多重熒光PCR技術(shù)在診斷兒童急性呼吸道感染中的應(yīng)用

羅丹 吳佳玲 周前選 潘建華

急性呼吸道感染(acute respiratory infection, ARI)是最常見的兒童急性傳染病,也是引起免疫功能不全的重要病因[1]，其中由呼吸道感染引發(fā)的死亡是世界十大死因中的第三位(5.9%)，因其感染導致為嚴重疾病已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[2]。引起兒童ARI 的病原體種類較多,涉及多種病毒和細菌，臨床癥狀相似[3-4]，臨床醫(yī)生很難從臨床癥狀做出準確的病因診斷，如何快速精準檢測出患者所感染的呼吸道病原體，一直是困擾臨床的難點。

本研究采用多重熒光PCR技術(shù)對常見的呼吸道病原體靶基因進行擴增和分析，并與其它病原體抗原檢測方法進行比較，同時引入基因測序作為金標準進行驗證，分析了多重PCR技術(shù)在臨床中的檢測性能和價值，旨在為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集長沙市中心醫(yī)院2019年11月-2020年1月502例具有急性呼吸道感染癥狀患兒咽拭子樣本。臨床癥狀主要為發(fā)熱、白細胞升高或降低、寒顫、體溫降低；咳嗽咳痰、氣短、呼吸音異常；伴有或不伴有胸痛及呼吸困難，查體呼吸音粗糙伴有或不伴有濕性啰音，胸部X片或胸部CT掃描等影像學提示呼吸道感染。

二、方法

1 標本收集 收集呼吸道咽拭子樣本, 置于相應(yīng)的無菌樣本收集管內(nèi)立即送檢。不能立即檢測的標本編號后，置標本保存液中-70℃冷凍保存待檢。

2 儀器和試劑 ABI3730測序儀及配套試劑，上海宏石全自動醫(yī)用熒光定量PCR分析系統(tǒng)，多重PCR聯(lián)合檢測試劑盒(蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司)，七項呼吸道病毒檢測試劑盒(美國海德診斷有限公司)，甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒(廣州萬孚生物技術(shù)有限公司)。

3 多重PCR檢測 多重PCR檢測嚴格按試劑說明書要求進行標本的采集、轉(zhuǎn)運、存儲、處理、核酸提取、擴增、結(jié)果的軟件分析，檢測完成后，對期間產(chǎn)生的垃圾廢物及廢棄標本，嚴格按生物安全要求進行無害化處理。檢測的14種病原體包括：甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)、人副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV)、鼻病毒(RV)、冠狀病毒(COV)、人偏肺病毒(hMPV)、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌(HI)、肺炎鏈球菌(Strep)、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體。

4 呼吸道病原抗原檢測 呼吸道七項病毒和甲乙流抗原檢測嚴格按照試劑說明書進行，操作規(guī)范，對多種病原體進行檢測和結(jié)果分析。

5 呼吸道病原體測序 取300 μL樣本進行核酸提取，提取的核酸溶解于200 μL DEPC水中。150uL提取的核酸，用Takara逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄(48℃ 20 min，95℃ 5 min)；用20 μL對呼吸道病原體測序引物，分別對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增，PCR擴增試劑為諾唯贊的Green PCR mix，PCR條件為95 ℃ 2 min預變性，之后95℃ 20 s，60℃ 40 s進行50個循環(huán)的擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，如某病原體沒有相應(yīng)大小的擴增產(chǎn)物，直接判讀該病原體陰性；如某病原體有相應(yīng)大小的擴增產(chǎn)物，則將該擴增產(chǎn)物用Applied Biosystems 3730進行測序，并將正/反向測序結(jié)果在NCBI上做BLAST分析，如正/反向測序結(jié)果有1個與該病原體相符，則判讀該病原體陽性，如正反向測序結(jié)果均與該病原體不符，則判讀該病原體陰性。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05，有統(tǒng)計學意義。計算Kappa統(tǒng)計量對兩種方法間的一致性的進行評價，Kappa<0.4,表明一致性較差；0.40.80時，表明有極好的一致性。

結(jié) 果

一、患兒基本情況

本次收集的是2019年冬季新冠疫情發(fā)生前后的ARI患兒，共502例，年齡中位數(shù)為4歲(2～7歲)，男性258例，陽性者占62例，比例為24.03%；女性244例，陽性者占56例，比例為22.95%。男女陽性率比值為1.05:1，兩者陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.032，P=0.857)。

二、多重PCR技術(shù)檢測結(jié)果

在502例樣本中，用多重PCR技術(shù)共檢出10種200株病原體(見圖1)，有118 例至少檢測出一種呼吸道病原體，陽性率為23.50 %。只檢出一種病原體感染的有 61例(占12.20%)，檢出二種或以上感染的有57例(占11.40%)，其中2種病原體混合感染的 33例(占6.60%)、3種及以上病原體感染的 24例(占4.80%)。多重感染中，以甲型流感病毒混合感染肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌鼻、病毒、腺病毒、呼吸道病毒較為常見，其他混合較少。不同病原體在單一感染和混合感染的分布略有不同，按照多重PCR檢測出的病原體分類來分析單一感染和混合感染的情況(見圖2)。

圖1 病原體檢測結(jié)果(n)

圖2 病原體混全感染情況(n)

三、多重PCR檢測技術(shù)與其它呼吸道抗原檢測法的比較

多重PCR技術(shù)檢測與甲型/乙型流感病毒抗原檢測、七項呼吸道病毒檢測等結(jié)果有差異的，用二代基因測序方法確定檢驗結(jié)果。結(jié)果表明：多重PCR檢測與二代基因測序的結(jié)果完全一致，而免疫學方法漏檢率、錯檢率比較高。呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等都有漏檢，還有8例用免疫學方法檢測出的甲型流感病毒，用多重PCR技術(shù)和測序方法均未檢出，后經(jīng)臨床診斷證實此8例均為假陽性。多重PCR技術(shù)與免疫學方法檢測呼吸道病原體的檢出情況，詳細(見表1)。

表1 多重PCR技術(shù)與免疫學方法檢測呼吸道病原體的檢出情況(n)

由表2可見，多重PCR技術(shù)較免疫學方法而言，除甲型流感病毒、乙型流感病毒的檢測一致性好(kappa>0.8)，其它的如肺炎鏈球菌、副流感病毒、鼻病毒、流感嗜血桿菌等的檢測一致性較差。多重熒光PCR技術(shù)檢測的靈敏度等方面要明顯好于免疫學方法，且十四項病原體聯(lián)合檢測可以一份標本檢出多種病原體，具有準確、方便、快速的特點，對臨床后續(xù)治療提供更有力的證據(jù)支持。

討 論

長沙屬于華中地區(qū)，冬季平均氣溫4～12℃，潮濕寒冷導致呼吸道感染頻發(fā)，且起病急、傳播快、感染力強[5]?；純焊腥竞笠蛉狈μ禺愋缘谋憩F(xiàn)，臨床無法明確診斷,而不得不接受廣譜抗生素的治療[6]。早期明確病原學診斷,不僅可以制定精準的治療方案，改善預后,幫助患者快速恢復，還可以減輕痛苦，降低家庭經(jīng)濟負擔等[7]。

表2 多重PCR聯(lián)合檢測與其它免疫方法檢測呼吸道病原體診斷效能

目前，臨床上常用的呼吸道病原體檢測方法是免疫金標法、免疫熒光法、免疫凝集法、培養(yǎng)法等，但一般一次只能檢測一種或兩種病原體。對患兒多次取樣,會造成家長配合度降低。近年來，隨著核酸擴增技術(shù)的迅猛發(fā)展，多重熒光PCR已發(fā)展成熟并應(yīng)用于臨床[8]，廣譜呼吸道病原體的核酸檢測，已成為新的發(fā)展方向。檢出陽性率因感染病原體的種類、患者年齡、季節(jié)、地域等不同有一定差異[9]。

本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)對502例疑似呼吸道感染患兒的樣本進行檢測，陽性樣本達到118例，陽性率為23.5%，與相關(guān)報道一致[10]。單種病原體感染 61例，混合感染57 例，并且以甲型流感病毒、肺炎鏈球菌混合感染為主。檢出的200株病毒中甲型流感病毒的檢出率最高，其次是乙型流感病毒,幾乎占到檢測病原體的75%，與有關(guān)報道類似[11-14]，而與烏魯木齊、成都等地區(qū)有差異[10，15]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，多重熒光PCR技術(shù)與基因測序結(jié)果高度一致，較金標法、熒光法等免疫方法，在靈敏度、特異性、誤診率等分析性能指標上都有優(yōu)勢，尤其傳統(tǒng)免疫方法漏檢率較高、操作十分繁瑣、結(jié)果判讀主觀性強。

綜上所述，呼吸道病原體多重PCR檢測技術(shù)較傳統(tǒng)的檢測手段快速、敏感、簡便、覆蓋面廣，具有更高檢測效率，更真實反映病原體定植增殖狀態(tài)?？焖贉蚀_的篩查手段有利于臨床精準診斷、指導合理用藥，值得在臨床工作中推廣。