烯效唑?qū)ζ咸迅鄙业挠绊懠暗x關(guān)鍵基因表達(dá)分析

回依寧，申海林，白瑞雯，閆可，鄒利人，張楚，齊曉光，溫景輝

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春 130118；2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，吉林公主嶺 136100；3. 延邊大學(xué)園藝學(xué)院，吉林延邊 133002）

葡萄是世界重要果樹，豐產(chǎn)性強，經(jīng)濟效益好，在種植業(yè)廣受歡迎[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，2019年全球葡萄栽培總面積792萬 hm2，總產(chǎn)量6592萬 t，約占世界水果總產(chǎn)量的20%[2]。我國葡萄種植面積已達(dá)72.8萬 hm2，年產(chǎn)量1419.5萬 t，在促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、助力農(nóng)民脫貧致富中發(fā)揮了重要作用[3]。

氮是植物生長所需的重要礦質(zhì)營養(yǎng)元素，氮肥的吸收和同化是植物發(fā)育和生長的重要過程[4]，硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase, NR）、亞硝酸還原酶（Nitrite reductase, NiR）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）、谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase, GDH）和天冬酰胺合成酶（Asparagine synthetase, AS）等在氮代謝中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。許多研究表明，應(yīng)用植物化學(xué)調(diào)控技術(shù)可以影響氮素的吸收與利用，調(diào)節(jié)作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成等[7]。

烯效唑是一種常用的植物生長延緩劑，具有高效、低毒、低殘留等特點[8]，在小麥[9-10]、水稻[11-12]、豆類[13-15]等作物上已有較多報道，但在葡萄上的應(yīng)用研究相對較少。葡萄的夏季管理繁瑣，修剪副梢需要大量人工[16]，通過科學(xué)使用烯效唑等植物生長調(diào)節(jié)劑，可減緩副梢生長，對實現(xiàn)葡萄輕簡化管理具有重要意義。本試驗以‘著色香’和‘香悅’兩品種為試驗材料，開展了烯效唑調(diào)控葡萄副梢生長發(fā)育及氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)研究，以期為葡萄副梢生長機理研究及夏季省工管理提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗地點為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所公主嶺葡萄核心技術(shù)試驗園。試材為‘著色香’和‘香悅’，大棚栽培，樹齡7年，砧木為‘貝達(dá)’，株行距0.8 m×2.0 m，樹形為斜干水平龍干形，常規(guī)田間管理。

1.2 使用藥劑及處理方法

烯效唑為四川省蘭月科技有限公司生產(chǎn)，有效成分含量95%?；ㄇ? d（5月26日），將烯效唑以少量酒精溶解后配制成300 mg·L-1溶液，葉面噴施，每處理10株，以葉面均勻潤濕不下滴為宜，噴施時間為當(dāng)天7:00，藥品現(xiàn)配現(xiàn)用。以噴灑清水為對照。

RNA提取采用天根植物多糖多酚RNA提取試劑盒（型號DP441），反轉(zhuǎn)錄采用Power ScriptⅡ TM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（型號6210A），5個氮代謝關(guān)鍵基因引物由吉林省庫美生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 副梢生長測定

于處理后25 d（6月20日），每處理隨機選擇生長勢基本一致的葡萄植株，選取健壯新梢10個，測量新梢第4節(jié)位副梢的總長度及該副梢第2節(jié)節(jié)間長度。

1.3.2 葉片相關(guān)指標(biāo)測定

（1）葉綠素含量測定：于8月20日選取植株中部外圍發(fā)育良好的20片成齡葉，使用 SPAD-502型手持葉綠素儀進(jìn)行測定。

（2）葉面積測量：每處理隨機選取長勢良好成齡葉片10片，用Image J軟件（V1.8.0）測量葉面積大小。

1.3.3 五個氮代謝關(guān)鍵基因的半定量 RT-PCR表達(dá)分析

（1）在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找5個葡萄氮代謝關(guān)鍵基因的DNA序列：谷氨酸脫氫酶基因（VvGDH）、亞硝酸還原酶基因（VvNiR）、硝酸還原酶基因（VvNR）、谷氨酰胺合成酶基因（V v G S）和酰胺合成酶基因（VvAS），并采用Primer 5.0設(shè)計引物，以葡萄UBI基因為看家基因（表1）。

表1 引物序列及目的片段大小Table 1 Primer sequence and target fragment size

（2）按時期分別采集‘著色香’和‘香悅’葡萄烯效唑處理和對照的副梢幼嫩葉片。采樣時間為處理后6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d和10 d，每次采集后及時采用液氮冷凍處理，再放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）RT-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。

（4）使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烯效唑?qū)ζ咸迅鄙疑L發(fā)育的影響

2.1.1 烯效唑?qū)ζ咸迅鄙议L度的影響

由圖1可知，300 mg·L-1烯效唑處理對葡萄副梢長度的影響因品種而異。烯效唑處理對‘著色香’的副梢長度有明顯的抑制作用，處理后‘著色香’副梢長度僅為33.33 cm，顯著低于對照，減少了55.97%。而300 mg·L-1烯效唑處理對‘香悅’葡萄的副梢長度影響不顯著。

圖1 烯效唑處理對葡萄副梢長度的影響Figure 1 Effects of uniconazole treatment on the growth of shoots

2.1.2 烯效唑?qū)ζ咸迅鄙夜?jié)間長度的影響

由圖2可知，300 mg·L-1烯效唑處理對葡萄副梢節(jié)間長度的影響因品種而異。烯效唑處理后，‘著色香’副梢節(jié)間長度顯著縮短，為11.45 cm，較對照減少22.32%。而300 mg·L-1烯效唑處理對‘香悅’葡萄副梢節(jié)間長度影響不顯著。

圖2 烯效唑?qū)ζ咸迅鄙夜?jié)間長度的影響Figure 2 Effect of uniconazole on the length of the internode length of accessory shoots

2.2 烯效唑?qū)ζ咸讶~片生長發(fā)育的影響

2.2.1 烯效唑?qū)θ~面積大小的影響

由圖3可知，300 mg·L-1烯效唑處理后，‘著色香’葡萄葉面積明顯減小，僅為172.50 cm2，較對照減少了39.42%。而300 mg·L-1烯效唑處理對‘香悅’葡萄的葉面積大小影響不顯著。

圖3 烯效唑?qū)ζ咸讶~面積大小的影響Figure 3 Effect of uniconazole on grape leaf area

2.2.2 烯效唑?qū)θ~綠素相對含量的影響

由圖4可知，300 mg·L-1烯效唑?qū)ζ咸讶~綠素的影響因品種而異。在‘著色香’上，烯效唑處理的葉綠素含量為47.05 SPAD，顯著高于對照13.89%。在‘香悅’上，300 mg·L-1烯效唑處理的葉綠素含量略高于對照，但差異不顯著。

圖4 烯效唑?qū)ζ咸讶~片葉綠素含量的影響Figure 4 Analysis on the difference of uniconazole to chlorophyll content of grape leaf

2.3 烯效唑?qū)Α恪咸?個氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

如圖5所示，在處理后不同時期，5個葡萄氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)呈現(xiàn)一定差異。天冬酰胺合成酶基因（VvAS）在處理后2、4、6 d的表達(dá)明顯下調(diào)；谷氨酸脫氫酶基因（VvGDH）在處理后12 h、1 d、4 d和6 d的表達(dá)明顯下調(diào)；谷氨酰胺合成酶基因（VvGS）在處理后12 h、1 d、2 d、6 d和8 d的表達(dá)明顯下調(diào)；亞硝酸還原酶基因（VvNiR）在處理后12 h、1 d、2 d、4 d、6 d和8 d的表達(dá)明顯下調(diào)；硝酸還原酶基因（VvNR）在處理后1、2、4、8 d的表達(dá)明顯下調(diào)。

圖5 五個葡萄氮代謝關(guān)鍵基因在‘著色香’葡萄副梢上的半定量表達(dá)結(jié)果Figure 5 Results of semi-quantitative RT-PCR detection of the expression of five genes on the accessory shoots of 'Zhuosexiang'

由圖6可知，烯效唑調(diào)控‘著色香’葡萄副梢生長5個氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)可分為3個階段，其順序依次為VvGDH、VvGS、VvNiR→VvNR→VvAS。在烯效唑處理后的12 h時，可檢測到3個早期響應(yīng)基因：VvGDH、VvGS和VvNiR；第1天時VvNR基因開始表達(dá)；第2天時VvAS基因開始表達(dá)。由于VvNiR基因表現(xiàn)為早期響應(yīng)且表達(dá)貫穿整個調(diào)控時期，因此初步推斷VvNiR基因可能是烯效唑調(diào)控‘著色香’葡萄副梢生長的關(guān)鍵基因。

圖6 ‘著色香’上5個氮代謝關(guān)鍵基因處理后不同時期下調(diào)表達(dá)示意圖Figure 6 Down regulated expression of five key genes of nitrogen metabolism in 'Zhuosexiang' at different stages after treatment

3 討論與結(jié)論

烯效唑具有顯著提高作物葉片光合能力[17-18]、抑制生長[19-20]、增強抗逆性[21]、增加產(chǎn)量[22]和改善品質(zhì)[23]等多種效應(yīng)，有利于抑制植物的營養(yǎng)生長。烯效唑抑制生長的作用機理是阻礙貝殼杉烯到貝殼杉烯酸的氧化脫甲基化反應(yīng)，使貝殼杉烯酸難以合成，從而切斷了赤霉素的生物合成，具有強烈的植物生長抑制活性[24]。通過上述理化功能，使植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，對抑制植物新梢生長具有明顯效果。王寶亮[25]在‘夏黑’葡萄上噴施200 mg·L-1烯效唑能顯著抑制新梢生長，減小節(jié)間長度，抑制副梢萌發(fā)，增大果穗，改善果實品質(zhì)；章世奎[26]在庫爾勒香梨新梢旺盛生長期，葉面噴施250～350 mg·L-1烯效唑能有效抑制新梢生長、增加新梢粗度。本試驗表明，噴施300 mg·L-1烯效唑有效抑制‘著色香’新梢生長和副梢節(jié)間長度，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[27-29]。

光合作用是作物生長的重要代謝過程，葉綠素參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化功能，其含量的多少直接影響植株的光合能力[30]。孟娜[31]研究表明，鹽脅迫會使植株葉片中葉綠素含量下降，導(dǎo)致光合器官結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，造成植株生長受阻，而施用烯效唑可以減輕脅迫對植株的傷害，并保持植株正常的光合作用。單瑩[32]研究表明，低溫脅迫下葉綠素含量降低，而噴施烯效唑可有效緩解低溫脅迫對植株的傷害。李寧毅[33]研究表明，干旱脅迫下植株生長受到抑制，葉綠素含量顯著降低，光合作用受到抑制，經(jīng)烯效唑處理后可提高葉綠素含量，抗旱能力也顯著增強。本試驗中，由于供試材料為大棚栽培，夏季高溫季節(jié)大棚內(nèi)易遭受高溫脅迫，烯效唑的使用可從一定程度上減輕脅迫影響。與對照相比，300 mg·L-1烯效唑處理可提高葉片葉綠素含量，增強植株抗逆性，這與已有的眾多報道結(jié)果一致。

氮素是植物重要的營養(yǎng)元素，是限制植物生長和產(chǎn)量形成的首要因素。氨基酸及碳氮代謝途徑是影響植物生長的重要代謝途徑，低濃度氮營養(yǎng)可抑制生物堿合成以及能量代謝相關(guān)活動，而高濃度的氮營養(yǎng)則起促進(jìn)作用[38]，不同果樹種類、同一種類果樹的不同器官、組織中氮代謝酶基因?qū)Φ昧?、施用時間等均有不同響應(yīng)機制[34]。烯效唑具有延緩地上部生長、促進(jìn)根系生長的效應(yīng)[39-40]。本研究中，烯效唑通過影響5個關(guān)鍵氮素酶基因的表達(dá)，抑制‘著色香’葡萄副梢生長，這與以往烯效唑能有效抑制營養(yǎng)生長、縮小節(jié)間長度和降低株高的研究結(jié)果相一致?！銗偂鄙疑L對300 mg·L-1烯效唑調(diào)控未有明顯作用，可能與品種特性有關(guān)，‘香悅’為四倍體，‘著色香’為二倍體，不同倍性品種的植株生長勢及內(nèi)源激素含量差異較大，導(dǎo)致其對烯效唑的調(diào)控反應(yīng)不同。本研究中烯效唑抑制氮素利用的結(jié)果與一些在禾本科上的研究報道不盡一致。有研究表明，烯效唑可以促進(jìn)水稻、小麥的氮代謝，提高氮素同化能力[35-37]。作者認(rèn)為，烯效唑?qū)Φ氐睦貌町惪赡芘c作物種類、田間環(huán)境等相關(guān)，其具體機理尚有待于進(jìn)一步研究。

近年來，控制葡萄營養(yǎng)生長的研究大致分為兩方面：一是通過斷根、修剪、限根栽培和控制水肥等人為方式來控制；二是利用植物生長調(diào)節(jié)劑，如矮壯素和烯效唑等化學(xué)方式達(dá)到控梢的目的[41-42]。本試驗中，通過300 mg·L-1烯效唑處理可有效抑制‘著色香’葡萄的營養(yǎng)生長、減小葉面積、提高葉綠素含量，對于實現(xiàn)葡萄園輕簡化管理、增強通風(fēng)透光、提高光合效能具有積極意義。目前，有關(guān)烯效唑調(diào)控植株生長的研究主要集中在生長狀態(tài)測定和生理指標(biāo)變化的研究上，涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和代謝途徑等方面的研究相對缺乏。在新時代農(nóng)業(yè)發(fā)展背景下，加強烯效唑調(diào)控植物生長機制研究，將有助于人們深入了解植物的生長機制，促進(jìn)高效植物生長調(diào)節(jié)劑的研發(fā)和利用，為農(nóng)業(yè)高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)[43]。