p16/Ki-67雙染對(duì)高危型人乳頭瘤病毒陽性婦女的分流作用

楊寶華， 徐 靈， 朱修香， 夏子茵， 謝曉麗， 曹云桂

1. 上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201199 2. 上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院病理科，上海 201199 3. 上海市嘉定區(qū)婦幼保健院，上海 201800

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，且近年有年輕化趨勢(shì)。2020年GLOBOCAN報(bào)告[1]顯示：在中低人類發(fā)展指數(shù)國家中，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均高居女性惡性腫瘤的第2位。人乳頭狀瘤病毒感染常見，多為一過性感染，易被人體自身免疫系統(tǒng)清除，其中高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papilloma virus, HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的重要病因[2-3]。因此，2019年美國陰道鏡和宮頸病理協(xié)會(huì)(ASCCP)《基于風(fēng)險(xiǎn)的宮頸癌篩查結(jié)果異常的管理共識(shí)》[4]建議將單獨(dú)HR-HPV或HR-HPV與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合用于作為宮頸癌初篩，對(duì)單獨(dú)HR-HPV初篩呈陽性的婦女采用細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行分流。但細(xì)胞學(xué)主觀性強(qiáng)，且我國細(xì)胞學(xué)醫(yī)師較少。

2020年11月WHO發(fā)布《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》，要求2030年70% 的35～45歲女性接受宮頸癌精準(zhǔn)篩查。為了達(dá)到這一目標(biāo)，須尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物，從而對(duì)HR-HPV呈陽性婦女進(jìn)行有效分流，這是我國亟待解決的問題。已有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，HR-HPV的E7癌基因整合至宮頸上皮細(xì)胞，破壞了細(xì)胞的正常周期，引起包括Ki-67、p16蛋白在內(nèi)的原本正常的細(xì)胞增殖蛋白異常表達(dá)。因此，本研究探討p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染對(duì)HR-HPV陽性患者的分流作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2019年9月至2020年5月于上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦科門診就診，初篩為HR-HPV陽性的婦女776例，對(duì)其進(jìn)行以下3項(xiàng)檢查：宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(thinprep cytologic test，TCT)、p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染以及陰道鏡定位下宮頸活檢。本研究獲得上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-批件-011-01K)，患者經(jīng)知情告知表示愿意參加本次課題。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡25～65歲；(2)有宮頸；(3)有性生活史；(4)身體狀況允許進(jìn)行宮頸癌篩查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往因子宮頸病變或?qū)m頸癌接受過治療；(2)合并嚴(yán)重影響生命體征平穩(wěn)的疾病；(3)妊娠期婦女；(4)接診前48 h內(nèi)有陰道用藥史；(5)接診前48 h內(nèi)有性生活；(6)盆腔急性炎癥；(7)急性陰道炎；(8)陰道流血；(9)不愿意參加本研究或未進(jìn)行陰道鏡下宮頸活檢。

1.2 脫落細(xì)胞采集及HPV分型檢測(cè) 用擴(kuò)陰器將宮頸充分暴露，將宮頸刷尖端置入宮頸管內(nèi)，宮頸刷其余部分盡可能覆蓋宮頸移行帶，用一定的壓力按照逆時(shí)針或順時(shí)針同方向旋轉(zhuǎn)宮頸刷5～8周。將宮頸刷頭推入裝有保存液瓶中，宮頸脫落細(xì)胞采集完成。脫落細(xì)胞用于TCT和p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢查。采集的脫落細(xì)胞用于HPV分型時(shí)用HPV專用刷，用同樣的方法取材，刷頭置于HPV細(xì)胞保存液。根據(jù)HPV與宮頸癌的關(guān)系，將HPV分為低危型、中危型和高危型。

用羅氏聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行HR-HPV分型，分為HPV16、 HPV18和HPV其他12型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)。

1.3 觀察指標(biāo)及判讀

1.3.1 TCT TCT由2位高年資中級(jí)職稱醫(yī)師進(jìn)行判讀，如有疑義，由高級(jí)職稱醫(yī)師進(jìn)行復(fù)驗(yàn)。細(xì)胞學(xué)閱片采用2001版the Bethesda System(TBS)描述性診斷系統(tǒng)，結(jié)果分為鱗狀上皮細(xì)胞異常和腺細(xì)胞異常。鱗狀上皮細(xì)胞異常分為未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性細(xì)胞(NILM)、無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、不能除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-H)、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和鱗狀細(xì)胞癌。腺細(xì)胞異常分為不典型腺上皮、原位腺癌和腺癌。將ASCUS及以上病變(ASCUS、ASC-H、LSIL、HSIL、鱗狀細(xì)胞癌、不典型腺上皮、原位腺癌和腺癌)記為細(xì)胞學(xué)陽性。

1.3.2 p16/Ki-67蛋白雙染 p16/Ki-67檢測(cè)采用羅氏公司的CINtec PLUS技術(shù)，結(jié)果由2位經(jīng)過培訓(xùn)的病理科醫(yī)師判讀。p16位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕色染色，Ki-67的位于細(xì)胞核內(nèi)，呈紅色染色。1個(gè)及以上宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在棕色細(xì)胞質(zhì)染色和紅色細(xì)胞核染色為細(xì)胞學(xué)陽性，反之為陰性。

1.3.3 組織學(xué)病理 由經(jīng)驗(yàn)豐富的宮頸?？漆t(yī)師進(jìn)行陰道鏡檢查以及活檢，活檢組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(H-E)染色和p16免疫組化染色。活檢結(jié)果由2位高年資中級(jí)職稱以上醫(yī)師進(jìn)行判讀，如有疑義，由高級(jí)職稱醫(yī)師進(jìn)行復(fù)驗(yàn)。HSIL、宮頸原位腺癌和宮頸癌為組織學(xué)陽性(HSIL+)；LSIL、濕疣樣變、宮頸慢性炎、宮頸息肉等為組織學(xué)陰性(HSIL-)。

1.4 陰道鏡轉(zhuǎn)診策略及HSIL+檢出比較 出現(xiàn)以下情況時(shí)轉(zhuǎn)診陰道鏡：HPV16/18陽性(策略1)；HR-HPV其他12型陽性且p16/Ki-67雙染陽性(策略2)；HR-HPV其他12型陽性且TCT陽性(策略3)。比較3種陰道鏡轉(zhuǎn)診策略宮頸HSIL+的檢出率，以及每發(fā)現(xiàn)1例HSIL+所需的陰道鏡轉(zhuǎn)診頻數(shù)，頻數(shù)=陰道鏡轉(zhuǎn)診例數(shù)/HSIL+例數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 776例HR-HPV陽性受試者，HPV16/18型陽性152例，其他12型陽性624例，患者平均年齡為(43.16±12.97)歲。 其中正常或炎性病變430例，LSIL患者272例，HSIL患者65例，鱗狀細(xì)胞癌9例。

2.2 2種檢測(cè)方法宮頸病變檢出率比較 結(jié)果(表1)顯示：776例HR-HPV呈陽性受試者中，p16/Ki-67(趨勢(shì)χ2=141.324，P<0.001)和TCT(趨勢(shì)χ2=81.328，P<0.001)的檢出率均隨宮頸病變病理級(jí)別的增高而上升。其中，p16/Ki-67對(duì)HSIL的檢出率明顯高于TCT陽性率(72.3%vs47.7%，P=0.004)。

表1 p16/Ki-67和TCT對(duì)HR-HPV陽性受試者宮頸病變的檢出情況比較 n(%)

2.3 2種檢測(cè)方法檢出HSIL+病變有效性比較 p16/Ki-67顯示HSIL+病變陽性56例、陰性18例，TCT顯示HSIL+病變陽性37例、陰性37例。結(jié)果(表2)顯示：與TCT比較，p16/Ki-67預(yù)測(cè)HSIL+病變有更高的靈敏度(75.7%vs50.0%，χ2=10.445，P=0.001)和陰性預(yù)測(cè)值(96.9%vs94.1%，χ2=5.482，P=0.019)；2種方法特異度和陽性預(yù)測(cè)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 2種檢測(cè)方法檢出HR-HPV陽性受試者宮頸HSIL+有效性比較 n(%)

2.4 不同陰道鏡轉(zhuǎn)診策略HSIL+檢出情況 在HPV陽性受試者中，轉(zhuǎn)診陰道鏡后檢出74例HSIL+患者，結(jié)果(表3)顯示：策略1與策略2對(duì)宮頸HSIL+的檢出率相似；策略1每發(fā)現(xiàn)1例HSIL+所需的陰道鏡轉(zhuǎn)診頻數(shù)最少，與策略3差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.41，P=0.036)。

表3 不同陰道鏡轉(zhuǎn)診策略每檢出1例宮頸HSIL+所需的陰道鏡轉(zhuǎn)診頻數(shù) n(%)

3 討 論

p16蛋白是一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，參與 pRB介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控，是細(xì)胞周期的制動(dòng)劑，在G0期表達(dá)。當(dāng)HR-HPV持續(xù)感染，而將E7癌基因整合至宮頸上皮細(xì)胞時(shí)，E7蛋白高表達(dá)，破壞pRB與E2F的結(jié)合，使其功能受損，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖失調(diào)，p16的過度表達(dá)。有研究[8]認(rèn)為≥99%的宮頸鱗狀上皮內(nèi)高級(jí)別病變及以上組織中p16為陽性，而正常宮頸組織中p16陽性率不到5%。Ki-67是一種標(biāo)志細(xì)胞周期進(jìn)展及增殖期細(xì)胞的核抗原基因，G0期表達(dá)缺失，僅在G1、S、G2期和M期表達(dá)。因此，一般生理機(jī)能正常的細(xì)胞中，p16和Ki-67表達(dá)不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)。p16和Ki-67在同一細(xì)胞中同時(shí)被檢測(cè)到可作為細(xì)胞周期失調(diào)的標(biāo)志[9-11]。有研究將p16/Ki-67雙染檢測(cè)應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)分流[7,12]和HR-HPV分流[13-15]。本研究采用羅氏CINtec PLUS技術(shù)，即p16/Ki-67全自動(dòng)免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法，對(duì)HR-HPV陽性患者進(jìn)行分流。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16/Ki-67與TCT對(duì)HR-HPV陽性受試者宮頸病變檢出率隨宮頸病變病理級(jí)別的增高而上升，與相關(guān)研究[16-17]一致。

本研究中，在HR-HPV陽性受試者中，p16/Ki-67與TCT檢出HSIL+病變的特異度和陽性預(yù)測(cè)值相似，但有更高的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值(P<0.05)，與國內(nèi)外研究[18-19]結(jié)果相符。究其原因可能與以下因素有關(guān)：(1)p16/Ki-67免疫細(xì)胞雙染為在細(xì)胞水平進(jìn)行蛋白檢測(cè)，而蛋白的變化較TCT形態(tài)學(xué)的改變更早。(2)p16/Ki-67雙染閱片中識(shí)別異常細(xì)胞時(shí)主要根據(jù)p16/Ki-67的顏色分布，較根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷容易，只要經(jīng)過短期培訓(xùn)即可掌握，且不同的閱片醫(yī)師判斷結(jié)果之間具有較高的符合度。而TCT閱片主要依賴于細(xì)胞形態(tài)，缺乏客觀指標(biāo)，細(xì)胞學(xué)醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)不足或其他主觀因素可導(dǎo)致宮頸癌前病變和宮頸癌的漏診或誤診[20]。此外，細(xì)胞學(xué)檢查醫(yī)生的培訓(xùn)、質(zhì)量控制等都對(duì)醫(yī)療資源需求較大，使其培訓(xùn)難于免疫蛋白染色。

《基于風(fēng)險(xiǎn)的宮頸癌篩查結(jié)果異常的管理共識(shí)》[2]指出：對(duì)于HPV16/18型陽性受檢者，即使細(xì)胞學(xué)陰性，其發(fā)生高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變和隱匿性癌的風(fēng)險(xiǎn)也較高，建議進(jìn)行陰道鏡檢查。根據(jù)指南，本研究比較了3種HPV陽性受檢者的陰道鏡轉(zhuǎn)診策略，HPV16/18陽性直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，HR-HPV其他12陽性且p16/Ki-67雙染陽性以及HR-HPV其他12陽性且TCT陽性轉(zhuǎn)診陰道鏡，發(fā)現(xiàn)HR-HPV其他12陽性且p16/Ki-67雙染陽性轉(zhuǎn)診陰道鏡HSIL+檢出率與HPV16/18陽性直接轉(zhuǎn)診陰道鏡相似，但陰道鏡轉(zhuǎn)診率低且每發(fā)現(xiàn)1例HSIL+所需的陰道鏡轉(zhuǎn)診頻數(shù)更少，因此該策略可以減少醫(yī)療資源浪費(fèi)，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益。該結(jié)果與Wright等[21]和Uijterwaal等[22]的研究相吻合。因此，在細(xì)胞學(xué)醫(yī)師和陰道鏡專業(yè)醫(yī)師缺乏的情況下，用該方法能提高宮頸癌及其癌前病變的檢出率。

綜上所述，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染操作簡(jiǎn)單、結(jié)果容易判讀，具有較好的客觀性和可重復(fù)性。HR-HPV陽性受檢者用p16/ Ki-67分流具有較高應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)于HSIL+病變分流有較高的靈敏度、特異度和較低的陰道鏡轉(zhuǎn)診率。因此，該方法有望成為病理學(xué)和陰道鏡醫(yī)師缺乏地區(qū)HR-HPV陽性婦女宮頸癌及其癌前病變篩查的新方法。本研究對(duì)象為隨機(jī)抽取的門診就診患者，屬于機(jī)會(huì)性篩查，病例相對(duì)較少，須擴(kuò)大HR-HPV陽性受試者p16/Ki-67雙染樣本量，并進(jìn)行多中心、群體篩查來進(jìn)一步證實(shí)該方法的有效性。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。