧化碳濃度總體變化趨勢(shì)是隨著鎘濃度的增加而降低。3個(gè)苧麻品種胞間二氧化碳濃度均值為中苧1號(hào)＞中苧4號(hào)＞中苧3號(hào)。

圖4 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻葉片胞間二氧化碳濃度的影響Fig.4 Effect of different cadmium concentration treatments on the intercellular carbon dioxide concentration of ramie leaves

2.3.4 葉片氣孔導(dǎo)度

由圖5可知，中苧1號(hào)和中苧4號(hào)苧麻葉片氣孔導(dǎo)度隨著鎘濃度的增加而先增加后降低，中苧3號(hào)葉片氣孔導(dǎo)度隨著鎘濃度的增加而逐漸降低。其中，低濃度鎘處理（10、30 mg／L）中苧1號(hào)和中苧4號(hào)葉片氣孔導(dǎo)度高于對(duì)照但未達(dá)到顯著水平，而中苧1號(hào)葉片在80、150mg／L鎘處理下，其氣孔導(dǎo)度均顯著（p＜0.05）低于對(duì)照。10、30、80、150 mg／L鎘處理顯著（p＜0.05）降低了中苧 3號(hào)葉片氣孔的開(kāi)放程度，說(shuō)明鎘處理抑制了中苧3號(hào)葉片氣孔的開(kāi)放。葉片氣孔導(dǎo)度均值為中苧4號(hào)＞中苧3號(hào)＞中苧1號(hào)。

圖5 不同鎘濃度對(duì)苧麻葉片氣孔導(dǎo)度的影響Fig.5 Effect of different cadmium concentrations on stomatal conductance of ramie leaves

2.4 不同鎘濃度脅迫下葉片抗氧化酶差異

2.4.1 葉片SOD

由圖6可知，3種苧麻葉片SOD活力隨著鎘濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。不同鎘濃度處理下，中苧3號(hào)和中苧4號(hào)葉片SOD活力均顯著（p＜0.01）高于對(duì)照。中苧1號(hào)中只有150 mg／L鎘處理下SOD活力顯著（p＜0.01）高于對(duì)照，其余各處理與對(duì)照相比均不顯著。與對(duì)照相比，3個(gè)苧麻品種中中苧1號(hào)SOD活力最高，其次是中苧3號(hào)，最后是中苧4號(hào)。

圖6 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻葉片SOD活力的影響Fig.6 Effect of different cadmium concentration treatments on the SOD activity of ramie leaves

2.4.2 葉片POD

由圖7可知，中苧1號(hào)葉片POD活力隨著鎘濃度的增加而增加，各處理均顯著（p＜0.05）高于對(duì)照。低濃度鎘處理（10 mg／L）促進(jìn)中苧3號(hào)葉片POD活力但未達(dá)到顯著水平，在中苧3號(hào)中150、80 mg／L鎘濃度處理的葉片POD活力顯著（p＜0.05）低于對(duì)照。中苧4號(hào)葉片POD活力總體變化趨勢(shì)為先降低后增加：10、30 mg／L鎘濃度處理顯著（p＜0.05）低于對(duì)照，而80 mg／L鎘處理葉片POD活力顯著（p＜0.05）高于對(duì)照。3個(gè)苧麻品種POD活力均值中苧1號(hào)＞中苧4號(hào)＞中苧3號(hào)。

圖7 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻葉片POD活力的影響Fig.7 Effect of different cadmium concentration treatments on POD activity of ramie leaves

2.4.3 葉片CAT

由圖8可知，中苧1號(hào)葉片CAT活力隨著鎘濃度的增加而增加，其中低鎘濃度處理（10、30 mg／L）與對(duì)照相比差異并不顯著，而80、150mg／L鎘處理的葉片CAT活力均顯著（p＜0.01）高于對(duì)照。中苧3號(hào)和中苧4號(hào)葉片CAT活力總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，150 mg／L鎘處理葉片CAT活力均顯著（p＜0.05）低于對(duì)照。中苧4號(hào)葉片CAT活力隨著鎘濃度的改變變化較大，10、30、80 mg／L鎘處理葉片CAT活力顯著（p＜0.05）高于對(duì)照，而150 mg／L鎘處理葉片CAT活力顯著（p＜0.05）低于對(duì)照。3個(gè)苧麻葉片CAT活力均值為中苧1號(hào)＞中苧3號(hào)＞中苧4號(hào)，與中苧1號(hào)相比，中苧3號(hào)以及中苧4號(hào)在鎘脅迫條件下葉片CAT活力變化更為敏感。

圖8 不同鎘濃度處理對(duì)苧麻葉片CAT酶活力的影響Fig.8 Effect of different cadmium concentration treatments on CAT enzyme activity of ramie leaves

2.5 隸屬函數(shù)比較3個(gè)品種耐鎘性能

各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鎘系數(shù)α值用公式1進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表2所示，可以看出苧麻經(jīng)鎘處理后單項(xiàng)指標(biāo)的變化幅度不同，中苧1號(hào)的單項(xiàng)指標(biāo)凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、POD、干重、鮮重較對(duì)照有所增加（α＞100%），而SPAD值、蒸騰速率、SOD、CAT較對(duì)照有所下降（α＜100%），因而用單項(xiàng)指標(biāo)的耐鎘系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)苧麻耐鎘性具有片面性。

表2 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鎘系數(shù)α值Table.2 Value of cadmium tolerance coefficientαfor each individual index %

利用SPSS軟件對(duì)3個(gè)苧麻品種10個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，從相關(guān)系數(shù)矩陣（表3）可以看出，各單項(xiàng)指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，使得它們提供的信息發(fā)生重疊。同時(shí)各單項(xiàng)指標(biāo)在苧麻耐鎘性中所起的作用也不盡相同，所以利用此單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)苧麻耐鎘性進(jìn)行評(píng)價(jià)則不準(zhǔn)確。

表3 各單項(xiàng)指標(biāo)系數(shù)矩陣Table 3 Coefficientmatrix of single indexes

對(duì)各單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取了兩個(gè)綜合指標(biāo)（表4），其貢獻(xiàn)率分別為62.1%、37.9%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)100%。將原來(lái)10個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為兩個(gè)新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。根據(jù)各綜合指標(biāo)的系數(shù)（表4）以及各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鎘系數(shù)（表2）求出每一個(gè)苧麻品種兩個(gè)綜合指標(biāo)的得分值（表 5）。

表4 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 4 Coefficients and contribution rates of each composite index

表5 種苧麻綜合指標(biāo)的公因子得分值C（x）、隸屬函數(shù)值U（x）、綜合評(píng)價(jià)值DTable 5 The common index score C（x），the subordinate function value U（x），and the composite evaluation value D of the three ramie composite indexes

由公式2求得所有因子的隸屬函數(shù)值U（x）。根據(jù)兩個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為62.1%、37.9%，由公式3求得綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.621、0.379。再根據(jù)公式4求得綜合評(píng)價(jià)值D（表5）。由表5可知，中苧1號(hào)D值最大，中苧3號(hào)其次，中苧4號(hào)D值最小。故3個(gè)苧麻品種耐鎘性強(qiáng)弱關(guān)系依次為中苧1號(hào)＞中苧3號(hào)＞中苧4號(hào)。

3 討論

主成分分析法可有效避免單項(xiàng)指標(biāo)在評(píng)價(jià)作物抗逆性時(shí)發(fā)生信息交叉與重疊的現(xiàn)象以及在確定權(quán)重時(shí)存在的客觀性。綜合評(píng)價(jià)值（D）是一個(gè)［0，1］閉區(qū)間上的純數(shù)，使各品種間的耐鎘性具有可比性。隸屬函數(shù)法是對(duì)材料綜合評(píng)價(jià)的方法，應(yīng)用于作物抗逆性選擇更具有科學(xué)性以及可靠性。對(duì)3種苧麻綜合評(píng)價(jià)值（D值）的計(jì)算表明：在水培條件下，中苧1號(hào)的耐鎘能力最強(qiáng)，中苧3號(hào)次之，中苧4號(hào)耐鎘能力最弱。由于中苧3號(hào)和中苧4號(hào)苧麻品種是本團(tuán)隊(duì)近年選育的品種，尚未在重金屬污染區(qū)進(jìn)行大田試驗(yàn)，其大田的耐鎘性還需要進(jìn)一步研究。

苧麻作為生物量大的多年生作物，對(duì)重金屬鎘有較強(qiáng)的富集能力以及耐受性。研究［14］表明，不同苧麻品種對(duì)鎘的耐受性存在差異。曹德菊等［6］通過(guò)對(duì)盆栽苧麻進(jìn)行鎘處理研究發(fā)現(xiàn)：低濃度（50～200 mg／kg）的鎘處理在一定程度上可以促進(jìn)苧麻生長(zhǎng)。而盆栽試驗(yàn)與水培試驗(yàn)存在較大差異，在本文水培試驗(yàn)研究中：較低鎘濃度（10～30 mg／L）處理并沒(méi)有促進(jìn)苧麻生長(zhǎng)，在水培試驗(yàn)中不同濃度鎘處理對(duì)苧麻生物量的影響還需進(jìn)一步驗(yàn)證。在本試驗(yàn)中隨著鎘濃度的增加，苧麻生物量下降程度表現(xiàn)為中苧3號(hào)＞中苧4號(hào)＞中苧1號(hào)。從側(cè)面表明中苧1號(hào)的耐鎘性較中苧3號(hào)和中苧4號(hào)強(qiáng)。

在水培條件下研究鎘脅迫對(duì)玉米的影響發(fā)現(xiàn)［15］：鎘脅迫會(huì)降低葉片中葉綠素含量、破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合作用降低，進(jìn)而抑制玉米幼苗的生長(zhǎng)。而在本試驗(yàn)中，中苧1號(hào)葉片的凈光合速率、蒸騰作用、細(xì)胞間二氧化碳濃度以及氣孔導(dǎo)度均隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。中苧3號(hào)葉片凈光合速率隨著鎘濃度的增加顯著降低，而低濃度鎘處理顯著增加了葉片的蒸騰速率以及葉片氣孔導(dǎo)度，細(xì)胞間二氧化碳濃度也有所增加，但未達(dá)到顯著水平。因此中苧3號(hào)葉片凈光合速率下降的主要原因可能是葉片主要進(jìn)行呼吸作用。不同濃度鎘處理對(duì)中苧4號(hào)葉片凈光合速率以及蒸騰速率影響不顯著，葉片氣孔導(dǎo)度隨著鎘濃度的增加顯著降低。由此可見(jiàn)，苧麻光合特征對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)存在品種差異，苧麻耐鎘性與光合特征之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步探討。因此，單憑光合特征這一指標(biāo)不能充分評(píng)價(jià)苧麻品種的耐鎘性。

SOD是植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種重要抗氧化物質(zhì)，主要通過(guò)歧化反應(yīng)清除細(xì)胞中的自由基以及活性氧來(lái)對(duì)抗逆境脅迫［16］，一般情況下逆境脅迫條件下植物的SOD活力是升高的，與植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧相適應(yīng)，抗性強(qiáng)的品種SOD活力比抗性弱的品種要高。POD是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，與植物的抗逆性有關(guān)［17］。CAT是植物抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)中的重要酶之一，研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下表現(xiàn)為不同植物CAT活力升高和降低的程度不同［18］。本試驗(yàn)中，中苧1號(hào)葉片SOD、POD以及CAT活力總體變化趨勢(shì)是隨著鎘濃度的增加而升高。中苧1號(hào)葉片SOD、POD以及CAT活力均較中苧3號(hào)以及中苧4號(hào)的高，由此也從側(cè)面反映中苧1號(hào)的耐鎘性最強(qiáng)，其次是中苧3號(hào)，中苧4號(hào)的耐鎘性最差。