人臍帶間充質(zhì)干細胞治療肺部疾病的研究與應(yīng)用進展

蔣楊 陳博 王賢君 陳彥昕 朱桐 薛原野 王巧燕 周艷芳

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早起源于早期中胚層，能夠自我更新并具有多向分化的潛能，能在成體骨髓、牙髓、脂肪組織、臍帶等組織中分離[1]。與其他組織來源的MSCs相比，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是從人臍帶的華通氏膠(WJ)、人臍帶血、人臍帶血管周圍組織、羊膜中分離出來的間充質(zhì)干細胞，取材簡單，來源廣泛，基本不受倫理學(xué)的限制，具有免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)能力強、更易體外擴增等特點，同時還具有胚胎干細胞及成體干細胞的優(yōu)點，逐漸成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中最具發(fā)展前景的種子細胞[2]。

目前，hUCMSCs越來越多地被研究和應(yīng)用在治療肺部疾病方面，研究發(fā)現(xiàn)其主要通過以下幾個方面的功能來治療肺部疾病的(如圖1)：(1)歸巢作用：hUCMSCs具有向炎癥或損傷部位歸巢的特點，且經(jīng)靜脈注射后首先歸巢于肺中，能更好地發(fā)揮其治療肺部疾病的作用。(2)抑制炎癥反應(yīng)：hUCMSCs能通過降低炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等和升高抗炎因子如白細胞介素4(IL-4)等減輕肺部炎癥。(3)促組織修復(fù)與再生：hUCMSCs通過分泌功能和分化功能來促進組織修復(fù)與再生。分泌功能主要是分泌生長因子和外泌體，如：表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等，這些因子在調(diào)節(jié)組織損傷修復(fù)與再生的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。分化功能主要是hUCMSCs可分化為Ⅰ型、Ⅱ型肺泡細胞，修復(fù)損傷的肺組織。(4)免疫調(diào)節(jié)：hUCMSCs能通過改變樹突狀細胞(DCs)、T細胞、自然殺傷(NK)細胞分泌的細胞因子，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的抗炎和耐受表型，對免疫排斥和炎癥起著調(diào)節(jié)作用。(5)作為基因、因子傳遞載體：hUCMSCs能攜帶相應(yīng)基因在相應(yīng)部位高效地表達，在放大藥物作用的同時減少多種毒副作用，如能攜帶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)、血管生成素1(Ang1)、干擾素-β(IFN-β)等。因此，本文對hUCMSCs在治療肺部疾病的研究與應(yīng)用進展方面進行綜述。

圖1 hUCMSCs的功能及作用特點

hUCMSCs治療急性肺損傷

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由創(chuàng)傷、輸血、感染等多種因素所導(dǎo)致的急性進行性呼吸功能不全或者呼吸衰竭癥狀，是臨床上較為常見的危重癥之一，病死率較高。炎癥反應(yīng)和肺組織損傷是ALI的發(fā)病基礎(chǔ)。肺泡巨噬細胞是呼吸道的重要防線，也是損傷時的主要效應(yīng)細胞，hUCMSCs能誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化，而M2型巨噬細胞可減輕炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)和再生，從而有效緩解ALI。其作用機制有研究報道是通過PGE2途徑誘導(dǎo)[3]的，還有研究報道是通過旁分泌作用調(diào)節(jié)的，如分泌的核心蛋白聚糖(DCN)可通過CD44誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化[4]，又如分泌正五聚蛋白3(PTX3)，增強巨噬細胞向M2型極化，還提示PTX3是預(yù)測hUCMSCs治療炎癥性疾病的潛在標記物，使用PTX3進行質(zhì)量控制，有助于提高hUCMSCs的治療效果。

在ALI中還涉及到多種信號通路的激活和抑制，靶向調(diào)控ALI中的信號通路，有可能成為新的治療途徑。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)通路，在機體炎癥反應(yīng)過程中起核心作用，hUCMSCs能降低血漿促炎因子水平，顯著抑制CyPA的表達，阻斷NF-κB通路而減輕ALI[5]。

近年來，越來越多的研究表明，來自hUCMSCs的外泌體(hUCMSCs-EXOs)在ALI中發(fā)揮了有益的作用。外泌體是一種小囊泡，通過傳遞RNA、蛋白質(zhì)和miRNAs37在細胞通訊中發(fā)揮重要作用。它衍生的miR-451也能抑制TLR4/NF-κB通路，降低炎癥因子水平，減輕ALI[6]。hUCMSCs還能抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路，減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，從而減輕ALI[7]。hUCMSCs還能通過抑制肺組織同源蛋白3(TRB3)mRNA的表達，減輕ALI的炎癥反應(yīng)[8]。

將hUCMSCs作為某些基因、細胞因子等的載體用于治療ALI，也是較為有效的治療方式。攜帶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)基因的hUCMSCs尾靜脈注射移植能有效降低ALI大鼠肺部中性粒細胞浸潤和總蛋白滲出，改善血管通透程度，降低肺組織中促炎因子水平，提升抗炎因子IL-4及ACE2的表達，從而減輕ALI大鼠病理損傷程度[9]。攜帶血管生成素1(Ang1)基因的hUCMSCs也能改善ALI的全身炎癥反應(yīng)和肺泡通透性[10]。核心蛋白聚糖(DCN)修飾的hUCMSCs可明顯減輕放射性肺損傷的急性炎癥反應(yīng)，明顯抑制后期纖維化，其機制可能是通過誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)的表達，抑制肺組織Ⅲ型膠原α1的表達，降低調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)來增強的hUCMSCs的功能[11]。高表達趨化因子受體4(CXCR4)的hUCMSCs不僅改善了肺組織病理學(xué)改變，通過降低輻射誘導(dǎo)的外周血基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原和E-鈣黏素(E-cadherin)的表達，增強hUCMSCs對放射性ALI的保護作用[12]。高表達超氧化物歧化酶2(SOD2)的hUCMSCs能降低支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白水平，下調(diào)肺組織中NF-κB p65和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表達，上調(diào)SOD1、SOD2、血紅素氧合酶-1(HO-1)和核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達，有效地減輕了大鼠ALI[13]。

hUCMSCs治療肺癌

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，最常見的組織學(xué)類型是肺腺癌，占肺癌患者的50%。hUCMSCs是治療實體腫瘤的潛在工具，然而，hUCMSCs在肺癌的研究卻有許多相反的報道。有不少研究從不同方面報道hUCMSCs有促進肺癌細胞增殖的作用。肖恒等[14]發(fā)現(xiàn)在荷瘤動物實驗中hUCMSCs會發(fā)生自我惡性轉(zhuǎn)化，并促進肺腺癌A549細胞移植瘤的生長與轉(zhuǎn)移，其機制尚不明確。在異種移植瘤模型中，hUCMSCs衍生的胞外小泡(hUCMSCs-EVs)能直接作用于肺腺癌細胞，促進肺腺癌細胞的生長[15]。體外實驗也發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs在缺氧條件下能使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和生存素(Survivin)表達上調(diào)，從而使肺腺癌A549細胞的增殖和遷移能力增強。

但也有不少研究表明hUCMSCs能誘導(dǎo)肺癌細胞的凋亡。袁哲等[16]證實hUCMSCs能抑制PI3K/AKT信號通路而抑制肺腺癌A549細胞的增殖，促進細胞凋亡。hUCMSCs還能抑制肺癌細胞H1299侵襲，誘導(dǎo)H1299細胞凋亡，但對H1299細胞增殖和細胞周期進程無明顯影響[17]。還有研究[18]發(fā)現(xiàn)hUCMSCs能與肺腺癌A549細胞發(fā)生融合，將A549細胞阻滯在G0/G1期，減弱了A549細胞的遷移能力，并通過下調(diào)B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶7(Caspase-7)前體、β連環(huán)蛋白(β-catenin)和人髓細胞增生原癌基因(C-myc)，上調(diào)酪氨酸蛋白激酶A5受體(Eph A5)，誘導(dǎo)其凋亡。

目前研究發(fā)現(xiàn)將hUCMSCs作為抗癌藥物的靶向載體，攜帶某些基因、細胞因子及趨化因子等作用于腫瘤，是較為有效的新的治療手段。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的優(yōu)點。在TRAIL蛋白N末端增加肺表面活性蛋白-D(SPD)結(jié)構(gòu)域，使其形成十二聚體結(jié)構(gòu)，增強抗腫瘤活性及穩(wěn)定性，攜載SPD-TRAIL基因的hUCMSCs可以穩(wěn)定的高表達TRAIL蛋白，并對肺腺癌A549細胞有顯著的抑制增殖和促凋亡作用[19]。還有研究在可溶性TRAIL(sTRAIL)的N端加上異亮氨酸拉鏈(ISZ)，可生成三聚體TRAIL(ISZ-sTRAIL)，增強其抗腫瘤活性，并通過hUCMSCs，將ISZ-sTRAIL特異性地運送到腫瘤部位，該靶向治療系統(tǒng)在小鼠異種移植模型中顯示出良好的凋亡誘導(dǎo)和抗腫瘤潛能，且無明顯副作用[20]。此外，hUCMSCs負載干擾素-β(IFN-β)基因慢病毒載體，能體外分泌具有生物活性的IFN-β，顯著抑制A549和H226的克隆形成、遷移及增殖能力[21]。但是，hUCMSCs作為基因、細胞因子等的載體，其效率和穩(wěn)定性也需更深入的研究。

hUCMSCs治療肺纖維化

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)大量沉積并伴有彌漫性炎癥、肺組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。PF的逆轉(zhuǎn)需要抑制炎癥、促進膠原降解和刺激肺泡再生，而hUCMSCs不僅能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，還能合成和釋放透明質(zhì)酸，促進肺再生，已被廣泛研究，并應(yīng)用于臨床試驗中。目前，很多實驗研究向著優(yōu)化治療效果方面探討，如重復(fù)給藥，聯(lián)合用藥等。有研究[22]發(fā)現(xiàn)大劑量移植hUCMSCs能顯著修復(fù)大鼠PF，改善了血氧飽和度水平和呼吸頻率。進一步發(fā)現(xiàn)，其能逆轉(zhuǎn)肺泡損傷，減少細胞浸潤，改善膠原沉積，減少了肺炎癥上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進了巨噬細胞基質(zhì)金屬肽酶-9(MMP-9)與Toll樣受體-4(TLR-4)的表達和膠原降解，促進肺泡再生。在共培養(yǎng)研究中，hUCMSCs升高肺巨噬細胞MMP-9水平，釋放透明質(zhì)酸到培養(yǎng)液中，并刺激肺泡上皮中TLR-4的表達。該研究還發(fā)現(xiàn)移植后1個月，大鼠肺內(nèi)的hUCMSCs仍然存活，并分泌細胞因子，未分化為肺泡或血管上皮細胞。該結(jié)果證明移植的hUCMSCs在大鼠肺內(nèi)長期存活，并能有效逆轉(zhuǎn)大鼠肺間質(zhì)纖維化。陳志軍等[23]針對一次性使用hUCMSCs治療PF的局限性，設(shè)計了不同時間點，4次重復(fù)給藥治療大鼠矽肺PF，發(fā)現(xiàn)無論在以肺泡炎為主的階段還是在以纖維化為主的階段進行治療，均有抗纖維化效果，能有效減輕矽塵導(dǎo)致的大鼠PF，其機制可能是通過下調(diào)TGF-β1、IL-6的水平實現(xiàn)。吳羨等[24]經(jīng)尾靜脈注射hUCMSCs聯(lián)合低劑量吡非尼酮(PFD)灌胃治療小鼠PF，結(jié)果顯示，hUCMSCs聯(lián)合PFD明顯延長了小鼠的生存時間，肺部蜂窩樣改變明顯減少，肺內(nèi)膠原沉積減低，肺纖維化標志物Col1a1、Col1a2水平顯著降低，抑制肌成纖維細胞(MFB)增殖，而且聯(lián)合用藥后，低劑量的PFD能發(fā)揮優(yōu)于其3倍甚至10倍劑量的抗纖維化作用，提示hUCMSCs與PFD聯(lián)合療法，既可增強PFD抗纖維化療效、又可降低PFD的用量，減少不良反應(yīng)發(fā)生率，增強PF患者的耐受性與依從性。還有研究[25]表明hUCMSCs外泌體(hUCMSCs-EXOs)可抑制小鼠PF的發(fā)展，顯著降低PF小鼠的肺系數(shù)、改善肺組織切片膠原沉積和肺組織病理變化，其機制是通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路激活的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而緩解小鼠肺纖維化程度，且在造模后第2天給藥時抑制作用更為明顯。

臨床上使用hUCMSCs治療PF也不乏報道，譙智慧等[26]用hUCMSCs治療8例放射性肺纖維化(RPF)患者，結(jié)果表明是安全和有效的，能夠減輕患者的臨床癥狀和降低肺纖維化密度，對患者的肝腎等主要臟器無損害，其機制可能是通過降低TGF-β1水平抑制纖維化的形成。還有研究[27]報道了用hUCMSCs治療正在接受長期氧療的重癥特發(fā)性肺纖維化(IPF)1例，患者接受hUCMSCs靜脈輸注，隨訪12個月，在移植前后都進行了臨床和運動測試，以及生活質(zhì)量的問卷調(diào)查，12個月結(jié)束時，患者在體能、生活質(zhì)量和呼吸參數(shù)方面均有改善，表明hUCMSCs靜脈輸注對IPF患者是有益的。

hUCMSCs治療新冠肺炎

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19，簡稱新冠肺炎)是由新型冠狀病毒2019-nCoV感染引起的傳染性疾病。國內(nèi)外新冠肺炎的細胞治療主要集中在間充質(zhì)干細胞(MSCs)和自然殺傷(NK)細胞上。應(yīng)用最多的是MSCs，其中hUCMSCs具有強大的雙向免疫調(diào)節(jié)功能和抑制炎癥反應(yīng)，能抑制新冠肺炎引發(fā)的細胞因子風(fēng)暴，且不表達血管緊張素轉(zhuǎn)換酶受體Ⅱ而對冠狀病毒天然免疫，為臨床治療新冠肺炎奠定了基礎(chǔ)。國內(nèi)首次[28]及連續(xù)[29-30]報道了使用異體hUCMSCs聯(lián)合抗病毒等方法治愈4例新冠肺炎重癥患者，2例進行了3次靜脈輸注，3 d 1次，1例每次5×107個細胞，1例每次1×106個細胞/kg，另外2例進行了2次靜脈輸注，隔間5d，按1×106個/kg體重的劑量，均以40滴/min的速度靜脈滴注細胞。治療結(jié)果顯示，靜脈輸注hUCMSCs能降低新冠肺炎患者炎癥因子IL-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血清膽紅素等指標的水平，白細胞和中性粒細胞數(shù)量下降，淋巴細胞數(shù)量上升，中性粒細胞/淋巴細胞的比值持續(xù)下降，并指出中性粒細胞/淋巴細胞比值是能反映新冠肺炎患者炎癥狀況好轉(zhuǎn)的更顯著指標[31]；同時，T細胞、NK細胞和B細胞的絕對值持續(xù)上升，CT影像結(jié)果顯示肺部的炎癥反應(yīng)明顯減輕，新型冠狀病毒核酸檢測連續(xù)2次陰性，最終達到治愈標準出院，隨訪1個月未見不良反應(yīng)。而近期的一項Ⅰ期臨床試驗結(jié)果也表明[32]，中重度新冠肺炎患者靜脈輸注hUCMSCs是安全的，耐受性良好。

目前，國內(nèi)多個省市的醫(yī)療和科研機構(gòu)都先后開展了hUCMSCs治療新冠肺炎的相關(guān)臨床研究，如湖北省的《人臍帶間充質(zhì)干細胞治療新型冠狀病毒重癥肺炎的臨床研究》、湖南省的《臍帶間充質(zhì)干細胞治療新型冠狀病毒肺炎關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)與臨床應(yīng)用示范》等，表明了hUCMSCs在新冠肺炎的治療方面具有良好的臨床應(yīng)用前景，但受限于樣本量小、隨訪時間短等因素，還需要進行長期隨訪的Ⅱ/Ⅲ期隨機對照雙盲試驗，以評估hUCMSCs在減少重癥新冠肺炎患者死亡和改善長期治療結(jié)果方面的治療作用，同時在臨床試驗設(shè)計方面還需考慮到受試者選擇、安全性和療效評價及風(fēng)險控制等問題。

hUCMSCs治療慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種慢性炎癥過程和蛋白酶-抗蛋白酶失衡，主要由香煙煙霧引起，導(dǎo)致氣流受限和肺泡破壞，發(fā)病率和死亡率都很高。動物實驗研究表明hUCMSCs對香煙煙霧誘發(fā)的COPD動物模型有療效，能減輕肺部炎癥，使肺組織中CXCL1/KC和MMP-12降低，血清IL-17A、TNF-α和IL-1β也明顯降低。一項臨床試驗表明[33]，同種異體hUCMSCs移植治療20名中重度COPD患者是安全的，能降低COPD評估測試和加重次數(shù)，顯著改善他們的生活質(zhì)量，并隨訪6個月，為后續(xù)的細胞治療研究提供了基礎(chǔ)。但針對上述臨床試驗的一項評論[34]卻指出該試驗與另外三個“失敗”的臨床試驗有著相似的臨床結(jié)果，就是COPD患者的肺功能沒有明顯改善。因此，只有通過嚴格的對照試驗才能確定MSCs特定細胞類型對治療COPD的適宜性和有效性。而MSCs是否能夠在COPD患者中實現(xiàn)氣體交換的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，以及通過何種機制，仍需進一步研究。

hUCMSCs治療肺發(fā)育不良

支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產(chǎn)兒常見的慢性肺部疾病，死亡率較高。hUCMSCs具有強大的免疫調(diào)控能力和多向分化能力，能自體移植及同種異體移植，降低異體移植的風(fēng)險。動物實驗證明[35]尾靜脈注射hUCMSCs對高氧誘導(dǎo)新生大鼠BPD模型有治療作用，大鼠氧依賴得到緩解，肺泡結(jié)構(gòu)明顯改善。還有研究表明[36]hUCMSCs能改變BPD大鼠肺組織DNA甲基化水平來減輕肺組織的炎癥反應(yīng)和修復(fù)損傷肺組織，主要是通過降低Cldn18和Lep的甲基化水平來實現(xiàn)的。目前，hUCMSCs在臨床上治療BPD已取得了一定的效果[37]。國外的Ⅰ期臨床試驗[38]表明氣管內(nèi)注入hUCMSCs治療BPD，具有較好的療效，肺泡灌洗液中炎癥因子水平顯著降低，隨訪至84d無不良反應(yīng)出現(xiàn)。Ⅱ期臨床試驗[39]表明氣管內(nèi)注入hUCMSCs是安全的，出院后均無需接受氧療，隨訪至糾正年齡2歲時未出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等不良反應(yīng)。國內(nèi)的一項臨床研究也表明[40]，在患兒出生后7d、14d分別給予氣管內(nèi)滴入hUCMSCs 1×107個/2mL生理鹽水，治療后MIF、CD105、TGF-β1、IL-8等細胞因子水平明顯降低，保護性細胞因子PLTP 則明顯升高，而平均住院時間、用氧時間及1歲內(nèi)發(fā)生肺炎的機率明顯低于對照組，出生后28d內(nèi)的體質(zhì)量增長，明顯高于對照組，提示使用hUCMSCs防治BPD安全有效、值得推廣。但還是需要更多的多中心、大規(guī)模的臨床試驗來證實其安全性和有效性。

結(jié) 語

目前的研究表明，hUCMSCs通過歸巢作用、抑制炎癥反應(yīng)、損傷組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)及作為基因、因子傳遞載體來治療肺部疾病的。雖然目前對hUCMSCs的作用機制的研究還不夠深入，但其治療肺部疾病的有效性和安全性已在相關(guān)的基礎(chǔ)研究、臨床前和臨床試驗中得到了初步的驗證，具有較好的研究價值和應(yīng)用前景。但在臨床應(yīng)用中仍要注意一些問題，如移植的最佳劑量，接受移植的最佳時間，以及注射速率、移植頻率及長期移植的副作用等，需要進一步地深入研究探討。