賈菲蕓,楊 靖,王稼苜,曹銀萍,李友勇,
(1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,玉米研究所,河南新鄉(xiāng) 453000)
在我國上世紀(jì)70年代前,玉米屬于口糧。進(jìn)入本世紀(jì)后,由于水稻和小麥的持續(xù)增產(chǎn),基本能滿足居民主食口糧需要,因此,玉米逐漸變?yōu)檎{(diào)節(jié)食品作物。我國居民食用玉米,南方多鮮食,直接食用未成熟籽粒;北方多食用玉米粥、玉米餅、小麥玉米混合粉等制品,利用的是成熟玉米籽粒。由于人們將玉米作為調(diào)節(jié)食品,因而對(duì)食用玉米的品質(zhì)要求也由過去的能量攝取變?yōu)槟壳暗淖非箫L(fēng)味。糧食的風(fēng)味,其中重要組成是香味,根據(jù)對(duì)水稻和小麥等作物的研究,這種香味是揮發(fā)性香氣物質(zhì)產(chǎn)生的,部分作物中已鑒定出其關(guān)鍵成分[1?3]。玉米的風(fēng)味及揮發(fā)性香氣物質(zhì)國外研究較早,但主要集中在鮮食的甜、糯玉米上[4?6],國內(nèi)研究起步較晚,已有的研究也多是鮮食玉米[7?9],成熟的籽粒玉米僅在酒類發(fā)酵和倉儲(chǔ)方面有少量報(bào)道[10?13]。雖然玉米成為調(diào)節(jié)食品,但在我國居民的膳食結(jié)構(gòu)中仍有重要位置,一方面在部分人群中不可或缺,另一方面需求總量仍很大。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國玉米年產(chǎn)2.5億噸左右,其中食用占5%~10%[14],達(dá)1250萬到2500萬噸,在品種改良和生產(chǎn)環(huán)節(jié)提高這部分玉米的食用品質(zhì)有重要意義。
玉米品種,根據(jù)食用認(rèn)知和研究,發(fā)現(xiàn)有的品種籽粒風(fēng)味好,有的則差[15],同一品種,新收獲的籽粒加工的食品風(fēng)味好,貯藏陳化的籽粒風(fēng)味差[16];特殊地區(qū),如同一品種在不同地區(qū)種植,收獲的籽粒食用品質(zhì)不同[15]等。然而到目前,我國對(duì)于這些現(xiàn)象的系統(tǒng)研究則很少,玉米風(fēng)味的食用品質(zhì)評(píng)價(jià)體系和指標(biāo)也未建立,重要香氣物質(zhì)的種類和含量鮮有報(bào)道,品種選育和審定中香味品質(zhì)也沒有參考指標(biāo),優(yōu)質(zhì)食用籽粒玉米的種植還處于自發(fā)狀態(tài)。
為了逐步建立香味品質(zhì)評(píng)價(jià)體系,掌握玉米不同品種間香味物質(zhì)的成分和含量狀況,以及貯存后的成分變化,本文遴選過去20年中種植面積大、食用品質(zhì)好的著名玉米品種鄭單958[15?16],和新培育的籽粒鮮黃、白軸、半硬質(zhì),產(chǎn)量超鄭單958 5%以上的高產(chǎn)品系黃1號(hào)~黃4號(hào)4個(gè)品系為材料,取樣當(dāng)年收獲籽粒和自然存放1~3年的果穗籽?;蛟蹫闃悠罚捎脷庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographymass spectrometry GC-MS)方法[17?18],測(cè)定樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)(volatile organic compounds,VOCs)的含量,分析這一重要食用品質(zhì)的組分構(gòu)成和品種間差異,為品種改良、優(yōu)質(zhì)品種評(píng)價(jià)和貯存方法改進(jìn)等提供關(guān)鍵成分信息和香氣物質(zhì)含量參考指標(biāo)。
取樣的5個(gè)品種、品系材料在不同年份收獲后,果穗風(fēng)干,放置普通紙箱內(nèi)貯藏在低溫庫中,庫溫5±1 ℃。2019年保存一份黃2號(hào)籽粒全粉(籽粒去果皮磨粉)的樣品,普通PE食品袋包裝,非真空。2017年保存一份鄭單958玉米糝(碾碎的細(xì)顆粒)樣品,聚酯袋真空包裝。全部共10個(gè)樣品,其編號(hào)、產(chǎn)地、貯存處理等信息見表1;2-甲基-3-庚酮 純度99%,配制成正己烷溶液,濃度50 mg/mL,Sigma-Aldrich。
表1 玉米品種樣品及儲(chǔ)存處理Table 1 Samples of maize varieties and storage treatment
Thermo Trace 1300-ISQ7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;色譜柱 DBwax 石英毛細(xì)柱(30 m× 0.25 mm×0.25 μm) Agilent;配備的MPS2型CTC三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;20 mL頂空瓶、50/30 μm DVB/CAR on PDMS型萃取頭 上海安譜公司。
1.2.1 樣品準(zhǔn)備 樣品取樣先取果穗3個(gè),剝下籽粒,對(duì)半取樣法取樣100 g,去果皮后中藥粉碎機(jī)粉碎為粗粉。保存為全粉和糝的材料直接對(duì)半取樣法取樣100 g,即原始樣品,?72 ℃低溫保存。各項(xiàng)重復(fù)分析均從該原始樣品中取樣。氣相色譜測(cè)定的樣品取粗粉10 g,小型磨碎機(jī)磨粉,全部過60目網(wǎng)篩。
1.2.2 GC-MS檢測(cè) 參考Wang等[19]的方法,采用頂空固相微萃?。⊿olid phase micro-extraction,SPME),氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。
SPME條件:粉狀樣品2±0.01 g,加入頂空瓶,后加入內(nèi)標(biāo)2-甲基-3-庚酮正己烷溶液10 μL(加入量0.5±0.01 mg),渦旋混勻后微萃取。微萃取溫度60 °C,震蕩時(shí)間40 min,萃取時(shí)間50 min,震蕩速度250 r/min,解析時(shí)間5 min。
GC條件:色譜柱DB-wax石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣溫度260 °C,分流比5,載氣是氦氣(純度99.999%),流量1.0 mL/min,柱溫70 °C保持2 min,以3 °C/min速率升至220 °C,保持3 min,循環(huán)時(shí)間50 min。
MS條件:接口溫度240 °C,離子源溫度230 °C,電離方式EI+,70 ev;掃描方式為全掃描,質(zhì)量范圍33~550,質(zhì)譜庫是國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(The National Institute of Standards and Technology,NIST)2017光譜數(shù)據(jù)庫“NIST 2017”。
1.2.3 定性、定量分析和差異顯著性檢驗(yàn)方法 揮發(fā)性物質(zhì)定性分析由MS結(jié)果給出。為了比較不同品種和不同貯藏時(shí)間之間揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異,計(jì)算各樣品揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)總含量,方法參考Wang等[19]和朱力杰等[20]的計(jì)算方法,相對(duì)總含量(mg/kg)=[(內(nèi)標(biāo)峰面積/內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣量(mg)×樣品總峰面積)]/樣品進(jìn)樣量(mg)×106,用所有樣品含量數(shù)據(jù)估計(jì)總體均數(shù)、總體方差和總體標(biāo)準(zhǔn)誤,用已知總體方差和總體標(biāo)準(zhǔn)誤的兩個(gè)樣品間平均數(shù)顯著性檢驗(yàn)方法做兩兩樣品間含量差異顯著性檢驗(yàn)[21]。
10個(gè)樣品,經(jīng)氣相色譜儀檢測(cè),離子流圖譜顯示內(nèi)標(biāo)峰和高含量峰的保留時(shí)間在樣品間保持一致,穩(wěn)定性好,樣品間峰的數(shù)目和高度,即峰面積存在差異,這是品種間差異。其中對(duì)照鄭單958(4#)和黃1號(hào)(1#)和黃2號(hào)(6#),峰數(shù)目多、面積大,揮發(fā)性物質(zhì)總含量高,以該3個(gè)典型樣品為例,顯示總離子流圖見圖1。鄭單958的離子流圖中標(biāo)注了部分高含量峰的物質(zhì)名稱,未標(biāo)注的高含量峰經(jīng)鑒定是硅氧烷,可能是游離的柱填充物或容器壁溶解物。多數(shù)樣品45 min前出峰完成,因此設(shè)置檢測(cè)總時(shí)間為50 min。
圖1 3個(gè)玉米品種揮發(fā)性物質(zhì) GC-MS 離子流圖Fig.1 GC/MS total ion chromatogram of volatile components of three maize varieties注:1:3-Heptanone, 2-methyl-(2-甲基-3-庚酮:(內(nèi)標(biāo)));2:Dodecane(正十二烷);3:styrene(苯乙烯);4:Methyl 6-oxoheptanoate(6-氧代庚酸甲酯);5:2-Propanol, 2-methyl-(叔丁醇);6:[1,1'-Bicyclopropyl]-2-octanoic acid, 2'-hexyl-, methyl ester(2-己基-1,1-雙環(huán)丙烷-2-辛酸甲酯);7:Benzaldehyde, 4-ethyl-(4-乙基苯甲醛);8:12,15-Octadecadiynoic acid, methyl ester(12,15-十八碳二炔酸甲酯);9:Paromomycin(巴龍霉素);10:1-(3,4-dimethylphenyl)-(3,4-二甲基苯乙酮);11:Phthalic acid, hex-3-yl isobutyl ester(鄰苯二甲酸,六-三酰異丁酯)。
各樣品峰譜物質(zhì)在質(zhì)譜庫中檢索,共確定具對(duì)應(yīng)物質(zhì)峰195個(gè)。分析峰譜發(fā)現(xiàn),同一物質(zhì)同質(zhì)荷比多峰現(xiàn)象比較普遍,最多達(dá)7個(gè),如12,15-十八碳二炔酸甲酯、6-甲基十八烷等。將相同物質(zhì)合并,鑒別出物質(zhì)組分總數(shù)共101種。將101種被鑒定的化合物按有機(jī)物類別,烷、烯、醇、醛、酮、酸、酯、醚、酚、雜環(huán)等衍生化合物劃分,可分為12類(表2)。統(tǒng)計(jì)每類物質(zhì)出現(xiàn)的頻次,數(shù)量最多的是酯,18種,其次是醇和酮,再次是烷、酰胺類,烯、醛、酸類較少,這些物質(zhì)中,絕大多數(shù)具香氣,如5-羥基-4-辛酮(奶油香,食品用香料)、2-壬酮(果香和奶油香)、呋喃酮(果香和香味增效劑)、叔丁醇(香精原料)、月桂醇(紫羅蘭香)等[11,13,18],因此,玉米的香氣風(fēng)味也是多種香氣物質(zhì)組成的天然混合香。
表2 鑒定的玉米揮發(fā)性物質(zhì)的類別及數(shù)量Table 2 Categories and its quantities of identified volatile substances in maize
將峰面積用內(nèi)標(biāo)參數(shù)換算為相對(duì)含量,10個(gè)樣品各自的總含量見表3,可看出,含量分布在36.66~68.00 mg/kg之間。9#樣品的鄭單958玉米糝最高,為68.001 mg/kg;其次是6#黃2號(hào)當(dāng)年籽粒樣品,為65.145 mg/kg;新收獲的黃1號(hào)當(dāng)年樣品,含量為63.788 mg/kg;最低的是2018年冬在海南種植,2019春季收獲,穗子在室內(nèi)自然存放1.5年的黃1號(hào),為36.660 mg/kg,含量僅為當(dāng)年收獲的同品種樣品的58.19%。
表3 樣品的峰數(shù)目、揮發(fā)性物質(zhì)種類、相對(duì)總含量和單組分平均含量
分析峰譜和質(zhì)譜結(jié)果,其中所有樣品共有,且平均峰面積≥105的物質(zhì)共51種,平均峰面積≥106的物質(zhì)共13種(表4),峰面積≥107水平的高含量物質(zhì)2種,叔丁醇和正十二烷。統(tǒng)計(jì)這些物質(zhì)的共有成分,它們?cè)诳偤枯^高(≥50 mg/kg)樣品中貢獻(xiàn)總揮發(fā)性物質(zhì)的40%~50%,在含量較低(<50 mg/kg)樣品中貢獻(xiàn)50.70%。除此之外,不同品種,不同貯藏時(shí)間樣品,還檢測(cè)到有各自的特有成分,這些特有成分的數(shù)量在樣品間分布4~16種不等,見表5,高含量樣品數(shù)目多,如1#和9#,分別有14種和16種,部分低含量樣品少,如4#、5#,僅4種。在黃1號(hào)中峰面積≥107的特有成分還有苯二甲酸酯,在黃2號(hào)中還有甲基3,6-十八碳二炔酸酯(3,6-Octadecadiynoic acid, methyl ester ),該物質(zhì)峰面積高達(dá)4.22×107,是該樣品總面積的22.44%,但它的叔丁醇含量則較低。峰面積≥106的特有成分還有十四烷、十六碳烯酸、4-乙基苯甲醛、2-乙基苯甲酸甲酯、3,4-二甲基苯乙酮、鄰苯二甲酸二丁酯等。9號(hào)樣品品種是鄭單958,產(chǎn)地是涼爽的山區(qū)地區(qū),其中檢測(cè)出三萜酯-纈氨酸、四乙酰-D-二甲基腈、十四烷、人參炔E等特殊成分。
表4 玉米籽粒全粉中相對(duì)含量峰面積大于106的共有揮發(fā)性化合物Table 4 Co-owned VOCs with peak area greater than 106 in the whole corn grain powder
表5 不同樣品中峰面積大于106的特有揮發(fā)性化合物數(shù)量Table 5 Number of specific VOCs with peak area larger than 106 in different samples
表3 的樣品揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)總含量數(shù)據(jù),用已知總體方差的兩個(gè)樣品平均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)方法[21]檢測(cè)兩兩樣品間含量差異,見表6,可看出:a.品種間總含量具顯著或極顯著性差異(P<0.05,P<0.01),黃1號(hào)和黃2號(hào)是高含量品種,鄭單958、黃3號(hào)和黃4號(hào)是中等含量品種;b.不同貯藏時(shí)間之間比較,總含量差異顯著(P<0.05),如1#到3#之間,5#與6#之間,相同品種,不同貯藏時(shí)間,含量差異顯著(P<0.05)。黃1號(hào)的3個(gè)樣品,貯藏時(shí)間越長,揮發(fā)性物質(zhì)總含量下降越多,每年損失約15%;黃2號(hào)的磨粉樣品(10#),自然存放僅1年,揮發(fā)性物質(zhì)總含量下降31.98%;c.9#樣品,是中等含量品種鄭單958,貯藏3年,總含量仍在高含量水平,與黃1號(hào)和黃2號(hào)當(dāng)年樣品差異不顯著,推測(cè)樣品本身揮發(fā)性物質(zhì)含量高或其在貯藏期間損耗?。辉摌悠樊a(chǎn)地河南欒川,聚酯袋密封抽真空包裝,2017年收存,5 ℃低溫下貯存,高含量揮發(fā)物可能與樣品產(chǎn)地有關(guān),貯藏期間損耗小與包裝有關(guān),隔絕空氣的密封包裝能有效防止香氣物質(zhì)溢散。
表6 10個(gè)樣品間揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)總含量差異顯著性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))Table 6 Difference significant test (t-test) on relative total content of VOCs among ten samples
玉米可食用,籽粒具高能量,也具高含量保健成分,雖然目前在我國退出居民主食地位,但由于其特殊營養(yǎng)和人們的膳食習(xí)慣,作為調(diào)節(jié)食物原料目前仍保持相當(dāng)利用數(shù)量。玉米的食用品質(zhì),香味物質(zhì)是重要組成成分,本文用不同品種、同一品種新收獲籽粒和陳化籽粒、同一品種不同產(chǎn)地等處理的籽粒全粉,檢測(cè)其揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量,發(fā)現(xiàn)物質(zhì)種類達(dá)100余種,單品種60~70種,不少于小麥[3]。高含量組分20余種,累加含量達(dá)品種總含量80%。高含量組分中可分為共有成分和特有成分,共有成分中發(fā)現(xiàn)正十二烷和叔丁醇含量最高,達(dá)4.345和6.472 mg/kg,可認(rèn)為是重要成分;特有成分品種間變化較大,在一些品種中含量極高,如甲基3,6-十八碳二炔酸酯,在黃2號(hào)中超總揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的20%。檢測(cè)結(jié)果還顯示,5個(gè)品種中揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對(duì)總含量為36.660~68.001 mg/kg,品種間差異顯著,陳化后含量下降,磨碎的全粉貯存后含量下降幅度更大,但真空包裝含量損耗輕微;山區(qū)地區(qū)生產(chǎn)的籽粒比平原地區(qū)生產(chǎn)的籽粒含量顯著提高,等等,這些結(jié)果為玉米籽粒香味物質(zhì)評(píng)價(jià)、品種改良指標(biāo)參考、貯藏方法改進(jìn)等提供了重要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
檢測(cè)結(jié)果顯示,玉米籽粒中揮發(fā)性物質(zhì)種類可檢測(cè)到100種以上,但80%的物質(zhì)由20余種物質(zhì)組成,這與過去報(bào)道的籽粒玉米中組分?jǐn)?shù)量和特征基本一致[7?13],但本文結(jié)果與過去鑒定的組分比較,相似成分多,相同成分少,相同成分不超過10%,相似成分是同類物,差異主要是碳(C)的數(shù)目不同、側(cè)鏈甲基位置不同或功能基氧化程度不同,如十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、6-甲基十八烷,壬酮和壬醛,月桂醇和月桂酸等。這些差異可能來自于玉米籽粒在貯藏期間的持續(xù)轉(zhuǎn)化和檢測(cè)時(shí)樣品前處理不同。玉米香氣物質(zhì)的絕對(duì)含量過去報(bào)道也較少,主要原因是鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)不穩(wěn)定,單物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品純化較難、鑒定程序復(fù)雜等,因此過去考察含量的研究多使用歸一法相對(duì)含量參數(shù)[7?9,12?13],但歸一法參數(shù)更多反映的是組分的構(gòu)成,不反映含量。本文用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算總近似含量,這是一個(gè)相對(duì)內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮的含量結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)年收獲籽粒樣品高含量組的樣品總含量在60~70 mg/kg范圍級(jí)別,中等含量在50~60 mg/kg級(jí)別,低含量組在36~50 mg/kg級(jí)別。已知玉米的香氣物質(zhì)含量在糧食作物中相對(duì)較低,低于小麥[11],小麥中也鮮有絕對(duì)含量報(bào)道,因此成熟玉米籽粒中的揮發(fā)物含量還需更多的測(cè)定和特定內(nèi)標(biāo)物的利用。
本研究期望鑒定出成熟玉米籽粒中的關(guān)鍵性香味物質(zhì)及含量,建立玉米食用品質(zhì)的核心指標(biāo),但關(guān)鍵性成分的鑒定,需較多的研究結(jié)果支持。所謂關(guān)鍵性成分,一般認(rèn)為,一是有典型的玉米香味,二是含量較高[1?3]。上世紀(jì)70年代國外在甜玉米中鑒定出二甲基硫醚是特征香味物質(zhì)[4],但該物質(zhì)是在加熱中產(chǎn)生的,在生玉米中不存在。非甜玉米中很少檢測(cè)到二甲基硫醚[22],籽粒玉米均是非甜玉米,因此不易檢測(cè)到該物質(zhì)。還有研究認(rèn)為乙酸乙酯是玉米高含量香氣物質(zhì)[23],但馬良等[13]檢測(cè)玉米陳化0、60、120和180 d后的香氣物質(zhì)變化,只有120 d樣品檢測(cè)到乙酸乙酯,這表明玉米的香味物質(zhì)在籽粒中不穩(wěn)定,不同品種可能不同。馬良等[13]認(rèn)為玉米香味的關(guān)鍵性物質(zhì)不是一種或少數(shù)幾種,而是一組,本研究發(fā)現(xiàn)高含量物質(zhì)正十二烷和叔丁醇,還有特有的高含量成分,如甲基3,6-十八碳二炔酸酯,可認(rèn)為是重要揮發(fā)性物質(zhì),是否關(guān)鍵組分,還需進(jìn)一步鑒定和更多檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果中檢測(cè)到3個(gè)影響香氣物質(zhì)種類和含量改變的因素。第一是品種。過去幾乎所有的報(bào)道,主要是糯質(zhì)、甜質(zhì)品種的報(bào)道,均表明香氣物質(zhì)種類和含量在品種間存在差異[7?13,24?25],本研究結(jié)果也顯示籽粒品種之間存在顯著差異,這表明該差異是品種特性,因而意味著食用玉米品種可改良,可創(chuàng)新優(yōu)質(zhì)品種;第二是產(chǎn)地。9#樣品品種是鄭單958,香氣物質(zhì)屬中等含量類型,但種植在河南欒川地區(qū),品質(zhì)明顯提高,該地區(qū)海拔較高,夏季溫度較低,該地區(qū)生產(chǎn)的玉米比較平原地區(qū)夏種秋收的玉米籽粒,外觀胚乳角質(zhì)化程度高,粥制食品顏色鮮黃,香氣濃郁,食用品質(zhì)好,2017年收存的樣品,3年后檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)仍在高含量水平,這表明,對(duì)玉米來說,在高海拔溫涼地區(qū)種植品質(zhì)更佳。已有報(bào)道,同一品種不同產(chǎn)地,其淀粉、蛋白質(zhì)含量等食用品質(zhì)也存在顯著差異[15];第三是貯存。安全貯存能保持農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)鮮品質(zhì),延長保質(zhì)期,加工業(yè)和居民均十分關(guān)注。從檢測(cè)結(jié)果可看出,開放保存的玉米穗、玉米粉,香氣物質(zhì)損失嚴(yán)重,整穗保存每年損失15%以上,磨粉非密封保存每年損失30%以上,但密封保存的9#樣品,揮發(fā)性物質(zhì)損失很少。馬良等[13]也有相同結(jié)果,其在25 ℃密閉空間貯存玉米籽粒180 d,除酮類物質(zhì)有所下降外,其他揮發(fā)性物質(zhì)沒有大的改變,宋江峰等[24]詳盡分析了甜糯玉米在軟包裝下成分的變化,論述了密封包裝的保鮮作用,這種目前成熟的包裝技術(shù),對(duì)提高玉米初加工后的粉、糝產(chǎn)品保質(zhì)期有顯著增加作用。