核殼結(jié)構(gòu)樹(shù)狀大分子的設(shè)計(jì)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

宋 聰，汪大圓，沈明武，史向陽(yáng)

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

1 前言

樹(shù)狀大分子，特別是被人們譽(yù)為“人工蛋白”的聚酰胺-胺[poly(amidoamine)，PAMAM]樹(shù)狀大分子，自20世紀(jì)80年代面世以來(lái)，其理化性質(zhì)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用得到了廣泛的探索和蓬勃的發(fā)展[1]。樹(shù)狀大分子是一類具有單分散特性以及高度分支三維結(jié)構(gòu)的納米尺度的合成大分子[2]，因其分子結(jié)構(gòu)猶如樹(shù)枝狀而得名。與傳統(tǒng)的線性聚合物相比，樹(shù)狀大分子具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、豐富的內(nèi)部空腔、優(yōu)異的水溶性以及易功能化和非免疫原性等特點(diǎn)[3]。在被功能化分子修飾或用于藥物包封后，樹(shù)狀大分子已成為納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的最佳選擇之一，被廣泛應(yīng)用于生物成像[4-5]、基因/藥物治療[6-10]、聯(lián)合治療[11-12]以及診療一體化[13-15]等。

隨著研究的不斷深入，研究者們已陸續(xù)揭示出單代樹(shù)狀大分子在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在的一些局限性。一般來(lái)說(shuō)，低代樹(shù)狀大分子(如第3代(G3)PAMAM 樹(shù)狀大分子)雖然合成簡(jiǎn)單，成本較低，但有限的載藥能力和較低的基因轉(zhuǎn)染效率在一定程度上限制了其在納米醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[16-17]，而高代樹(shù)狀大分子(超過(guò)第5代)雖然擁有更大的分子尺寸、更好的基因轉(zhuǎn)染效率[17-19]、更強(qiáng)的滲透性[20-22]以及更高的載藥量[10]，但合成步驟繁瑣，純化困難，成本昂貴，納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用也受到一定的限制。此外，單代樹(shù)狀大分子的尺寸較小，如G8 PAMAM的尺寸仍小于10 nm,而常應(yīng)用于癌癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的G5 PAMAM樹(shù)狀大分子尺寸只有5.4 nm，限制了其基于實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)的被動(dòng)靶向功能。另外，除以胱胺為核的PAMAM樹(shù)狀大分子具有氧化還原響應(yīng)特性外[14]，單代樹(shù)狀大分子幾乎不顯示對(duì)外場(chǎng)的刺激響應(yīng)性，從而限制了它們?cè)谂c腫瘤微環(huán)境反應(yīng)性遞送有關(guān)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。更重要的是，高代樹(shù)狀大分子的載藥量也會(huì)因其內(nèi)部空腔的體積有限而無(wú)法與膠束、凝膠、脂質(zhì)體等制劑的載藥量相比[23]。因此，要想使樹(shù)狀大分子更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，研究者們必須獨(dú)辟蹊徑以克服這些局限性。

為了克服單代樹(shù)狀大分子的應(yīng)用局限，使用兩個(gè)或多個(gè)樹(shù)狀大分子作為反應(yīng)模塊，通過(guò)不同類型的相互作用或驅(qū)動(dòng)力構(gòu)建結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的超結(jié)構(gòu)樹(shù)狀大分子納米體系(superstructured dendrimeric nanoconstructs, SDNs)，以代替單代樹(shù)狀大分子，是可行途徑之一[23]。與高代樹(shù)狀大分子的合成相比，SDNs具有結(jié)構(gòu)精確且可控的特性，且更容易制備。SDNs通?？筛鶕?jù)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)或合成策略被分為5類，分別是核殼結(jié)構(gòu)樹(shù)狀大分子(core-shell tecto dendrimers, CSTDs)[24-26]、“啞鈴型”樹(shù)狀大分子[27-29]、樹(shù)狀大分子納米團(tuán)簇[30-31]、樹(shù)狀大分子納米凝膠[32-33]以及基于樹(shù)狀大分子的雜化納米團(tuán)簇[34-35]。其中，通過(guò)簡(jiǎn)單方法合成的以相對(duì)高代樹(shù)狀大分子為核、低代樹(shù)狀大分子為殼的CSTDs不僅具有與高代樹(shù)狀大分子相似的優(yōu)異特性，如豐富的末端官能團(tuán)、疏水的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、高水溶性等，還能夠克服單代樹(shù)狀大分子的應(yīng)用局限。本文基于這一領(lǐng)域的大量文獻(xiàn)，對(duì)CSTDs的合成策略及其納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用做綜合評(píng)述，其中，為清晰起見(jiàn)，表1列出了基于各類樹(shù)狀大分子合成的CSTDs及其相關(guān)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。同時(shí)，結(jié)合納米技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，分析了CSTDs在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的挑戰(zhàn)和未來(lái)前景。

表1 CSTDs的合成策略及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用總結(jié)Table 1 Summary of the synthesis and applications of CSTDs

2 CSTDs的合成

以樹(shù)狀大分子為反應(yīng)模塊合成CSTDs的方法主要有兩種，一是高代樹(shù)狀大分子和低代樹(shù)狀大分子末端基團(tuán)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，原位產(chǎn)生共價(jià)鍵而合成CSTDs；另一種是分別在高、低代樹(shù)狀大分子表面修飾主、客體分子，進(jìn)而利用主客體識(shí)別的方法進(jìn)行超分子組裝，合成CSTDs。

2.1 共價(jià)鍵合成法

合成步驟繁瑣、純化難度高是高代樹(shù)狀大分子合成過(guò)程中難以克服的困境。為解決這些問(wèn)題，Tomalia研究組率先通過(guò)原位共價(jià)鍵法合成并命名了CSTDs[36-37]。該方法主要是將帶有氨基(-NH2)末端的PAMAM樹(shù)狀大分子和過(guò)量的帶有羧基(-COOH)末端的PAMAM樹(shù)狀大分子混合在氯化鋰(LiCl)水溶液中，破壞兩種樹(shù)狀大分子之間的強(qiáng)靜電相互作用，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)以活化羧基基團(tuán)，從而通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)原位形成酰胺鍵，得到以氨基端樹(shù)狀大分子為核、以羧基端樹(shù)狀大分子為殼的CSTDs(圖1a)[24, 38]。值得注意的是，如果反應(yīng)過(guò)程中不添加LiCl，將有可能因?yàn)楹藲そM分之間的強(qiáng)電荷作用得到質(zhì)量分布廣泛、不均一的核殼聚集體。因此，為了獲得單分散的產(chǎn)物，樹(shù)狀大分子核、殼組分多在室溫下與適量LiCl(約0.5 wt.%)水溶液中混合進(jìn)行核-殼反應(yīng)形成CSTDs。在這種合成方法中，研究者們得到的是具有飽和殼組分的CSTDs，其結(jié)構(gòu)尺寸及理化性能均可與更高代的樹(shù)狀大分子相媲美[37]。以形成的G5/G3 CSTDs為例[24]，每個(gè)核組分G5.NH2周圍平均被10個(gè)G3.COOH殼組分所包圍，而且通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)成像、梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、尺寸排阻色譜等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)G5/G3 CSTDs的尺寸和分子量大小介于G7 PAMAM與G8 PAMAM樹(shù)狀大分子之間。更重要的是，G5/G3 CSTDs是由一步法合成的，方法簡(jiǎn)單且產(chǎn)率高達(dá)90%，殼層組分飽和度高達(dá)75%～83%；而如果通過(guò)傳統(tǒng)的發(fā)散法由G5 PAMAM樹(shù)狀大分子反應(yīng)生成G8 PAMAM樹(shù)狀大分子，則至少需要6個(gè)反應(yīng)步驟。此外，Schilrreff等人[39]也利用同樣的共價(jià)鍵法進(jìn)行了飽和殼型G5/G2.5 CSTDs的合成。研究結(jié)果表明，每個(gè)核組分G5.NH2周圍被9～10個(gè)G2.5.COOH殼組分所包圍，殼層組分飽和度達(dá)60%-67%，而且獲得的G5/G2.5 CSTDs 的水動(dòng)力尺寸接近G6.5 樹(shù)狀大分子。

除利用共價(jià)鍵方法合成飽和殼型CSTDs外，Tomalia研究組在2000年還報(bào)道合成了以氨基封端的PAMAM樹(shù)狀大分子為核、以親電性甲基酯封端的PAMAM樹(shù)狀大分子為殼的部分殼填充型CSTDs[36]。通常，部分殼填充型CSTDs是由過(guò)量的殼組分樹(shù)狀大分子與少量的核組分樹(shù)狀大分子在密封管中混合，并于40 ℃條件下加熱25 d直接發(fā)生共價(jià)反應(yīng)后所得(圖1b)。與飽和殼型CSTDs的合成相比，部分殼填充型CSTDs在合成時(shí)直接在核和殼之間形成隨機(jī)共價(jià)鍵，直到所有可接觸的核組分表面空間被填滿。由于核、殼組分之間共價(jià)結(jié)合是隨機(jī)的、無(wú)序的，所以核組分的表面區(qū)域始終無(wú)法被殼組分樹(shù)狀大分子完全填充。與理論上的殼組分飽和度計(jì)算值相比，實(shí)際上每個(gè)CSTDs殼層組分飽和度為40%～66%。近年來(lái)，Studzian等人[40]也利用同樣的一步法進(jìn)行了部分殼填充型G5/G2.5 CSTDs的合成。為了能夠方便應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，部分殼填充型G5/G2.5 CSTDs的酯表面被tris(2-aminoethyl) amine (TREN)修飾而生成了G5/G3-(TREN) CSTDs。

一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)原位共價(jià)鍵法合成的CSTDs具有一定的缺陷。比如，由于聚集和沉淀相關(guān)技術(shù)問(wèn)題的存在，飽和殼型CSTDs必須在LiCl存在的條件下才能合成，而且在相同的反應(yīng)條件下，如果使用以羧基封端的PAMAM樹(shù)狀大分子為核，以過(guò)量的氨基封端樹(shù)狀大分子為殼，則無(wú)法獲得飽和殼型CSTDs[37]；而部分殼填充型CSTDs的合成過(guò)程反應(yīng)性較差，很難得到有序控制[36]。在過(guò)去的20年里，盡管研究人員試圖控制CSTDs的合成穩(wěn)定性并努力將其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但研究似乎停滯不前。在納米材料飛速發(fā)展的今天，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，表面具有氨基基團(tuán)的納米材料(特別是樹(shù)狀大分子)更能廣泛應(yīng)用于納米醫(yī)學(xué)，特別是癌癥診療領(lǐng)域。

2.2 超分子主客體識(shí)別合成法

近年來(lái)，超分子主客體系統(tǒng)被陸續(xù)開(kāi)發(fā)，為氨基封端CSTDs的合成及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用帶來(lái)了巨大的變革[41]。有研究表明， β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin, β-CD)和金剛烷(adamantane, Ad)之間強(qiáng)烈的超分子主客體識(shí)別作用已被廣泛用于構(gòu)建超分子自組裝納米體系，而且構(gòu)建的β-CD/Ad超分子系統(tǒng)自身具有非免疫原性和良好的生物相容性[41-43]?；诖?，我們課題組利用β-CD和Ad之間的主客體識(shí)別作用自組裝合成了氨基封端的CSTDs[25-26, 44]。如圖2所示，首先分別合成Ad修飾的G3.NH2(G3-Ad)和β-CD修飾的G5.NH2(G5-CD)，然后通過(guò)β-CD和Ad之間的超分子識(shí)別作用，合成了以G5為核、G3為殼的CSTDs。與共價(jià)鍵法合成的飽和型CSTDs相比，主客體識(shí)別法合成的CSTDs中每個(gè)核組分G5-CD周圍最多可被12個(gè)G3-Ad殼組分所包圍，在二維核磁共振氫譜(2D NOESY)的3.5～4.0 ppm和1.5～1.7 ppm處能明顯觀察出相關(guān)質(zhì)子交叉信號(hào)，說(shuō)明了β-CD和Ad基團(tuán)之間存在強(qiáng)主-客體相互作用。同時(shí)，AFM成像也確定了G5-CD/Ad-G3 CSTDs具有單分散性良好的球型形態(tài)，測(cè)得的高度約為9 nm左右，高于單獨(dú)的G3-Ad(3 nm)和 G5-CD (5 nm)，這也從側(cè)面說(shuō)明了CSTDs已通過(guò)超分子主-客體組裝成功合成。

圖1 飽和殼型CSTDs(a)和部分殼填充型CSTDs(b)的合成[16]Fig 1 Synthesis of the saturated shell CSTDs(a) and partial shell-filled CSTDs(b)[16]

雖然β-CD/Ad超分子系統(tǒng)成功構(gòu)建出的氨基封端CSTDs已經(jīng)能夠更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但是β-CD/Ad超分子系統(tǒng)不具有響應(yīng)性特征，難以利用腫瘤微環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境多呈弱酸性)對(duì)癌癥進(jìn)行更好的診斷或治療。為進(jìn)一步擴(kuò)大CSTDs的應(yīng)用范疇，本課題組選用β-CD/苯并咪唑(BM)超分子系統(tǒng)構(gòu)建了CSTDs[45]。該超分子主客體系統(tǒng)除具有高效的主客體識(shí)別作用外，還具有pH響應(yīng)性，即在pH=7.4的生理?xiàng)l件下，BM可通過(guò)主客體識(shí)別作用進(jìn)入β-CD的空腔，合成BM/β-CD主客體納米體系；而在pH<6的微酸性條件下，BM由于質(zhì)子化會(huì)從β-CD的空腔中脫離。因此，根據(jù)β-CD/BM的優(yōu)勢(shì)，合成的G5-CD/BM-G3 CSTDs載藥后，會(huì)在酸性條件下分解CSTDs為單獨(dú)的樹(shù)狀大分子，進(jìn)而加速藥物的釋放，從而有望利用腫瘤弱酸環(huán)境增強(qiáng)癌癥治療效果。

3 CSTDs的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

CSTDs作為一種既能保持樹(shù)狀大分子優(yōu)良特性又能克服樹(shù)狀大分子合成和應(yīng)用局限的納米材料，近年來(lái)被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，特別是癌癥診療領(lǐng)域，包括生物學(xué)成像[46-47]、化療[45, 48]、基因遞送[25, 49]及聯(lián)合治療[50]等。

3.1 生物學(xué)成像

生物學(xué)成像是在分子或細(xì)胞水平上觀測(cè)生物過(guò)程的關(guān)鍵?；诩{米平臺(tái)的生物成像已成為腫瘤或疾病診斷不可或缺的技術(shù)之一[51]。CSTDs經(jīng)過(guò)熒光染料或其他成像試劑修飾后，可用于不同目的的生物學(xué)成像[44, 46]。例如，共價(jià)鍵法合成的G5/G2.5 CSTDs 可用異硫氰酸熒光素(FITC)染料進(jìn)行熒光標(biāo)記，從而可通過(guò)熒光顯微鏡觀察FITC-G5/G2.5 CSTDs被各種膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的能力和時(shí)間依賴性變化[47]。通過(guò)體外熒光成像結(jié)果分析，膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)FITC-G5/G2.5 CSTDs的攝取在6 h后達(dá)到了最高，而膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)用FITC標(biāo)記的G6.5樹(shù)狀大分子的吞噬則在1 h就達(dá)到了攝取瓶頸，說(shuō)明與單代樹(shù)狀大分子相比，G5/G2.5 CSTDs能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)材料的攝取。此外，Studzian等人[40]研究了哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)G5/G3-(TREN) CSTDs的攝取，研究結(jié)果表明，G5/G3-(TREN) CSTDs易于進(jìn)入細(xì)胞，并表現(xiàn)出獨(dú)特的無(wú)毒陽(yáng)離子特性和強(qiáng)烈的非傳統(tǒng)固有熒光發(fā)射特性，適用于直接生物成像。

圖2 G5-CD/Ad-G3 CSTDs的合成[44]Fig 2 Synthesis of G5-CD/Ad-G3 CSTDs[44]

除熒光成像外，氨基封端的CSTDs經(jīng)修飾后也可以用于其他方面的生物學(xué)成像。有研究表明，更高分子量的高代樹(shù)狀大分子負(fù)載的釓(Gd)螯合物縱向弛豫率(r1)和磁共振(magnetic resonance, MR)成像靈敏度更高[51-53]。基于此，我們課題組設(shè)計(jì)了螯合釓離子的 CSTDs 納米平臺(tái)，并探索了其基于尺寸或分子量的因素下在腫瘤微環(huán)境中的通透性及改善腫瘤MR成像的能力[44]。首先，合成G5.NH2-CD/Ad-G3.NH2CSTDs，并在此基礎(chǔ)上與四氮雜環(huán)十二烷四乙酸 (DOTA)-Gd(Ⅲ)螯合劑共軛并進(jìn)一步乙酰化，得到產(chǎn)物CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物。同時(shí)，利用相同方法合成G5.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物。研究結(jié)果表明，與 G5.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物相比，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物具有更高分子量和體積，因而具有更長(zhǎng)的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，測(cè)得r1為7.34 mM-1s-1，是G5.NHAc-DOTA(Gd)弛豫率(4.92 mM-1s-1)的1.5 倍，也是臨床釓劑Magnevist弛豫率(4.56 mM-1s-1)的1.6倍。更重要的是，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物在體外3D細(xì)胞球熒光成像實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)出比G5.NHAc-DOTA(Gd) 復(fù)合物更好的滲透性(EPR效應(yīng))。在體內(nèi)MR成像實(shí)驗(yàn)中，CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物也顯示出更好的腫瘤MR成像能力(圖3)，也就是說(shuō)，與G5.NHAc-DOTA(Gd) 復(fù)合物相比，開(kāi)發(fā)的CSTD.NHAc-DOTA(Gd)復(fù)合物擁有腫瘤EPR和弛豫率雙重增強(qiáng)的T1加權(quán)MR成像能力。

此外，CSTDs經(jīng)過(guò)功能化修飾后，不僅具有抗蛋白吸附功能，還可以用于靶向腫瘤的雙模態(tài)成像[26, 54]。例如，先在G5-CD內(nèi)部包裹金納米顆粒，然后利用CD/Ad的主客體識(shí)別作用構(gòu)建包裹金納米顆粒的核-殼結(jié)構(gòu)樹(shù)狀大分子(Au CSTDs)。以Au CSTDs為納米平臺(tái)，在其氨基表面依次修飾RGD肽、Gd螯合劑(DTPA-Gd)以及兩性離子1,3-丙磺酸內(nèi)酯(1,3-PS)，得到多功能RGD-Gd@Au CSTD-PS納米探針。研究表明，該探針不僅具有抗蛋白吸附性能，還具有特異性靶向乳腺癌細(xì)胞(表面αvβ3整合素過(guò)表達(dá))的能力，并且可作為CT/MR雙模態(tài)成像造影劑應(yīng)用于乳腺癌腫瘤模型的雙模態(tài)成像，達(dá)到腫瘤精準(zhǔn)診斷的目的[54]。

圖3 在4T1皮下瘤模型中瘤周注射CSTD.NHAc-DOTA(Gd)(a)或G5.NHAc-DOTA(Gd)(b)前后不同時(shí)間點(diǎn)的體內(nèi)MR成像圖和信噪比(SNR)統(tǒng)計(jì)圖(c)。白色箭頭指向腫瘤部位；注射的材料均溶解在PBS中，[Gd]=5 mmol/L，用量100 μL/每只[44]

3.2 化療

延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間，減少對(duì)正常組織的毒副作用，提高抗癌藥物的治療效果，是開(kāi)發(fā)藥物遞送系統(tǒng)的初衷，也是化療的關(guān)鍵[10]。與單代樹(shù)狀大分子相比，CSTDs因具有更大的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)、分子尺寸以及更豐富的表面基團(tuán)而顯示出更高的載藥效率和巨大的藥物遞送應(yīng)用潛力。早在2012年，Schilrreff等人[39]發(fā)現(xiàn)共價(jià)鍵法合成的G5/G2.5 CSTDs對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有選擇性的細(xì)胞毒性，卻在體外不會(huì)損害健康的角質(zhì)形成細(xì)胞。為了增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷效果，他們進(jìn)一步將6個(gè)甲氨蝶呤(MTX)藥物分子和31個(gè)唑來(lái)膦酸(ZOL)分子分別裝載在G5.NH2的疏水空腔內(nèi)部，然后再通過(guò)共價(jià)鍵法連接G2.5.COOH殼層[48]。合成的CSTDs載藥體系對(duì)癌細(xì)胞殺傷效果明顯高于單獨(dú)藥物或單獨(dú)CSTDs，而且在一定的MTX濃度下(如50 μmol/L)，合成的CSTDs載藥體系可以在不損傷角質(zhì)形成細(xì)胞的前提下顯著抑制Sk-Mel-28細(xì)胞的生長(zhǎng)。

在基于主客體自組裝合成的CSTDs應(yīng)用于藥物輸送和癌癥化療方面，我們發(fā)現(xiàn)具有pH 響應(yīng)性的乙?；鵊5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc CSTDs 可用于抗癌藥物阿霉素(DOX)的遞送。在這項(xiàng)研究中[51]，每個(gè)G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc CSTD平均可負(fù)載9.2個(gè)DOX分子，載藥效率達(dá)82.76%；更重要的是，所形成的CSTD/DOX復(fù)合物可被癌細(xì)胞吞噬并在酸性條件下解離形成單代樹(shù)狀大分子，從而達(dá)到酸響應(yīng)條件下DOX快速釋放的目的。我們還通過(guò) 3D 細(xì)胞球?qū)嶒?yàn)體外評(píng)估了CSTDs/DOX復(fù)合物的藥物滲透能力和腫瘤治療效果。與pH不敏感的CSTD/DOX(即 G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX)復(fù)合物相比，pH敏感的CSTD/DOX復(fù)合物表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的腫瘤滲透能力(圖4a～b)和腫瘤生長(zhǎng)抑制能力(圖4c～d)。

3.3 基因遞送和聯(lián)合治療

帶正電荷的樹(shù)狀大分子常通過(guò)靜電壓縮作用與核酸形成復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)高效的基因遞送。因此，氨基封端的CSTDs也可被用作基因遞送載體。例如，Chen等[25]將G5-CD/Ad-G3 CSTDs作為納米載體通過(guò)靜電壓縮作用遞送質(zhì)粒DNA(pDNA)。結(jié)果表明，所構(gòu)建的G5-CD/Ad-G3 CSTDs對(duì)編碼熒光素酶(luciferase，Luc)質(zhì)粒DNA(pDNA)的轉(zhuǎn)染效率分別是單獨(dú)G3-Ad和G5-CD轉(zhuǎn)染效率的170倍和20倍，原因可能是由于分子體積的增大和電荷/質(zhì)量比的降低，使得pDNA能夠被有效地壓縮以增強(qiáng)基因遞送。在最近的一項(xiàng)研究中，Wang等[49]構(gòu)建了具有不同剛性內(nèi)核的兩種氨基封端的CSTDs，以探索分子剛性對(duì)基因遞送效率的影響。在這項(xiàng)研究中，一方面以具有剛性分子骨架、表面為醛基的含磷第2.5代(P-G2.5)樹(shù)狀大分子為核，以表面為氨基的G3 PAMAM樹(shù)狀大分子為殼，通過(guò)化學(xué)鍵合法形成P-G2.5/G3 CSTDs；另一方面以Ad修飾的G3(G3-Ad)為殼和β-CD修飾的G3 (G3-CD)為核，通過(guò)超分子主客體自組裝合成具有柔性內(nèi)核的G3-CD/Ad-G3 CSTDs。這兩種CSTDs表面基團(tuán)均為氨基，可以用來(lái)壓縮質(zhì)粒DNA (pDNA) 形成載體/基因復(fù)合物。研究結(jié)果表明，具有剛性內(nèi)核的P-G2.5/G3 CSTDs顯示出更好的基因壓縮能力和更強(qiáng)的細(xì)胞攝取。更重要的是，P-G2.5/G3 CSTDs對(duì)編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和Luc pDNA 的轉(zhuǎn)染效率分別是G3-CD/Ad-G3 CSTDs轉(zhuǎn)染效率的1.7倍和4.1倍。

圖4 用G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc/DOX、G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX 或 free DOX孵育HeLa 3D細(xì)胞球不同時(shí)間后的細(xì)胞球熒光成像圖(a)及其熒光強(qiáng)度分布統(tǒng)計(jì)圖(b)，其中，比例尺為100 μm；用PBS、G5.NHAc-CD/BM-G3.NHAc/DOX、G5.NHAc-CD/Ad-G3.NHAc/DOX或 free DOX孵育HeLa 3D細(xì)胞球不同時(shí)間后的細(xì)胞球治療圖(c)及其直徑變化統(tǒng)計(jì)圖(d),其中，比例尺為100 μm[51]

CSTDs也被用于功能性基因和抗癌藥物的胞內(nèi)共傳遞，即將CSTDs作為載體，物理包裹抗癌藥物DOX，并通過(guò)靜電壓縮miR-21抑制劑(miR-21i)，用于體外三陰性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的化療/基因治療的聯(lián)合治療[50]。在這項(xiàng)研究中，首先對(duì)G5-CD/Ad-G3 CSTDs在MDA-MB-231細(xì)胞中的功能性基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)妆葹?0時(shí)，CSTDs轉(zhuǎn)染miR-21i的效果最佳，而且G5-CD/Ad-G3/miR-21i復(fù)合物(N/P=10)能夠顯著抑制癌細(xì)胞的遷移(圖5a～b)，顯著調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因、凋亡基因的表達(dá)(圖5c～d)。如果在G5-CD/Ad-G3 CSTDs中負(fù)載了DOX，然后在N/P=10的條件下進(jìn)行miR-21i的壓縮，即可實(shí)現(xiàn)基因和藥物的共遞送，得到了比僅負(fù)載藥物的CSTDs/DOX復(fù)合物更好的體外癌細(xì)胞殺傷效果。

圖5 用CSTDs/miR-21i復(fù)合物轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 細(xì)胞0、12、24 和 48 h后的刮傷愈合試驗(yàn)圖(a)和遷移區(qū)域統(tǒng)計(jì)圖(b)；用PBS、miR-21i或 CSTDs/miR-21i轉(zhuǎn)染細(xì)胞后蛋白質(zhì)定量分析圖(c)及其印跡圖(d)。1代表對(duì)照組；2代表miR-21i組；3代表CSTDs/miR-21i 復(fù)合物組[50]

4 結(jié)論

CSTDs主要是通過(guò)共價(jià)鍵形成和超分子自組裝這兩種方式合成。與單代的樹(shù)狀大分子相比，CSTDs不但擁有更高的分子量和更大的內(nèi)部空腔，電荷/質(zhì)量比降低，而且還可實(shí)現(xiàn)環(huán)境響應(yīng)性，對(duì)于探索或擴(kuò)大CSTDs的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有重要意義。近年來(lái)，基于CSTDs的納米平臺(tái)已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是熒光成像、MR成像、雙模態(tài)成像以及基因遞送、化療或是化療/基因治療的聯(lián)合治療等。雖然CSTDs的合成和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用已初見(jiàn)成效，但仍有待更多的研究。一方面，應(yīng)開(kāi)發(fā)更多反應(yīng)類型或組裝策略以合成多樣的CSTDs；另一方面，可基于CSTDs自身性質(zhì)，結(jié)合不同的治療/成像元素，擴(kuò)展CSTDs在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用?？傊?，CSTDs的合成方法及其在分子成像、靶向藥物傳遞、腫瘤診療或其他疾病診療方面的應(yīng)用研究極具廣闊的應(yīng)用前景，是一個(gè)值得探索的開(kāi)放式研究領(lǐng)域。