姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)改善高脂血癥大鼠心肌細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制

毛永強(qiáng)，周綺云，張馨月，楊洪志,

（1.首都體育學(xué)院研究生部，北京 100191；2.北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100101）

脂代謝異常致高脂血癥是誘發(fā)心肌慢性炎癥反應(yīng)、功能紊亂、結(jié)構(gòu)受損的重要原因[1]。細(xì)胞焦亡作為細(xì)胞程序性、炎性死亡方式，廣泛存在于心血管疾病發(fā)生過程中，抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生與發(fā)展能夠有效抑制炎癥因子的生成和炎癥反應(yīng)，降低組織損傷程度[2]。脂代謝異常誘發(fā)的炎性小體激活可以誘導(dǎo)焦亡發(fā)生，大量釋放炎癥因子，引發(fā)強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，加速心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。適宜強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于高血脂、炎癥等多種心血管危險(xiǎn)因素均具有良好改善作用[3]。高脂飲食易誘發(fā)大鼠高脂血癥的同時(shí)，心肌NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）等焦亡相關(guān)蛋白及相關(guān)炎癥因子表達(dá)大幅升高，心肌組織形態(tài)發(fā)生改變，而有氧運(yùn)動(dòng)可以實(shí)現(xiàn)有效逆轉(zhuǎn)[1]。姜黃素是源自姜黃的多酚類化合物，具有改善細(xì)胞焦亡，抑制炎癥反應(yīng)的潛在作用[4]。但二者單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)能否改善高脂血癥大鼠心肌細(xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)，保護(hù)心臟功能/結(jié)構(gòu)，尚未見報(bào)道。

本研究建立高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型，通過觀察脂代謝相關(guān)指標(biāo)、心肌組織病理學(xué)診斷、心肌損傷標(biāo)志物、心肌炎癥因子及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)等多層次指標(biāo)，探討姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善高脂血癥大鼠心肌細(xì)胞焦亡水平，保護(hù)心臟的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素（curcumin） 純度>95%，寧波中藥制藥股份有限公司（CP20191007）；羧甲基纖維素鈉 純度>99%，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）酶聯(lián)免疫試劑盒 北京華英生物技術(shù)研究所；NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase1）抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）抗體 美國Santa Cruz；5周齡SD大鼠（SPF級(jí)，雄性，180~200 g，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0002）、基礎(chǔ)飼料及高脂飼料（60%脂肪熱量比飼料，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK京2019-0010） 斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

FA2004N電子天平 上海精密儀器有限公司；NR-B17CC型超低溫冰箱 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；電子組織勻漿器 美國Kimble公司；LG 10-3A高速冷凍離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DR-200BS酶標(biāo)分析儀 無錫華衛(wèi)德朗；AU480生化分析儀 美國Beckman；LEICA RM2016病理切片機(jī)德國RM公司；Pannoramic MIDI全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng) 匈牙利3D HISTECH公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)及訓(xùn)練后，將符合實(shí)驗(yàn)要求的50只雄性SD大鼠按體重分為5組（隨機(jī)數(shù)字法），每組10只：普通膳食+安靜組（RDC組）、高脂膳食+安靜組（HDC組）、高脂膳食+姜黃素+安靜組（HDCC組）、高脂膳食+有氧運(yùn)動(dòng)組（HDM組）和高脂膳食+姜黃素+有氧運(yùn)動(dòng)組（HDCM）。實(shí)驗(yàn)過程中，室內(nèi)溫度控制在20~24 ℃，相對(duì)濕度控制在55%~75%，晝夜明暗交替時(shí)間：12/12 h。各組大鼠每天自由攝食飲水；RDC組以普通飼料喂養(yǎng)，其他各組以高脂飼料喂養(yǎng)。第3周起，HDCC和HDCM組根據(jù)文獻(xiàn)[5]及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳劑量為400 g/（kg·d）、體積為5 mL/kg，每次訓(xùn)練前0.5 h灌胃姜黃素溶液（0.5%羥甲基纖維素鈉配成混懸液），每天1次，其余各組均以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；HDM和HDCM組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)[6]，坡度：5°，速度：70%~75%最大攝氧量，運(yùn)動(dòng)時(shí)長：1 h，頻率：1次/d，6 d/w，其他組無任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。干預(yù)持續(xù)時(shí)間：6 w。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材 末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h，烏拉坦適度麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血，室溫自然凝固，待血清出現(xiàn)后4 ℃離心10 min，3000 r/min，分離血清，?20 ℃凍存待測。開腹后，迅速取出心臟，去除非心臟組織后以預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分后，取部分左心室心肌組織剪成小塊后稱取重量，根據(jù)組織重量:體積=1:9的比例置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，隨后充分研磨制成10%的心肌組織勻漿液，5000 r/min離心5 min取上層清液待測。另取部分左心室心肌組織浸入4%多聚甲醛固定液固定，用于心肌組織病理診斷。

1.2.3 血脂水平、心肌損傷標(biāo)志物及心肌細(xì)胞炎癥因子含量的測定 血清甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、肌酸肌酶同工酶MB型（creatine kinase-MB，CK-MB）采用全自動(dòng)生化分析儀測定。心肌IL-1β、IL-18采用酶聯(lián)免疫法用試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.4 心肌組織病理診斷 取經(jīng)多聚甲醛固定心肌組織，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片后HE染色進(jìn)行病理診斷。

1.2.5 免疫組化法檢測心肌組織相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平 免疫組化法檢測心肌NLRP3、ASC、caspase-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、一抗和二抗孵育、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、封片。數(shù)字掃描儀進(jìn)行斷面全景掃描，計(jì)算組織化學(xué)評(píng)分[7]：細(xì)胞核陽性由強(qiáng)至弱依次為深棕、棕黃、淺黃，藍(lán)色為陰性。H-score=（淺黃色細(xì)胞密度×1）+（棕黃色細(xì)胞密度×2）+（深棕色細(xì)胞密度×3）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，將HDC組、HDCC組、HDM組及HDCM組大鼠血清和心肌相關(guān)生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)納入分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠血脂水平的影響

長期高脂飲食會(huì)破壞脂質(zhì)代謝，誘發(fā)高脂血癥，主要表現(xiàn)為血脂水平異常。Zhao等[8]表明，有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效改善血脂代謝，防控高脂血癥的發(fā)生與發(fā)展。姜黃素具有良好的抗氧化和降血脂特性。Saker等[9]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以有效改善長期黃油飲食小鼠脂代謝紊亂及對(duì)器官結(jié)構(gòu)的有害影響?？茖W(xué)運(yùn)動(dòng)和合理營養(yǎng)是健康的兩大支柱，二者的聯(lián)合干預(yù)能夠有效改善高脂血癥，保護(hù)相關(guān)器官功能和結(jié)構(gòu)。張亞莉等[10]研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和大蒜素均可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，且兩者具有協(xié)同效應(yīng)，聯(lián)合干預(yù)效果最佳。劉靜等[11]研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹皮酚干預(yù)能夠明顯改善由高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖伴脂質(zhì)代謝紊亂，能夠降低肝臟指數(shù)，有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝緩解脂肪蓄積，效果優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)。

在本研究中，為期8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與RDC組相比，HDC組血清TC、TG、LDL-C均極顯著升高（P<0.01）；與HDC組相比，HDCC、HDM、HDCM組血清TC、TG均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組血清TC較HDCC、HDM顯著降低（P<0.05或P<0.01）；HDCM組與HDCC組、HDM組間血清TG無顯著性差異（P>0.05）。對(duì)于血清LDL-C水平，與HDC組相比，HDCC組、HDCM組顯著降低（P<0.05或P<0.01），HDM組與HDC組間無顯著性差異（P>0.05）；HDCM組較HDCC組、HDM組均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。對(duì)于血清HDL-C水平，HDC組較RDC組顯著降低（P<0.05）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；HDCM組較HDM組極顯著升高（P<0.01），與HDCC組無顯著性差異（P>0.05，表1）。基于相關(guān)文獻(xiàn)及以上結(jié)果說明，8周高脂飲食誘發(fā)大鼠高脂血癥，血脂水平異常；姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效改善大鼠血脂水平，其中聯(lián)合干預(yù)效果最佳，與相關(guān)研究較為一致。

表1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on blood lipid of high-fat diet rats

2.2 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌損傷標(biāo)志物及心肌細(xì)胞炎癥因子含量的影響

脂代謝紊亂是誘發(fā)心肌慢性炎癥反應(yīng)的重要原因之一。有氧運(yùn)動(dòng)具有良好的抑炎作用，可以有效地抑制炎癥誘發(fā)的心肌損傷，保護(hù)心臟。Chen等[1]研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)降低高脂飲食大鼠血脂水平的同時(shí)可以通過減少炎癥、纖維化和凋亡來逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)早期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可以下調(diào)阿霉素引發(fā)的炎癥反應(yīng)，降低CK-MB水平，改善心肌形態(tài)及功能。姜黃素亦可通過抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)心臟。Zeng等[13]研究發(fā)現(xiàn)8周50 mg/kg姜黃素干預(yù)可以有效降低高脂飲食小鼠心肌炎癥及細(xì)胞凋亡水平，改善心肌形態(tài)。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗冠狀動(dòng)脈微栓塞心肌損傷的作用，其作用機(jī)制與抑制心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。何柳[15]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)較二者單獨(dú)干預(yù)能夠更為有效地降低血液及心肌炎癥因子水平，延緩炎性衰老，保護(hù)心臟。

本研究中，為期8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)于心肌IL-1β、IL-18含量，HDC組較RDC組均極顯著升高（P<0.01）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組較HDCC、HDM組顯著降低（P<0.05或P<0.01）。對(duì)于心肌損傷標(biāo)志物CK-MB，HDC組較RDC組均極顯著升高（P<0.01）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組較HDCC、HDM顯著降低（P<0.01，表2）。以上結(jié)果說明，8周高脂飲食誘發(fā)大鼠高脂血癥的同時(shí)，引發(fā)心肌炎癥反應(yīng)及損傷；姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效改善炎癥反應(yīng)及損傷程度，其中聯(lián)合干預(yù)效果最佳，與相關(guān)研究較為一致。

表2 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌損傷標(biāo)志物及心肌細(xì)胞炎癥因子含量的影響Table 2 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on myocardial injury markers and inflammatory factors of high-fat diet rats

2.3 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌組織形態(tài)的影響

各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察顯示（圖1），RDC組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，細(xì)胞排列規(guī)律，境界清楚。HDC組大鼠心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞肥大，著色不均，可見明顯淋巴細(xì)胞聚集，提示有慢性炎癥變化。HDCC、HDM、HDCM組大鼠心肌纖維排列較整齊，細(xì)胞形態(tài)較完整，偶見心肌纖維腫脹和輕度淋巴細(xì)胞聚集，較高脂飲食組明顯改善，其中聯(lián)合干預(yù)組改善情況最顯著。以上結(jié)果表明，8周高脂飲食誘發(fā)大鼠心肌炎性損傷；姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效改善損傷程度，其中聯(lián)合干預(yù)效果最佳。

圖1 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌組織形態(tài)的影響（HE，400×）Fig.1 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on myocardial microstructure of high-fat diet rats （HE, 400×）

2.4 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞焦亡在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[2]，其以細(xì)胞溶解和大量炎性細(xì)胞因子釋放為特征。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和Caspase-1等組成。NLRP3炎癥小體激活可生成具有活性的Caspase-1，而Caspase-1不僅能促進(jìn)IL-1β的成熟和釋放，還可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[16]。NLRP3的激活與飲食和運(yùn)動(dòng)有著明顯的交互作用。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以有效抑制阿霉素誘發(fā)的心肌細(xì)胞焦亡，保護(hù)心臟功能/結(jié)構(gòu)損傷。Yin等[4]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過下調(diào)NLRP3、Caspase-1表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡，改善新生大鼠壞死性微小結(jié)腸炎。趙金理[18]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以姜黃素干預(yù)可以顯著抑制氧化三甲胺誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中焦亡相關(guān)分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β的過度表達(dá)，且具有濃度效用。卞學(xué)鵬等[19]研究發(fā)現(xiàn)12周有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著降低胰島素抵抗小鼠海馬細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白及炎癥因子表達(dá)。Chen等[1]研究亦發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以改善高脂血癥大鼠心肌焦亡及炎癥反應(yīng)。

本研究中，為期8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)（H-score），HDC組極顯著高于RDC組（P<0.01），HDCC組、HDM組、HDCM組顯著低于HDC組（P<0.05或P<0.01），其中NLRP3、ASC、Caspase-1，HDCM組顯著低于HDCC組、HDM組（P<0.05或P<0.01，表3，圖2）。以上結(jié)果表明，細(xì)胞焦亡參與了高脂血癥大鼠心肌損傷過程；姜黃素可能通過阻斷NLRP3的組裝和活化，抑制焦亡相關(guān)分子ASC、Caspase-1、IL-1β的過度表達(dá)[4,17?18]；有氧運(yùn)動(dòng)可能通過改善高脂飲食誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，降低NLRP3炎癥小體自身及其上下游相關(guān)分子改善焦亡[1,19?20]。聯(lián)合干預(yù)效果最佳。

圖2 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂大鼠心肌焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（IHC，400×）Fig.2 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on expression of myocardial pyroptosis related proteins of high-fat diet rats（IHC，400×）

表3 姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)高脂飲食大鼠心肌焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（H-score）Table 3 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on expression of myocardial pyroptosis related proteins of high-fat diet rats (H-score)

3 結(jié)論

本研究中，8周高脂飲食誘發(fā)大鼠高脂血癥的同時(shí)，心肌細(xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)加劇，心肌組織出現(xiàn)炎性損傷并出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常。姜黃素和/或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可以抑制焦亡相關(guān)因子的過度表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用，其中以聯(lián)合干預(yù)效果最佳。