不同品種獼猴桃汁抗氧化成分及體外抗氧化活性比較

李瑞娟，梁 錦，王 丹，黃天姿，張 璐，楊淑霞，羅安偉

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

獼猴桃富含VC、果膠、糖類、有機酸、多酚、類黃酮、氨基酸及鉀、鈣等微量元素，其主要營養(yǎng)成分含量排名各種水果前列[1?2]。長期食用獼猴桃能有效補充人體維生素、強化免疫系統(tǒng)，緩解皮膚炎癥、降低血清膽固醇含量，而且具有抗衰老、抗病毒、抗輻射、抗腫瘤及預防心腦血管疾病等作用[3]。研究表明這些功效與其富含多種天然抗氧化物質密切相關，獼猴桃中相關物質可清除人體內活性氧自由基，減輕自由基氧化反應對機體細胞和組織的損傷，延緩細胞衰老及慢性疾病的發(fā)生[4]。獼猴桃果汁因富含多酚、黃酮、VC等可以抑制脂質過氧化、清除自由基的抗氧化物質而倍受人們的青睞。為選育綜合性較好的獼猴桃品種，許多研究者制定育種目標，對不同獼猴桃品種采后品質、酚類物質組成與含量、抗氧化活性等進行了研究。王菲等[5]研究表明軟棗獼猴桃總黃酮具有較強清除DPPH·的能力和還原力，可有效抑制脂質過氧化，且對O?2、·OH有一定的清除作用，得出軟棗獼猴桃總黃酮具有顯著的抗氧化活性。趙金梅等[1]測定10種獼猴桃果實品質及抗氧化活性，得出華優(yōu)的VC、總酚含量及DPPH·清除率最高，營養(yǎng)價值較高，且獼猴桃的抗氧化能力與VC和總酚含量之間呈現(xiàn)較高相關性。張云等[6]選用紅陽、米良一號、金艷獼猴桃為研究對象，得出紅陽獼猴桃的可食部分總酚含量最高，其多酚提取液對DPPH·清除力和還原力最強，紅陽和金艷具有較好的ABTS+·清除能力，且紅陽的抗氧化活性與總酚含量的相關性最好，說明紅陽中具有抗氧化活性的多酚類化合物的含量高。曹毛毛等[7]測定7種獼猴桃的理化特性和抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)7種獼猴桃果實理化性質存在顯著性差異，在抗氧化活性方面，秦美的DPPH·清除能力、Fe2+絡合能力和Fe3+還原能力均最強，華優(yōu)具有最強保護DNA氧化損傷的作用。我國獼猴桃資源豐富，各個主產區(qū)適宜種植的品種不同，針對不同產區(qū)、不同品系采后果實酚類物質組成及含量、抗氧化性研究尚未見報道。因此，研究以國內陜西、四川2個主產區(qū)的12個主栽的紅心、黃心、綠心獼猴桃為試材，探究果實抗氧化活性及相關物質含量，篩選營養(yǎng)價值高、抗氧化活性強的獼猴桃品種，發(fā)揮品種優(yōu)勢，為功能性食品的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 試驗選取3個品系、12個品種獼猴桃，包括美味系（海沃德、徐香、亞特、翠香），中華系（華優(yōu)、紅陽、東紅、祁紅、黃金果、金艷），軟棗系（益玉、綠迷）。不同品種獼猴桃達到各自商業(yè)采收成熟度時采收，不同品種采收時間不一致，選擇大小基本一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，采收后于室溫下放置后熟，采樣情況見表1；福林酚、1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、2,2-聯(lián)-（乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨（Diammonium 2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS） 分析純，美國Sigma公司；沒食子酸、VC、H2O2、水楊酸、三氯乙酸等 分析純，天津市天力化學試劑有限公司；甲醇、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、根皮苷、蘆丁、槲皮素、楊梅素等單體酚標品 色譜純，阿拉丁試劑有限公司。

表1 獼猴桃品種及采樣情況Table 1 Cultivars of kiwifruit and sampling condition

紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；HH-S6雙列六孔型電熱水浴鍋 北京科偉有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；WGL-230B電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；電子計數(shù)秤上海友聲衡器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 待獼猴桃果實硬度為1.0 kg/m2以下時進行榨汁處理。每個品種取20個果實，去皮后榨汁，汁液用200目濾布過濾，直接使用鮮榨獼猴桃汁進行測定。

1.2.2 VC含量的測定 采用高效液相色譜法測定[9]，準確稱取10 g果肉放入破碎機中，加入20 mL 0.1%的偏磷酸溶液打成勻漿，轉入離心管中于8000 r/min離心15 min，吸取上清液2.5 mL至容量瓶（25 mL）中，用0.1%的偏磷酸溶液定容，混勻后用0.22 μm的微孔濾膜過濾到樣品瓶中待測。色譜柱：Inertsil/Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%偏磷酸溶液:甲醇=96:4（v/v）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：243 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.3 多酚含量的測定 采用福林酚法[10]，以沒食子酸為標準物質測定多酚的含量。準確稱取25 mg沒食子酸，去離子水溶解后定容至25 mL，以該沒食子酸溶液為原液，依次配制成質量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL的梯度液。取100 μL標準液與400 μL去離子水于試管中，加100 μL福林酚試劑混勻，6 min后加入1 mL 7% Na2CO3溶液和0.8 mL去離子水，混勻后避光放置，90 min后測定OD760nm。樣品測定時取100 μL獼猴桃汁，其余操作同上。以沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。標準曲線回歸方程為y=0.0034x+0.0932，R2=0.9927。

1.2.4 類黃酮含量的測定 采用AlCl3顯色法[11]，以蘆丁為標準物質測定黃酮的含量。準確稱取蘆丁標準品26.0 mg于燒杯中，加入70%的乙醇溶解后轉入50 mL容量瓶定容，得到0.52 mg/mL的標準液。準確量取標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL容量瓶中，依次加入70%乙醇3.0 mL、5%亞硝酸鈉0.75 mL，搖勻放置5 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，最后加入5%氫氧化鈉溶液4 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min后，測定OD510nm。樣品測定時取2 mL獼猴桃汁，其余操作同上。以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。標準曲線回歸方程為y=11.415x?0.0017，R2=0.9977。

1.2.5 單體酚的測定 采用高效液相色譜法[12]，不同品種獼猴桃樣品用50%甲醇超聲波輔助提取。色譜柱：Inertsil/Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相流速0.8 mL/min；運行時間50 min；檢測波長280 nm。流動相A：0.1%磷酸水溶液，流動相B：甲醇。起始B濃度0，10 min時B濃度30%，20 min時B濃度48%，28 min時時B濃度53%，40 min時B濃度57.5%，42 min時B濃度70%，45 min時B濃度0。以沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸等為標準品，繪制標準曲線，采用峰面積歸一化法進行定量，其結果用μg/100 g表示。

1.2.6 抗氧化活性測定 抗氧化活性的測定參照張淑娟等[13]的方法并略作修改，其中清除率為50%時的果汁濃度為半抑制濃度（IC50），用來表示抗氧化能力。

1.2.6.1 清除DPPH·能力的測定 取不同品種獼猴桃果汁于4 ℃、8000 r/min離心15 min，上清液稀釋成不同濃度備用。取不同濃度果汁稀釋液1 mL于試管中，加入2 mL 0.5 mmol/mL DPPH溶液，加無水乙醇至4 mL，搖勻置暗處反應30 min后，測定OD517nm。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：Aj為樣品+DPPH溶液的吸光度；A0為DPPH溶液+無水乙醇的吸光度。

1.2.6.2 清除ABTS+·能力的測定 取不同品種獼猴桃果汁于4 ℃、8000 r/min離心15 min，取上清液用無水乙醇稀釋成不同濃度備用。將14 mmol/L ABTS+·溶液與4.9 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，于4 ℃避光反應14 h，然后用無水乙醇稀釋至波長734 nm處吸光度為0.7±0.02，取2.8 mL該溶液分別加入25 μL稀釋后的獼猴桃汁，加無水乙醇至3 mL，室溫避光反應6 min后測定OD734nm。按式（2）計算ABTS+·清除率。

式中：A0為加空白乙醇的ABTS+·溶液的吸光度；Aj為樣品與ABTS+·溶液反應6 min后的吸光度。

1.2.6.3 ·OH清除率的測定 取不同品種獼猴桃果汁于4 ℃、8000 r/min離心15 min，取上清液用蒸餾水稀釋成不同濃度。取稀釋后的樣品1.0 mL于試管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸，混勻后靜置10 min，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混勻后靜置30 min測定OD510nm。按式（3）計算·OH清除率。

式中：Aj為加入樣品后的吸光度；A0為空白對照液的吸光度；Ai為不加H2O2時樣品的吸光度。

1.2.6.4 還原能力的測定 取不同品種獼猴桃果汁于4 ℃、8000 r/min離心15 min，取上清液稀釋后備用。取稀釋后的果汁1.0 mL于試管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS（pH6.6）及1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，50 ℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL 10%TCA溶液，于4000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL，加4.5 mL蒸餾水及0.5 mL質量分數(shù)為0.1% FeCl3溶液，混勻，10 min后測定OD700nm。

1.2.7 多酚、類黃酮、VC、果實單體酚含量與體外抗氧化能力的相關性分析 對不同品種獼猴桃汁清除DPPH·、ABTS+·、·OH、總還原能力與總酚、類黃酮、VC、單體酚含量之間進行相關性分析，采用Person進行相關性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3次，結果以平均數(shù)±標準誤差表示。采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)多重比較采用Duncan法[7]，聚類距離采用歐式距離平均法，聚類方法采用Ward法。

2 結果與分析

2.1 果汁樣品主要成分測定結果

已有研究報道，食用獼猴桃能有效降低某些疾病的發(fā)病率，發(fā)揮作用的物質主要為果實中的抗氧化活性成分，包括酚類物質、VC等，它們通過抑制人體內氧化反應來清除自由基，從而延緩或抑制油脂及其他物質被氧化[14?15]。VC是一種水溶性抗氧化劑，在機體內抗氧化酶的協(xié)同下參與多種清除自由基活動，獼猴桃中VC有降低血和肝中脂質的作用，研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃果汁可明顯降低高膽固醇血癥小鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白含量，提高其血清高密度脂蛋白膽固醇含量[16?17]。不同品種獼猴桃果汁主要成分如表2所示。VC是獼猴桃汁的一個重要營養(yǎng)指標，由表2可知，不同品種獼猴桃汁的VC含量存在較大變異系數(shù)（>20%），其含量變化幅度在27.300~130.380 mg/100 g之間，從高到低依次為亞特>華優(yōu)>東紅>翠香>金艷>紅陽>黃金果>祁紅>海沃德>綠迷>徐香>益玉。酚類物質是一類廣泛存在于水果中的多羥基化合物的總稱，是一種重要次生代謝產物，通過苯丙烷代謝途徑合成，對果實的色澤、風味、抗病性及采后貯藏保鮮均有一定的影響，也是決定果汁飲料抗氧化能力的主要物質之一[17]。研究結果顯示，祁紅獼猴桃果汁多酚含量最高，徐香中最低。絕大多數(shù)植物體內都含有黃酮類化合物，它們在植物的生長、發(fā)育、開花、結果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。黃酮類化合物因酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結合生成黃酮自由基，進而與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應，起到抗氧化作用[18]。不同獼猴桃汁的類黃酮含量存在較大變異系數(shù)，其中軟棗系兩個品種獼猴桃（益玉和綠迷）含量最高，海沃德含量最低，而且中華系獼猴桃類黃酮平均含量顯著大于美味系獼猴桃（P<0.05）。

表2 不同品種獼猴桃果汁主要成分Table 2 Major ingredients of different kiwifruit juice

酚類物質的含量決定了果實的抗氧化能力[19]。由表3可知，不同品種獼猴桃的多酚類組成有顯著性差異（P<0.05）。原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素含量相對較高，為獼猴桃中最主要的多酚類化合物。這與李琛等[12]對不同品種獼猴桃單酚含量的測定結果一致。兒茶素為紅陽、翠香、亞特、益玉、綠迷中含量最多的酚類，但不同品種含量差異較大。美味系獼猴桃單酚種類最豐富，基本包括了測定的12種酚類。中華系獼猴桃中槲皮素含量均未檢出，而且祁紅、東紅、黃金果和金艷四個品種均未檢出根皮苷、蘆丁和槲皮素。酚類物質總含量大小依次排序為徐香>紅陽>亞特>金艷>綠迷>華優(yōu)>翠香>黃果>益玉>海沃德>祁紅>東紅。

表3 不同品種獼猴桃單體酚含量（μg/100 g）Table 3 Polyphenol composition and content of different kiwifruit (μg/100 g)

2.2 不同品種獼猴桃汁對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除效果和總還原力

由圖1結合表4進行分析，VC對照和不同品種獼猴桃汁樣品對DPPH自由基的清除能力與樣品添加體積有較密切關系，ABTS+·、·OH的清除效果、還原力和體積之間也有同樣關系，呈現(xiàn)較好的量效關系，由半抑制濃度表可看出12個品種獼猴桃汁清除DPPH·效果排序依次為：紅陽>翠香>VC>亞特>華優(yōu)>益玉>金艷>祁紅>海沃德>徐香>東紅>綠迷>黃金果；由表4可看出清除ABTS+·效果排序依次為：華優(yōu)>亞特>紅陽>翠香>金艷>益玉>祁紅>綠迷>東紅>VC>黃金果>徐香>海沃德，由排序可知大多數(shù)獼猴桃對ABTS+·清除效果優(yōu)于VC，綜上得出，紅陽、翠香、亞特、華優(yōu)對DPPH·和ABTS+·兩者的清除能力較強；由表4可看出清除·OH效果排序依次為：益玉>綠迷>VC>亞特>海沃德>徐香>華優(yōu)>紅陽>翠香>祁紅>金艷>黃金果>東紅；綜合分析得出12個品種獼猴桃汁還原力大小依次為：金艷>益玉>綠迷>祁紅>亞特>海沃德>華優(yōu)>黃金果>東紅>徐香>VC>翠香>紅陽。鐵還原力（FRAP）法不是針對某一種自由基的清除能力，它反映的是樣品總的還原能力，樣品的總還原能力越強，對自由基的清除率越高，其抗氧化性越強。因此，可用來表征樣品總的抗氧化活性[19]，其中10個品種獼猴桃汁還原力都大于VC，這印證了獼猴桃抗氧化能力較強的特點，綜上兩個指標可得益玉和綠迷清除·OH能力和總還原力較強。

圖1 不同品種獼猴桃汁對DPPH·、ABTS+·、·OH清除效果與還原力Fig.1 DPPH·, ABTS+·, ·OH scavenging capacity and reducing power of kiwifruit juice in different varieties

表4 不同品種獼猴桃汁抗氧化活性的IC50[5]Table 4 IC50 of antioxidant activity of different varieties in kiwifruit juice[5]

圖1 的曲線經(jīng)擬合，從方程得到表4不同品種獼猴桃汁抗氧化活性的IC50。

2.3 獼猴桃汁的多酚、類黃酮、VC含量與體外抗氧化活性的相關性分析

研究表明，植物的抗氧化活性與其生物活性物質含量之間存在一定的相關性[20]。從表5可以看出，樣品中的多酚含量與總還原力有顯著相關性（P<0.05），總還原能力是檢驗果汁飲料整體抗氧化能力的一項重要指標，說明多酚是影響獼猴桃果汁抗氧化能力的關鍵因素。多酚與DPPH·、·OH清除率相關性較弱（相關系數(shù)分別為0.178和?0.214）。獼猴桃清除DPPH·和ABTS+·的能力呈現(xiàn)顯著相關性（P<0.05）。通過單酚含量與抗氧化活性之間相關性可得，蘆丁與類黃酮、槲皮素有顯著相關性，咖啡酸與對香豆酸、槲皮素、表兒茶素有顯著相關性，阿魏酸與原兒茶酸、·OH有顯著相關性（P<0.05）。

表5 不同品種獼猴桃汁抗氧化能力與主要活性成分的相關系數(shù)Table 5 Correlation coefficients between antioxidant ability and the main active ingredients of kiwifruit juice

2.4 聚類分析

聚類分析過程是把樣本依照品質特性相似性逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合，著重區(qū)分類別內和類別間元素組成，最終按照類別的綜合性質使多個品種聚合，從而達到聚類目的[21]。為了從整體上對不同品種獼猴桃汁中抗氧化物質及單酚含量差異進行分析，對相關數(shù)據(jù)標準化后進行系統(tǒng)聚類分析，結果如圖2所示。在歐式距離6.0處可將12個品種獼猴桃樣品分為6類，第一類為軟棗系品種益玉和綠迷，軟棗獼猴桃含豐富多酚類化合物，且主要以黃酮類化合物為主[22]，對應表1也可看出益玉和綠迷中類黃酮含量在12個品種中較高，黃酮類化合物通常被認為是最有效的抗氧化劑，結合本實驗室梁錦等[23]前期對獼猴桃制汁適應性的研究，得出益玉、綠迷具有較強的抗氧化能力，但軟棗獼猴桃目前種植面積小，尚未大規(guī)模商業(yè)化栽培[24]，理論上較適宜加工為營養(yǎng)豐富的果汁、果酒等飲料。第二類為紅陽，第三類為徐香，第四類為華優(yōu)、亞特，這三類為陜西省種植面積最廣，抗氧化活性較高的常見主栽品種，加工經(jīng)濟性較高，適宜大規(guī)模加工為產品。第五類為兩個紅心品種祁紅、東紅，均為中華獼猴桃亞科中紅陽的變種[8]，且抗氧化成分相似。紅心獼猴桃目前栽培面積和產量逐漸增大,其果肉沿中軸呈放射狀紅色，糖分較高，酸度極低，且果香濃郁、典型[25]，發(fā)展勢頭強勁，其價格也比一般綠心獼猴桃貴2~3倍，鮮食最佳。第六類為翠香、海沃德、黃金果、金艷，其由于抗氧化物質相似被聚為一類[26]。其中海沃德、黃金果和金艷VC含量較低，酸甜口感較差。此次聚類依據(jù)的是抗氧化物質及單酚含量，未能把中華獼猴桃與美味獼猴桃進行種間區(qū)分。

圖2 不同品種獼猴桃汁聚類分析結果Fig.2 Clustering analysis results of kiwifruit juice of different varieties

3 結論

對12種獼猴桃汁樣品抗氧化活性成分及體外抗氧化活性進行測定。結果發(fā)現(xiàn)12種樣品的多酚含量在0.577~0.835 mg/mL之間，類黃酮含量在0.013~0.061 mg/mL之間，相比較而言，益玉、綠迷多酚、類黃酮含量在12種獼猴桃中相對較高。VC變化幅度在27.30~130.38 mg/100 g之間，其中亞特VC含量最高，益玉中最低。通過HPLC對不同品種獼猴桃樣品酚類成分測定與分析，得出原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素含量相對最高，為獼猴桃中最主要的多酚類化合物。

通過DPPH·、ABTS+·、·OH和FRAP這4種體外抗氧化方法來比較不同品種獼猴桃汁樣品抗氧化活性，綜合比較可知紅陽、翠香、亞特和華優(yōu)對DPPH·、ABTS+·清除能力較強；益玉和綠迷對清除·OH能力較強，總還原能力在12個獼猴桃樣品中也較強，這與軟棗系獼猴桃含豐富黃酮類化合物有密切關系。相關性分析發(fā)現(xiàn)VC、多酚、類黃酮含量和某些單酚類成分與抗氧化能力間有顯著相關性（P<0.05）。

聚類分析是根據(jù)對象的特征進行分類，達到減少研究對象的目的，旨在將性質相近的對象歸為一類，本文通過聚類分析初步判斷哪些品種屬于抗氧化活性成分相似的品種，為后續(xù)研究抗氧化活性較高且相似的品種提供理論依據(jù)，有助于實踐中的加工與利用[27]。本文對不同品種獼猴桃樣品的抗氧化活性成分的差異性進行系統(tǒng)聚類分析，12個品種獼猴桃樣品分為6類，第一類為軟棗系的益玉和綠迷，第二類為紅陽，第三類徐香，第四類為華優(yōu)、亞特，第五類為兩個紅心品種祁紅、東紅，第六類為翠香、海沃德、黃金果、金艷。我國是世界上最大的獼猴桃生產國，100%果汁、非濃縮還原汁[28]、獼猴桃果酒等含有更多營養(yǎng)與功能成分的飲料受到消費者推崇，功能飲料零售額年均復合增長率達到17.1%，市場前景較好。故關于獼猴桃汁抗氧化活性的研究對加工功能果汁飲料十分必要，并可為獼猴桃果汁、果酒等加工企業(yè)選擇抗氧化能力強的品種提供一定的參考。