馬齒莧降尿酸及腎臟保護(hù)作用的研究

呂有為，潘昱辰，孫銘鍵，姚 航，王曼力，杜培革，安麗萍

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林 132000）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是一種常見的代謝性疾病，最常見的病因是尿酸（Uric acid，UA）分泌過多和（或）排泄不足[1]。眾所周知，高尿酸血癥是痛風(fēng)的潛在危險因素，也是糖尿病[2]、高血壓[3]、動脈粥樣硬化[4]和腎臟疾病[5]等多種代謝疾病的危險因素。近年來，由于過量食用富含嘌呤的食物，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)上升。美國健康與營養(yǎng)調(diào)查（NHANES）在2015~2016年進(jìn)行的研究顯示，美國男性和女性高尿酸血癥的患病率分別為20.2%和20.0%[6]。據(jù)報導(dǎo)，中國大陸高尿酸血癥患病率為17.4%[7]。因此，高尿酸血癥已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重影響患者的生活，造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，值得全球關(guān)注。臨床常用的治療高尿酸血癥的藥物多為西藥，如果長期服用會導(dǎo)致胃腸道損傷、肝腎損傷等副作用[8]。因此研發(fā)安全、有效、副作用小，可長期服用的中藥迫在眉睫。

馬齒莧（Portulaca oleraeea，PO）別名五行草、長壽菜，是我國101種藥食同源的野生植物之一[9]。具有食用和藥用雙重價值[10]。有相關(guān)研究證實(shí)馬齒莧具有降血糖、抑菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種功能[11]，而對高尿酸血癥的研究卻未見報道。痛風(fēng)在中醫(yī)屬“痹癥”范疇[12]，本課題在前期工作中擬以篩選清熱利濕化瘀的中藥，發(fā)現(xiàn)了PO的降尿酸作用，因此以PO為研究對象，對PO進(jìn)行提取及純化，考察PO的降尿酸作用，進(jìn)而發(fā)掘PO對高尿酸血癥的治療作用，為PO后續(xù)研究及成藥提供了基礎(chǔ)理論以及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬齒莧中藥飲片 ?？抵兴庯嬈庸す荆籗PF級雄性ICR小鼠 體重20.0±2.0 g，50只，實(shí)驗(yàn)動物許可證編號為SCXK（吉）-2016-0003，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司；BCA蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）試劑盒 南京建成生物制品研究所；血尿酸（serum uric acid，SUA）、尿尿酸（urine uric acid，UUA）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）試劑盒上海酶聯(lián)生物科技有限公司；次黃嘌呤、氧嗪酸鉀、別嘌呤醇 美國Sigma公司；多聚甲醛、蘇木素精、硫酸鋁鉀、伊紅、冰醋酸、麗春紅G、酸性品紅、中性樹膠、磷鉬酸 上?；瘜W(xué)試劑公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多有限公司；Milli-Q純水機(jī) 美國Millipore公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；THC-20B超聲波提取機(jī) 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；SHB-B型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計 島津國際貿(mào)易有限公司；GZX-9140ME數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；光學(xué)顯微鏡 日本 Olympus公司；5430R低溫高速離心機(jī) 美國Eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Infinite M200型全波段酶標(biāo)儀 瑞士Tecan 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬齒莧提取物的制備 稱量5 kg馬齒莧干品，粉碎，料液比1:10加入pH=5鹽酸溶液，利用超聲波提取器，溫度50 ℃提取，每次100 min[13]。抽濾，合并提取液，加氨水調(diào)pH=8~9，得堿水層石油醚萃取3次，每次30 min。將堿水層石油醚揮干，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去3/4水分，進(jìn)行干燥，得馬齒莧粗提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物飼養(yǎng)條件及高尿酸血癥模型的建立 飼養(yǎng)于北華大學(xué)動物房清潔籠中。室內(nèi)溫度22±3 ℃，濕度50%±10%。

選取18~22 g健康雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組：空白組（CON）、高尿酸血癥模型組（hyperuricemia，HUA）、別嘌呤醇組（allopurinol，ALLOP，0.02 g/kg/d）、馬齒莧高劑量組（PO-H，1.48 g/kg/d）；馬齒莧低劑量組（PO-L，0.74 g/kg/d）。給藥方式為預(yù)防性給藥，除CON組和HUA組外，每組按相應(yīng)劑量連續(xù)灌胃給藥21 d。從第7 d開始，除CON組外，各組小鼠腹腔注射次黃嘌呤（hypoxanthine，HX，0.3 g/kg/d）和氧嗪酸鉀（oxonic acid potassium salt，OAPS，0.3 g/kg/d），CON組注射等量生理鹽水[14]。

1.2.3 腎臟指數(shù)測定 摘取腎臟。使用0.9%的氯化鈉溶液沖洗后用濾紙吸干稱重，右側(cè)腎臟投入4%多聚甲醛溶液中固定，左側(cè)腎臟置于?80 ℃凍存?zhèn)溆肹15]。

1.2.4 血清SUA、MDA含量測定 末次給藥1 h后每只小鼠眼球取血，靜置 1 h，離心（4 ℃，3500 r/min，20 min），吸取上層血清用于試劑盒檢測血清中SUA、MDA水平。

1.2.5 肝臟XOD、SOD含量測定及腎臟GSH、GSHPX含量測定 稱取適量肝臟組織，加入9倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生理鹽水，冰水中勻漿，制成 10%的勻漿液并離心（4 ℃，3500 r/min，10 min），取上清液，按相關(guān)試劑盒說明書檢測小鼠肝臟XOD、SOD活性。

取小鼠腎組織適量，加入9倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生理鹽水，冰水中勻漿，制成10%的腎組織勻漿液并離心（4 ℃，3500 r/min，10 min）。取上清液，按相關(guān)試劑盒說明書檢測小鼠腎臟GSH、GSH-PX活性。

1.2.6 尿液UUA、UCr含量測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，將小鼠置于代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液并記錄。將尿液離心（4 ℃，1200 r/min，15 min），取清液按相關(guān)試劑盒說明書測定UUA、UCr水平。

1.2.7 腎臟病理學(xué)檢查 參考HE染色方法[16]，觀察小鼠腎臟病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism5軟件進(jìn)行圖表分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Xˉ±SD）的形式表示，每組中的樣品數(shù)目表示“n”。以P<0.05時，表示差異顯著；以P<0.01時，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠腎臟指數(shù)的影響

臟器的腫大或萎縮體現(xiàn)臟器的損傷情況，臟器與體重的比值減小說明臟器有可能出現(xiàn)一定程度的萎縮，增加說明臟器有可能有增生和水腫的情況[17]。如表1所示。HUA組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均極顯著（P<0.01）高于CON組，說明腹腔注射HX和OAPS可以引起小鼠的肝臟、脾臟和腎臟腫大，即高尿酸血癥模型建立成功。與HUA組比較，PO-H和PO-L組小鼠腎臟指數(shù)均極顯著（P<0.01）降低，說明馬齒莧提取物對HX和OAPS引起的腎臟腫大有一定的抑制作用。但與HUA組比較，給藥組的脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)差異不顯著，說明ALLOP與馬齒莧提取物對高尿酸小鼠模型肝臟和脾臟指數(shù)沒有影響。

表1 對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect on organ index of mice

2.2 對小鼠血清SUA、MDA水平的影響

在正常飲食狀態(tài)下，體內(nèi)生成尿酸過多或排泄過低，都會引起血尿酸的升高，從而導(dǎo)致高尿酸血癥[18]。因此通過在飲食上的調(diào)整和使用降低血清尿酸的藥物將SUA水平降低至正常值是治療HUA的主要目標(biāo)[19]。MDA水平的高低可以反映機(jī)體內(nèi)自由基代謝的情況[20?21]。如圖1所示。與CON組比較，HUA組小鼠SUA濃度和MDA水平極顯著升高（P<0.01）。說明成功建立了HUA模型。和HUA組比較，PO-H組和PO-L組SUA、MDA水平顯著下降（P<0.01或P<0.05）。說明馬齒莧提取物可有效降低患病小鼠的SUA水平，且隨著劑量的增加，效果增強(qiáng)。

圖1 對小鼠血清SUA與MDA水平的影響（n=10）Fig.1 Effects on serum SUA and MDA levels in mice（n=10）

2.3 對小鼠肝臟XOD、SOD及腎臟GSH、GSH-PX水平的影響

XOD是一種與嘌呤代謝有關(guān)的酶[22]。XOD在體內(nèi)水平的升高引起嘌呤分解代謝的增強(qiáng)，最終導(dǎo)致SUA水平升高[23]。 SOD在人體內(nèi)普遍存在，是一種天然的抗氧化酶，可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，血尿酸升高是腎臟疾病發(fā)生獨(dú)立危險因素[25]。而GSH-PX可以催化GSH參與過氧化反應(yīng)，清除生物體內(nèi)活性氧自由基[26]，提高機(jī)體抗氧化能力。如圖2所示。與CON組比較，HUA組肝臟XOD水平極顯著升高（P<0.01），SOD水平極顯著降低（P<0.01）；與HUA組比較，PO-H組肝臟XOD水平極顯著降低（P<0.01），SOD水平極顯著升高（P<0.01）；PO-L組肝臟XOD水平極顯著降低（P<0.01），SOD水平無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由圖3所示。與CON組比較，HUA組腎臟GSH、GSH-PX水平極顯著降低（P<0.01）；與HUA組比較，PO-H組、PO-L組肝臟GSH、GSH-PX水平均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。馬齒莧提取物可顯著降低HUA小鼠血清中XOD、MDA水平，提高SOD、GSH、GSH-PX水平。

圖2 對小鼠肝臟XOD與SOD水平的影響（n=10）Fig.2 Effects on XOD and SOD levels in mouse liver（n=10）

圖3 對小鼠腎臟GSH與GSH-PX水平的影響（n=10）Fig.3 Effects on GSH and GSH-PX levels in mouse kidney（n=10）

2.4 對小鼠尿液UUA、UCr水平的影響

尿液中Cr的變化可以作為腎臟損害的標(biāo)志[27]。如圖4所示。與CON組比較，HUA組小鼠UUA、UCr水極顯著降低（P<0.01）；表明已出現(xiàn)初始腎功能損害。與HUA組比較，PO-H組和PO-L租UCr水平極顯著升高（P<0.01），且兩組小鼠UUA濃度與HUA組比較無顯著性差異（P>0.05）。PO組尿液中Cr水平升高，提示通過馬齒莧提取物的治療，改善了次黃嘌呤和氧嗪酸鉀所致的早期腎功能損害。

圖4 對小鼠尿液中UUA與UCr水平的影響（n=10）Fig.4 Effects on UUA and UCr levels in urine of mice （n=10）

2.5 腎病理形態(tài)學(xué)觀察

2.5.1 腎組織外觀形態(tài) CON組小鼠腎臟的大小正常。顏色為深紅色。質(zhì)地柔軟按壓時有彈性，表面光滑均勻。HUA組腎臟明顯腫大，顏色發(fā)白。質(zhì)地變硬，按壓時無彈性。表面粗糙不平，有顆粒感。PO組腎臟外觀與CON組接近，腎臟顏色呈淡紅色，未見出血點(diǎn)。表面光滑，沒有出現(xiàn)變白變硬情況。已知高尿酸血癥會加重腎臟疾病的發(fā)生，而PO組小鼠腎臟指數(shù)相比HUA組有所下降，且雙腎外觀接近正常組，說明馬齒莧提取物延緩了腎臟病變的進(jìn)程。

2.5.2 光鏡下觀察腎組織病理表現(xiàn) 在400倍光鏡下觀察結(jié)果如圖5所示，CON組小鼠具有清晰完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞間隙正常，沒有明顯的病理改變。HUA組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管明顯擴(kuò)張，且管腔形態(tài)排列雜亂不規(guī)則。腎間質(zhì)寬度明顯增加，被大量炎癥細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生黏液。部分上皮細(xì)胞有水腫、壞死的現(xiàn)象。說明HUA組小鼠腎臟有病理性損傷。而當(dāng)給予馬齒莧提取物治療后，腎小球形態(tài)接近正常。腎小管擴(kuò)張減少，炎性細(xì)胞浸潤減輕。提示馬齒莧提取物可以明顯改善HUA小鼠腎臟的病理變化。

圖5 腎臟病理形態(tài)（400×）Fig.5 Pathomorphology of kidney tissue （400×）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究中，采用HX聯(lián)合OAPS腹腔注射建立HUA模型，發(fā)現(xiàn)馬齒莧提取物可有效降低效患病小鼠的SUA水平，且隨著劑量的增加，效果增強(qiáng)，但對患病小鼠尿液UUA水平影響較小，其機(jī)制可能是通過在體內(nèi)抑制尿酸的生成，從而起到降低血清尿酸的作用。馬齒莧提取物可顯著降低HUA小鼠血清中 XOD 、MDA水平，提高SOD、GSH、GSH-PX水平，表明馬齒莧提取物可以減少脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物的生成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬齒莧提取物能夠顯著降低高尿酸血癥小鼠血尿酸水平，其機(jī)制可能是通過降低小鼠肝臟XOD活性從而減少尿酸生成。有效延緩小鼠腎臟病變進(jìn)程。這充分證明了中藥在提高機(jī)體抗病能力、增強(qiáng)免疫力及毒副作用小等方面的優(yōu)勢，對于馬齒莧用于高尿酸血癥的治療提供了參考。