新資源可食用微藻的活性物質(zhì)提取及其在食品中應(yīng)用研究進展

胡浩杰，田雙起, ，趙仁勇，張 攀

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州 450001；2.信陽碧園生物科技有限公司，河南信陽 464300）

微藻是一種個體體型微小，生長繁殖速度快的單細胞藻類[1]。目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微藻的種類有十多萬種，其中大多數(shù)微藻生活在海洋湖泊中，約占海洋中生物物種的40%[2]。微藻的生長范圍極其廣泛，在熱帶、溫帶和南北兩極的寒帶都有其生長的痕跡[3]。微藻可以根據(jù)其自身生長所需能量的來源進行分類，有自養(yǎng)型、異養(yǎng)型和混合營養(yǎng)型微藻[4]。大多數(shù)微藻都是自養(yǎng)型的，在有充足的二氧化碳和無機養(yǎng)分的條件下，自養(yǎng)型微藻會通過光合作用來產(chǎn)生一些復雜的有機化合物，如一些蛋白質(zhì)、脂肪以及一些其它的碳水化合物。還有一些藻類是異養(yǎng)型的，不能固定碳只能從外界攝取碳水化合物供自己生長所需[5]。具有自養(yǎng)和異養(yǎng)的雙重性質(zhì)的微藻是混合營養(yǎng)型微藻，這些藻類可以很具自身所處環(huán)境來適應(yīng)異養(yǎng)型條件。

微藻含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，在細胞的生命周期中發(fā)揮重要作用；它們包括簡單的天然染料和一些表現(xiàn)高水平的生物活性營養(yǎng)物質(zhì)。這些營養(yǎng)物質(zhì)被自然包裹在細胞內(nèi)，包括多糖、色素、蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸等[6]。Ljubic 等[7]研究表明，微藻在人工紫外線（UVB）的照射下進行培養(yǎng)，可以產(chǎn)生一種新型的天然維生素D。本文主要從可作為新資源食品的雨生紅球藻、鹽藻、裸藻、蛋白核小球藻四種微藻闡述微藻生理活性物質(zhì)成分、提取方法及其在醫(yī)藥保健和食品中的應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀，以及對未來的期望，旨在為學者研究作為新資源食品的藻類提供參考。

1 微藻的生物活性成分及功能

蛋白核小球藻、雨生紅球藻、鹽藻以及裸藻作為我國公告[8]新批準的四種新資源食品藻類，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素A、蝦青素、多糖、脂質(zhì)、胡蘿卜素、生物素、維生素C、葉酸、核黃素等營養(yǎng)物質(zhì)，很大程度上增加了微藻單細胞的營養(yǎng)價值[9]。

微藻不僅具有獨特生物活性物質(zhì)和廣泛的生理學特性，還具有一定的藥理作用和功能特性。鹽藻含有大量的胡蘿卜素具有很好的營養(yǎng)價值，已有研究證明，此類胡蘿卜素可以有效防癌、抗衰老和增強機體免疫能力[10]。雨生紅球藻富含世界公認最強抗氧化劑之一的蝦青素，其具有很好的抗炎癥和抗細菌感染等作用[11]。蛋白核小球藻含有豐富且優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，是很好的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。微藻中含有的脂質(zhì)也使其成為一種具有很大潛力的生物柴油原材料[12]。

微藻中含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和復合糖可作為各種生物產(chǎn)品的原料[13]。微藻中長鏈不飽和脂肪酸、藻蛋白和色素具有顯著的補充人體營養(yǎng)物質(zhì)的保健功能[14?15]。因此，可以看出微藻在食品，能源、化工等不同領(lǐng)域越來越受重視，這也使得從微藻中提取生物活性物質(zhì)成為現(xiàn)今研究熱點。

2 新資源可食用微藻活性物質(zhì)的提取方法

2.1 雨生紅球藻

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）作為一種單細胞淡水綠藻，其種屬屬于綠藻門、團藻目、紅球藻屬[16]。雨生紅球藻的生長階段一般可以分為兩個階段，第一階段為營養(yǎng)生長階段，第二階段為生產(chǎn)蝦青素階段[17]。這種淡水生物有一個非典型的生命周期，它能在壓力條件下從一個富含葉綠素和蛋白質(zhì)的營養(yǎng)細胞狀態(tài)變?yōu)榘粻顟B(tài)，在這種狀態(tài)下，雨生紅球藻被一層厚厚的細胞壁包裹著，可以產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，包括類胡蘿卜素和蝦青素，尤其是蝦青素在近些年來引起了相當大的關(guān)注[18]。

目前已知并應(yīng)用的提取方法有傳統(tǒng)的萃取方法，如溶劑萃取法（有機溶劑萃取和無機溶劑萃?。A提酸沉法、酶解法等，近些年新型的提取方法有超臨界萃取法、濁點萃取法、離子液體萃取法、超聲輔助萃取、微波輔助萃取，還有幾種方法相結(jié)合的，如低壓超臨界萃取法、超聲輔助酶法提取等[19?23]。由表1可以看出，Mendespinto等[18]對雨生紅球藻的蛋白質(zhì)的提取用的是堿浸提酸沉淀的方法，是將研磨破碎后的細胞用離心機離心后，在堿性的上清液中逐漸加入鹽酸使蛋白質(zhì)沉淀，得到的提取率為73%。而同樣是從雨生紅球藻中提取蛋白質(zhì)，Zhu等[24]則是先將藻粉中的色素去除，然后再進行堿法浸提酸沉淀，這樣得出的提取率可達到81.36%。這樣不僅可以得到更純的蛋白質(zhì)還可以提高其提取率。

雨生紅球藻是最豐富的天然蝦青素的來源之一，因此目前所應(yīng)用的提取活性物質(zhì)最多的是針對蝦青素的提取。如表1所示，吳嬌等[17]采用傳統(tǒng)的提取方法對雨生紅球藻的蝦青素進行提取，先用研磨法對細胞壁進行破碎，然后用乙酸乙酯提取，固液比1:50 g/mL，提取時間為30 min，反復提取三到四次，最后得到的提取率為91.41%。馮以明等[25]選用傳統(tǒng)的溶劑提取法提取雨生紅球藻的多糖，主要是采用乙醇和乙酸乙酯對藻類先進行脫脂處理，然后對多糖提取分離，這樣可以顯著提高多糖提取時的純度。Molino等[26]用安全溶劑丙酮和乙醇做萃取劑方法，研究表明經(jīng)過機械預處理的藻粉在提取時的壓力對最后的得率幾乎沒有影響，而隨著溫度的升高，蝦青素的提取率會逐漸增加，當溫度增加到最大值時，多次提取并且每次提取時間為20 min，最后的總蝦青素提取率可達到99%。近幾年有學者不斷嘗試和發(fā)現(xiàn)用更好更簡單更環(huán)保的方法來提取生物中的活性物質(zhì)。Khoo等[27]就首次嘗試用液體雙向浮選法來提取雨生紅球藻中的蝦青素，液體雙相浮選法是一種結(jié)合溶劑浮選和液體雙相浮選工作原理的氣泡輔助分離系統(tǒng)，液體雙相浮選法由兩個水相組成，目標化合物通過目標化合物在氣泡上的選擇吸附性從一個相萃取到另一個相的過程。由表1可知，提取雨生紅球藻蝦青素的方法還有張曄等[19]的復合酶法、郭文晶等[23]的超高壓法和Cheng等[28]的低壓超臨界萃取法。從表1也可以看出新型的提取方法在提取率上明顯比傳統(tǒng)的提取方法要高，并且在提取速度上也有一定改善，在未來微藻市場的應(yīng)用上會有很大的前景。

2.2 鹽藻

鹽藻（Dunaliella salina）又被稱作杜氏鹽藻，在種屬分類上屬綠藻門、團藻目、鹽藻屬，是一種體積小、生長速度快、有糖蛋白形成的包被的單細胞海洋經(jīng)濟藻類。鹽藻對于極端環(huán)境有極好的耐受性，在高鹽、高光、高溫、低溫下都能生存、生長[29]。鹽藻是迄今為止發(fā)現(xiàn)的β-胡蘿卜素含量最高的生物之一，因此鹽藻中β-胡蘿卜素的積累及提取技術(shù)的研究已成為近些年的研究開發(fā)鹽藻的熱點，并且隨著市場的需求已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化。但是由于目前提取技術(shù)的限制，在提取胡蘿卜素之后的鹽藻藻渣中，依然含有一些如蛋白質(zhì)、維生素、多糖等有用的成。

鹽藻中β-胡蘿卜素的含量豐富，其營養(yǎng)價值越來越受到人們的關(guān)注。孫協(xié)軍等[30]就研究了鹽藻中β-胡蘿卜素的提取及其自由基的清除能力，用丙酮作為萃取劑，料液比為1:250，在40 ℃的條件下微波輔助提取8 min，得到的β-胡蘿卜素的得率為1.13%。如表2所示，Marchal等[31]也研究了用離心分布萃取的方法來提取鹽藻中的β-胡蘿卜素，以5%的二氯甲烷和油脂乙酸的混合液作為萃取劑，最后的得率占總β-胡蘿卜素的65%。Monte等[32]運用膜過濾法對富含β-胡蘿卜素的鹽藻進行濃縮培養(yǎng)，然后使用低剪切離心將其最終濃縮，這樣的提取方法不僅很大程度上降低了提取的成本，還減少了能耗使整個生產(chǎn)過程更加環(huán)保。除此之外，人們還對鹽藻多糖、蛋白質(zhì)以及葉綠體蛋白的提取都有一定的研究，戴軍等[33]用熱堿法提取杜氏鹽藻多糖，先脫去鹽藻的脂質(zhì)和色素，當提取溫度為81 ℃，提取液pH為8.8，提取時間為210 min，料液比為1:16時，最后的藻多糖得率為8.88%。郭金耀等[34]用超聲輔助的提取方法來提取蛋白質(zhì)，先離心得到藻液的沉淀，蒸餾水復溶后，在超低溫反復凍融幾次，然后超聲輔助提取15 min，最后提取的物質(zhì)和鹽藻細胞的比率為40%。

2.3 裸藻

裸藻（Euglena gracilis）在分類學中隸屬于裸藻科、裸藻屬，大多數(shù)生長在富含有機質(zhì)的小型靜水體中，它對不同的溫度適應(yīng)性較強，夏季冬季都能繁殖，夏季大量繁殖時往往會使水域呈現(xiàn)出綠色形成膜狀的水華。裸藻是一種單細胞光合作用綠藻，存在于淡水和海水中，具有動植物的特征，裸藻可以通過鞭毛運動，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等。因此它也被認為是一種功能性的營養(yǎng)補充劑。此外有大量研究表明裸藻的提取物具有抗菌、抗誘變、抗病毒以及抗腫瘤的藥用特性。在2013年，國家衛(wèi)計委發(fā)布新資源食品原料公告，按照有關(guān)規(guī)定，將裸藻批準為新資源食品，它比小球藻更適合做工業(yè)生產(chǎn)原料。

早在1975年我國就已經(jīng)有人對裸藻的活性物質(zhì)的提取進行研究，運用一般脂肪提取的方法來提取含有α-生育酚的脂類，并建議將血色裸藻用作飼養(yǎng)魚和家畜的飼料[35]。常見的多糖提取方法有很多，比如水提醇沉法、酸提法、堿提法超聲輔助、微波輔助、酶輔助提取等[36?37]，但是運用在裸藻提取活性物質(zhì)的研究卻很少。由表2可知，栗曉慶等[38]研究堿法提取裸藻多糖時，先離心后加入無水乙醇出去裸藻內(nèi)的脂質(zhì)，然后在50 ℃的條件下，在0.6 mol/L的氫氧化鈉溶液種提取3 h，處理后粗產(chǎn)品的得率是42.35%。和植物類多糖提取的方法不同，微藻進行提取時往往會先進行研磨或者采用其它的手段將藻類的細胞壁給破碎，這樣有利于活性物質(zhì)的浸出和提高提取率。

表2 鹽藻和裸藻的活性物質(zhì)的提取方法Table 2 Extraction methods of active substances from Dunaliella salina and Euglena

2.4 蛋白核小球藻

世界上現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)小球藻種類約有10個左右，小球藻作為一類普生性單細胞綠藻，其中在我國最常見的就是蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、普通小球藻（Chlorella vulgaris）和橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea），這些小球藻中蛋白核小球藻具有豐富的蛋白質(zhì)，并且具有的營養(yǎng)價值最高[40]。蛋白核小球藻在2012年作為第19號文件被公告批準為新資源食品，讓人們對藻類新資源食品有了更深一步的認識，也使人們越來越意識到藻類資源的重要性。作為新資源食品的蛋白核小球藻是一種高蛋白、低糖、低脂、維生素和微量元素全面的綠色營養(yǎng)源[41]，其提取物中的藻多糖和藻蛋白等活性物質(zhì)已被學者證明具有很好的抗腫瘤、抗病毒感染、抗氧化、抗病原菌及增強機體免疫力的功能[42?43]。這也使蛋白核小球藻逐漸成為近幾年的研究熱點。

蛋白核小球藻作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料來源，學者對提取蛋白核小球藻的活性物質(zhì)也有研究，并將提取的活性物質(zhì)應(yīng)用在食品中。目前國內(nèi)的研究者在對蛋白核小球藻的活性物質(zhì)提取的時候，最難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的是蛋白核小球藻的細胞壁的破碎處理[44]。岳敏等[45]研究表明，使用超聲波的物理手段可以對破壁方法進行優(yōu)化，使其能夠大規(guī)模的生產(chǎn)和提高蛋白核小球藻的利用率。由表3可知，陳藝煊等[46]研究表明，在使用酶法輔助提取蛋白核小球藻的多糖物質(zhì)時，當提取時的料液比為1:30，提取時的時間為93 min，提取酶濃度為2%的時，得到多糖的提取率為6.13%。同時Chen等[43]也采用了超聲輔助的方法對蛋白核小球藻多糖進行提取，通過對蛋白核小球藻多糖的抗氧化分析，得出其多糖具有潛在延長果蠅壽命的功能。桂林等[47]也用了超聲輔助提取的方法研究了葉黃素在蛋白核小球藻的提取，用1:40的料液比在超聲波輔助下破碎兩次，每次破碎時間為5 min。然后離心之后，在甲醇和二氯乙烷的混合溶液中提取，得到的葉黃素提取率占總?cè)~黃素的87.1%。由表3可以看出當用傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法時，蛋白核小球藻的蛋白質(zhì)的提取率只有55.24%，遠低于蛋白核小球藻的總的蛋白含量，而運用超聲、微波等一些物理手段進行輔助提取時，會明顯提升其提取率。在張薇等[48]提出的蛋白核小球藻的發(fā)酵產(chǎn)油脂的方法中，其不僅研究了培養(yǎng)基組成，還對培養(yǎng)條件對細胞的油脂積累的影響做了細致的分析。

表3 蛋白核小球藻活性物質(zhì)的提取方法Table 3 Extraction methods of active substances from Chlorella pyrenoidosa

3 微藻在食品中的應(yīng)用

從人類的歷史進程中可以發(fā)現(xiàn)，人類對食用微藻并不陌生，早在九世紀，非洲就有人食用節(jié)旋藻[51]。而現(xiàn)今微藻通常被作為營養(yǎng)添加劑進行銷售，并稱其為“超級食品”可以用作于制作“時尚”食品的配料。目前已經(jīng)有很多相關(guān)的報道表明了螺旋藻和小球藻等一些其它藻類作為原料用來生產(chǎn)面包、餅干、飲料、保健品、零食、奶昔、蔬菜湯、意大利面和酸奶。微藻添加到食品中可以影響食物的質(zhì)地和口感。Lafarga等[52]研究發(fā)現(xiàn)，適量的添加可食用微藻到面包中可以影響面包的顏色和質(zhì)地，也會使面包具有特殊的風味。隨著人們對微藻的營養(yǎng)保健和藥理作用的深入認識，我國對微藻的開發(fā)和利用也越來越受重視，特別是在最近幾年我國先后公告一些藥食同源的新資源食品，其中有新公告的四種藻類新資源食品如表4所示。這些國家新批準的新資源食品藻類也將變的越來越受人們所重視。

表4 微藻類新資源食品Table 4 Microalgae new resource food

3.1 微藻在保健品中的應(yīng)用

新資源食品藻類因其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、蝦青素、維生素和胡蘿卜素等活性物質(zhì)，具有一定藥理作用的潛力，使其在保健品中的應(yīng)用十分廣泛。目前市場上微藻的藻片和膠囊使世界上主要的微藻類保健產(chǎn)品，其生產(chǎn)設(shè)備簡單，成本低，加工條件溫和且不會破壞微藻內(nèi)的活性物質(zhì)，而廣受加工廠的喜愛[53]。鹽藻中含有豐富的β-胡蘿卜素已經(jīng)被廣泛用于生產(chǎn)天然的著色劑和保健產(chǎn)品。雨生紅球藻中含有豐富天然蝦青素，約占其含量的15%左右。蝦青素作為一種抗氧化劑的天然原料，具有抗衰老和提高機體免疫能力的藥理作用。因此做成的藻片和藻膠囊都很受歡迎。除此之外，微藻還可以作為一種營養(yǎng)口服液來使用，研究已經(jīng)證明小球藻細胞內(nèi)含有一種生物活性成分，稱為綠藻精，屬于植物性生長因子，這種物質(zhì)發(fā)現(xiàn)并成功提取，會使這種含有微藻生長因子的口服液在微藻藻片的市場中占據(jù)一定的份額。

3.2 微藻在面制品中的應(yīng)用

微藻除了可以制作保健食品外，還可以在普通食品中添加應(yīng)用。將微藻及其提取物添加到普通食品中，不僅保留有微藻豐富的營養(yǎng)和生理保健功能，又具有普通食品的色香味。李家泳等[54]研究表明，制作餅干時，在配方中添加1.04%的蛋白核小球藻，餅干具有最高的感官評價，當添加的藻量過少時，制成的餅干顏色過淺、口感欠佳；而添加量過多時，制成的餅干顏色過深，且有很濃的海藻腥味。羅柳茵等[55]研究顯示蛋白核小球藻作為添加劑用來制作面包，當在制作過程中添加0.87%的蛋白核小球藻時，添加有小球藻的面團發(fā)酵效率更高，制作而成的面包具有更好的彈性，并且在色澤、口感和形態(tài)方面都會比沒有添加小球藻制作而成面包要好。小球藻的添加不僅可以有效的延緩面包的老化，而且還延長了面包的貨架期[56]。日本早在上世紀七十年代就已經(jīng)開始研究微藻類的食品，現(xiàn)已經(jīng)研制出可安全食用的綠藻面條，并且已經(jīng)開始批量生產(chǎn)。綠藻面條中微藻添加量在0.1%~1%左右，在面條中加入微藻不僅使其具有獨特的口感風味和顏色，還會使面條的彈性和韌性得到改善。隨著人們對微藻的日益關(guān)注，相信會有更多的人研究并開發(fā)出更多的微藻類面制品。

3.3 微藻在其它食品領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著人們對微藻不斷的開發(fā)利用，微藻目前在飲料行業(yè)也會有所應(yīng)用，龐庭才等[57]研究顯示，以小球藻粉為原材料，采用超聲輔助提取藻多糖，再利用木瓜蛋白酶與中性蛋白酶進行水解藻蛋白，合并濾液后，按照相應(yīng)的配方添加適量的檸檬酸、蜂蜜以及適量的白糖可以調(diào)制成一種小球藻飲品。隨著微藻在日本的發(fā)展和研究，其在本土也曾推出了一種用小球藻釀制的酒，使用小球藻的濾液會使酒在釀造的過程中，對釀酒原料的利用率有很大程度的提高。日本也曾以小球藻的熱水浸提物為主要的原材料，再輔一些適量的蜂蜜和適量的梅汁配置成一種功能性的飲品。除此之外，微藻還可以作為制作糕點、茶、糖果等產(chǎn)品的輔料使用。

4 結(jié)語與展望

目前雖然有很多對微藻活性物質(zhì)提取方法的研究，但大多都停留在傳統(tǒng)萃取方法的基礎(chǔ)上，選擇合適的試劑進行提取。隨著時代的不斷發(fā)展，微藻工業(yè)化的發(fā)展注定向著更自動化更環(huán)保更低能耗的方向發(fā)展，這也說明在微藻提取方面還有著很大的進步空間，使人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)和尋找更加環(huán)保和低能耗的方法來提取微藻的活性物質(zhì)。研究已表明新資源食品藻類在保健產(chǎn)品和面包、面條等主食類產(chǎn)品中均有較好的應(yīng)用，并且新資源食品藻類所具有的豐富活性物質(zhì)使其在功能性食品中必然有著更廣闊的應(yīng)用前景。