滋陰通絡(luò)方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨密度的影響

孫 凱 陳榮彬 楊英東 李 勇

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院骨三科，廣東珠海 519000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后女性雌激素水平下降導(dǎo)致骨脆性增加的一種代謝性骨病[1]，其患病率在>50 歲女性人群中高達(dá)67.30%[2]。該病導(dǎo)致了骨折危險(xiǎn)性迅速上升，給個(gè)人及社會(huì)帶來了嚴(yán)重的精神、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前西藥能有效緩解絕經(jīng)后骨量丟失，但長(zhǎng)期使用不僅費(fèi)用昂貴，而且并發(fā)癥多[4]。而中醫(yī)藥治療作為一種經(jīng)濟(jì)有效的療法，在治療該病方面前景廣闊[5]。滋陰通絡(luò)方是廣東省中醫(yī)藥珠海醫(yī)院用于治療PMOP 的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)益肝腎、滋陰活血通絡(luò)之效，前期研究證實(shí)滋陰通絡(luò)方聯(lián)合西藥可有效抑制骨吸收，改善骨代謝[6]，提高骨密度[7]。本研究旨在探討滋陰通絡(luò)方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)3 月齡雌性SD 大鼠60 只，體重200～230 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科技發(fā)展有限公司，并在廣東省中醫(yī)院大學(xué)城實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0094，合格證號(hào)：44002100022874。廣東省中醫(yī)院大學(xué)城動(dòng)物試驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查批號(hào)：2019044。

1.1.2 藥物 滋陰通絡(luò)方：熟地10 g、麥冬10 g、牛膝10 g、女貞子10 g、當(dāng)歸10 g、白芍10 g、蜈蚣2 條、桑寄生15 g、黃芪10 g、烏梢蛇10 g、防風(fēng)10 g、雞血藤15 g、白術(shù)10 g、甘草3 g（江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，顆粒劑）。阿侖膦酸鈉片（海南全星制藥有限公司生產(chǎn)，H20150109）；阿法骨化醇軟膠囊[廣州白云山星野（藥業(yè)）股份有限公司生產(chǎn)，H20100159]。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備 Ⅰ前膠原氨基端原肽（procollagen ⅠN-terminal propeptide，PⅠNP）檢測(cè)試劑盒（H-285）、Ⅰ型膠原氨基末端端肽（N-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，NTX）檢測(cè)試劑盒（H368-1）、Ⅰ型膠原C 末端肽（C-telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX-Ⅰ）檢測(cè)試劑盒（H-287）（均來源于南京建成生物工程研究所）；micro-CT 儀：比利時(shí)生產(chǎn)，型號(hào)：Bruker skyscan 1172，掃描參數(shù)：電流為88 μA，電壓為80 kV，分辨率為9 μm，單次掃描時(shí)間為54 min。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備及干預(yù)方法 將50 只大鼠利用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，西藥組，滋陰通絡(luò)方低、中、高劑量組，每組10 只。另取10 只大鼠作為假手術(shù)組。所有大鼠在3 ml/kg 水合氯醛全身麻醉下進(jìn)行絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松造模。其中假手術(shù)組僅摘除卵巢附近脂肪，保留卵巢，其他組均進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除。術(shù)后所有大鼠肌注青霉素+0.9%氯化鈉溶液（4 萬U/ml）抗感染，每天注射1.5 ml，連續(xù)3 d。所有去卵巢大鼠每日進(jìn)行陰道上皮細(xì)胞涂片分析，連續(xù)5 d 觀察到白細(xì)胞證明卵巢摘除成功[8]。造模12 周后，六組大鼠均予灌胃操作，灌胃劑量根據(jù)第4 版《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積換算，其中西藥組予阿侖膦酸鈉10.51 mg/kg（1 次/周）和骨化三醇丸0.075 μg/kg（1 次/d）灌胃，滋陰通絡(luò)方低、中、高劑量組分別予滋陰通絡(luò)方1.34、2.68、4.02 g/kg（1 次/d）進(jìn)行灌胃，假手術(shù)組與模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃12 周。

1.2.2 骨密度及骨顯微結(jié)構(gòu)觀察 治療結(jié)束后，將大鼠股骨固定于micro-CT 專用掃描墊上，掃描股骨頭至股骨中段，每次掃描的旋轉(zhuǎn)角度為0.4°，總共旋轉(zhuǎn)180°掃描，9 μm 為一斷層，拍攝2 張圖像。使用儀器自帶軟件行三維重建，并采用CTan 軟件對(duì)選定區(qū)域骨密度（bone mineral density，BMD）和骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度、骨小梁模式因子及結(jié)構(gòu)模型指數(shù)等骨小梁參數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.3 血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè) 治療結(jié)束后，禁食水，行腹主動(dòng)脈采血，全血靜置2 h，3000 r/min（離心半徑為8 cm），離心10 min。吸取血清，嚴(yán)格按照PⅠNP、NTX 及CTX-Ⅰ檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法計(jì)算血清骨代謝指標(biāo)PⅠNP、NTX、CTX-Ⅰ含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠BMD 的影響

模型組BMD 低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。滋陰通絡(luò)方各劑量組BMD 均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。滋陰通絡(luò)方不同劑量組BMD 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠BMD 的影響（g/cm3，）

表1 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠BMD 的影響（g/cm3，）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。BMD：骨密度

2.2 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

模型組股骨骨小梁間隙增大，排列稀疏，而西藥組及滋陰通絡(luò)方各治療組均可不同程度地改善大鼠股骨骨小梁顯微結(jié)構(gòu)（圖1～2）。模型組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量低于假手術(shù)組，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；滋陰通絡(luò)方各劑量組的骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量高于模型組，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)則低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；滋陰通絡(luò)方不同劑量組骨小梁參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨小梁參數(shù)的影響（）

表2 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨小梁參數(shù)的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

圖1 各組大鼠股骨二維結(jié)構(gòu)圖

圖2 各組大鼠股骨三維結(jié)構(gòu)圖

2.3 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨代謝指標(biāo)的影響

模型組血清CTX-Ⅰ、NTX 高于假手術(shù)組，PⅠNP水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；滋陰通絡(luò)方各劑量組大鼠血清CTX-Ⅰ、NTX 含量低于模型組，PⅠNP 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；滋陰通絡(luò)方中不同劑量組CTX-Ⅰ、NTX及PⅠNP 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨代謝指標(biāo)的影響（）

表3 滋陰通絡(luò)方對(duì)各組大鼠骨代謝指標(biāo)的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。PⅠNP：Ⅰ前膠原氨基端原肽；NTX：Ⅰ型膠原氨基末端端肽；CTX-Ⅰ：Ⅰ型膠原C末端肽

3 討論

女性絕經(jīng)后雌激素水平下降，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨代謝失衡，造成骨量丟失，最終誘發(fā)骨質(zhì)疏松[10]。去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型造模技術(shù)成熟，是研究PMOP的常用模型[8]。阿侖膦酸鈉可有效抑制骨吸收，阿法骨化醇可促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收，兩藥聯(lián)用可有效改善骨代謝，提高BMD，改善骨顯微結(jié)構(gòu)[11]，故將其選為陽性對(duì)照組。BMD 是PMOP 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[12]，常用評(píng)估抗骨質(zhì)疏松療效，結(jié)果顯示，模型組BMD 較假手術(shù)組降低，表明造模成功[8]，而服用滋陰通絡(luò)方后，去卵巢大鼠骨密度顯著增加，提示滋陰通絡(luò)方可增加去卵巢大鼠BMD。但BMD 在評(píng)估骨微結(jié)構(gòu)方面具有一定的局限性[13]。而骨微結(jié)構(gòu)與骨折發(fā)生息息相關(guān)，是抗骨質(zhì)疏松治療效果評(píng)價(jià)中的重要組成部分[14]，micro-CT 可全面、精確、無創(chuàng)了解骨小梁變化[15]。當(dāng)發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁間隙增加，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，增加了骨折危險(xiǎn)性[16]。本研究結(jié)果顯示模型組骨小梁間隙增加，排列稀疏，骨微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，而經(jīng)滋陰通絡(luò)方灌胃治療后，骨小梁間隙減小，排列更為緊密，骨微結(jié)構(gòu)得到改善。而滋陰通絡(luò)方各劑量組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度等骨小梁參數(shù)較模型組增加，骨小梁分離度、骨小梁模式因子、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)較模型組下降（P ＜0.05），提示不同劑量滋陰通絡(luò)方可增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁數(shù)量，提高骨小梁厚度，減小骨小梁分離程度，進(jìn)而改善骨顯微結(jié)構(gòu)。

NTX 與CTX-Ⅰ是Ⅰ型膠原的降解產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)骨吸收的敏感標(biāo)志物，PⅠNP 可反應(yīng)Ⅰ型膠原蛋白合成水平，是評(píng)價(jià)骨形成的標(biāo)志物[17]，因而臨床將這三種指標(biāo)作為評(píng)估骨代謝的常用標(biāo)志物[18]。研究結(jié)果顯示，切除卵巢后，大鼠PⅠNP 下降，NTX 與CTX-Ⅰ含量上升，而服用滋陰通絡(luò)方后，去卵巢大鼠血清PⅠNP水平上升，NTX 與CTX-Ⅰ含量降低，提示滋陰通絡(luò)方可有效促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，改善骨代謝。

中醫(yī)認(rèn)為PMOP 多以肝腎虧虛所致，因而臨床常以補(bǔ)益肝腎法治療PMOP[19]。滋陰通絡(luò)方中熟地、女貞子共為君藥，可滋補(bǔ)肝腎，益精填髓。桑寄生、麥冬、牛膝、白芍、當(dāng)歸、烏梢蛇、雞血藤、蜈蚣滋陰補(bǔ)腎，填精壯骨，活血通絡(luò)，共為臣藥。佐以黃芪、白術(shù)、防風(fēng)，增強(qiáng)脾胃吸收能力，以防君臣之藥滋補(bǔ)太過。甘草為使藥，調(diào)和諸藥。諸藥相合，共奏補(bǔ)益肝腎，滋陰活血通絡(luò)之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明[20]，補(bǔ)益肝腎中草藥可通過多種途徑來影響骨代謝。而滋陰通絡(luò)方中含有的熟地[21]、女貞子[22]、牛膝[23]等補(bǔ)益肝腎類中藥，可能對(duì)骨代謝起到調(diào)節(jié)作用。

PMOP 的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果[24]，而中藥治療PMOP 具有“多組分、多途徑”的優(yōu)勢(shì)[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示了滋陰通絡(luò)方能夠通過促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，從而提高去卵巢大鼠骨密度并改善骨組織微結(jié)構(gòu)，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。