基于響應(yīng)面法和熵權(quán)法優(yōu)化連翹葉中連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取工藝

劉路路，李 可，韋智江，郭 然，趙梓邯，代 熙，李衛(wèi)東

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京102488）

連翹葉是木犀科植物連翹（Forsythia suspensa（Thunb.） Vahl）的干燥葉片?！吨腥A本草》記載“連翹莖葉，性寒，主治心肺積熱”[1]。連翹葉的生物活性成分包括苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類、有機(jī)酸類、萜類等化合物[2?3]?，F(xiàn)代藥理研究表明連翹葉具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝、降血糖血脂等作用[4?9]。連翹葉生物量大，活性多樣，但由于連翹的主要用藥部位是果實(shí)，生產(chǎn)中大量連翹葉被丟棄，目前其開發(fā)利用僅限于小部分地區(qū)連翹茶的應(yīng)用，這造成了極大的資源浪費(fèi)及巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10?11]。2017年，國(guó)家正式批準(zhǔn)連翹葉作為新資源食品，為連翹葉的深度開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和政策支持。

目前連翹葉多采用熱水浸提、回流等效率較低的方法進(jìn)行提取，而超聲作為一種提取效率高、耗時(shí)短、應(yīng)用范圍廣的方法，在連翹葉上的應(yīng)用研究較缺乏。此外，連翹葉的提取多針對(duì)連翹酯苷A、連翹苷等單一成分[12?15]，有關(guān)連翹葉多指標(biāo)成分的提取工藝研究報(bào)道較少。研究表明，連翹葉中連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的含量均高于作為藥材原料入藥的連翹果實(shí)中的含量[16]，且具有抗氧化[7,17?19]、抗菌抗病毒[5?6,20]、降血脂[21]、神經(jīng)保護(hù)[22?23]等多種藥理活性，共同構(gòu)成連翹葉發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此本研究以此三個(gè)活性成分為指標(biāo)，采用效率高、時(shí)間短的超聲提取法，對(duì)提取過(guò)程中的關(guān)鍵因素，即乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度加以考察。并采用熵權(quán)法計(jì)算連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的相關(guān)權(quán)重，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM），優(yōu)選提取工藝，為連翹葉資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

連翹葉 2020年8月采自山西省安澤縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李衛(wèi)東研究員鑒定為木犀科連翹屬植物連翹的葉，置通風(fēng)處陰干，粉碎過(guò)4號(hào)篩，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆茫贿B翹酯苷A（批號(hào)：PS000582）、連翹苷（批號(hào)：PS000579） 成都普斯生物科技公司；蘆?。ㄅ?hào)：T27F10Z81699） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇分析純，北京化工廠；醋酸 分析純，北京化學(xué)試劑公司；乙腈 色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

Waters alliance型高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測(cè)器、Empower軟件系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；BT25S型1/100000電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型真空泵 上海亞榮生化儀器廠；DFY-200C型搖擺式高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；FD-2A型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC含量測(cè)定方法的建立

1.2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含連翹酯苷A 1.880 mg、連翹苷0.700 mg和蘆丁1.000 mg的混合對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取連翹葉粉末（過(guò)4號(hào)篩）1 g，置于50 mL錐形瓶中，于一定乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度條件下超聲提取，冷卻后于4 ℃下以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，移出上清液后定容至100 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，待用。

1.2.1.3 色譜條件 色譜柱：Waters XbridgeTMshield C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）?0.4%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0~8 min，10%~15% A；8~18 min，15%~22% A；18~25 min，22%~40% A；25~30 min，40%~95% A；30~35 min，95% A）；測(cè)定波長(zhǎng)：277 nm；體積流量：l mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[24]。

1.2.1.4 線性關(guān)系考察 依次稀釋“1.2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別稀釋2、4、8、16、32倍，甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。

1.2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“1.2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁峰面積的RSD。

1.2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品粉末，平行6份。按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的提取量及RSD。

1.2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，按“1.2.1.3”項(xiàng)下色譜條件在0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁峰面積的RSD。

1.2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知各指標(biāo)成分含量的連翹葉供試品粉末0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入等量的連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁對(duì)照品，按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算得到連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的平均加樣回收率及RSD。

1.2.1.9 指標(biāo)成分的提取量測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。采用外標(biāo)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各指標(biāo)成分質(zhì)量濃度，根據(jù)公式計(jì)算提取量。

式中：M表示指標(biāo)成分提取量，mg/g；C表示通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到的指標(biāo)成分質(zhì)量濃度，mg/mL；100為定容的體積；W表示稱樣量，g。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 不同乙醇濃度對(duì)連翹葉中活性成分提取量的影響 液料比30:1 mL/g，提取時(shí)間30 min，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%對(duì)連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.2 不同液料比對(duì)連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，提取時(shí)間30 min，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1 mL/g對(duì)連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察提取時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.4 不同提取溫度對(duì)連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取時(shí)間30 min。在其它條件固定的情況下，考察提取溫度20、30、40、50、60 ℃對(duì)連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察因素，各指標(biāo)成分提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)分（M）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 11.0.4.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選各因素最優(yōu)組合條件。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，響應(yīng)面優(yōu)化分析及方差分析采用Design-Expert 11.0.4.0軟件，作圖采用GraphPad Prism 8.0.1軟件。

采用熵權(quán)法對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)。首先對(duì)數(shù)據(jù)xij根據(jù)式1進(jìn)行歸一化處理，得到歸一化數(shù)據(jù)再根據(jù)式2得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)pij，再根據(jù)式（3）計(jì)算第j個(gè)指標(biāo)的信息熵Hj，得到的各指標(biāo)信息熵根據(jù)式4轉(zhuǎn)化為熵權(quán)wj，即得評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵值。

式中：xij表示第i次試驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的提取量值； m in(xi)為第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的提取量最小值；max(xi)為 第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的提取量最大值；x′ij表示第i次試驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的歸一化值；pijij表示第i次試驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值；Hj表示第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵值；wj表示第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵權(quán)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC含量測(cè)定方法的結(jié)果

2.1.1 色譜圖 “1.2.1.3”項(xiàng)色譜條件下對(duì)照品及樣品的色譜圖顯示3種指標(biāo)成分在檢測(cè)波長(zhǎng)下分離良好，與對(duì)照品保留時(shí)間相同，見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）與供試品溶液（B）HPLC色譜圖（277nm）Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B) (277 nm)

2.1.2 線性關(guān)系 “1.2.1.4”項(xiàng)下得到各指標(biāo)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍，見表2，顯示連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁分別在0.058~1.880、0.022~0.700、0.031~1.000 mg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Results of linear relationship investigation

2.1.3 方法學(xué)考察 “1.2.1.5~1.2.1.8”項(xiàng)下得到的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率結(jié)果見表3。結(jié)果表明精密度和重復(fù)性均良好，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，加樣回收率合格，符合定量分析的要求。

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率結(jié)果Table 3 Results of precision, reproducibility, stability and recovery

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同乙醇濃度對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響由圖2可知，連翹酯苷A的提取量隨著乙醇濃度的增加先上升后下降，在乙醇濃度為40%時(shí)達(dá)到峰值，為63.66 mg/g。而連翹苷和蘆丁的提取量則隨乙醇濃度的增加有較小幅度的增加。這和劉偉霞等[25]的結(jié)果基本一致。綜合考慮選擇最佳乙醇濃度為40%，并將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)研究參數(shù)。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響Fig.2 Effects of different ethanol concentration on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.2 不同液料比對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響由圖3可知，三種成分的提取量趨勢(shì)基本一致。當(dāng)液料比增加時(shí)，三種成分的提取量先上升后下降或保持平穩(wěn)。這主要是因?yàn)橐毫媳仍黾?，指?biāo)成分與溶劑邊界層濃度差變大，成分越容易滲透出來(lái)，直至成分在溶劑中的擴(kuò)散達(dá)到了平衡，提取量將不再升高。連翹酯苷A和連翹苷提取量在25:1 mL/g時(shí)達(dá)到峰值，分別為56.79和20.97 mg/g。蘆丁在20:1 mL/g時(shí)達(dá)到峰值，為32.17 mg/g。綜合考慮選擇最佳液料比為25:1 mL/g，并將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)研究參數(shù)。

圖3 不同液料比對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響Fig.3 Effects of different liquid-solid ratios on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響

由圖4可知，三種成分的提取量變化趨勢(shì)較一致，均隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這可能是因?yàn)橹笜?biāo)成分與溶劑邊界層存在濃度差，超聲時(shí)間延長(zhǎng)強(qiáng)化了空化和機(jī)械效應(yīng)，有利于有效成分的溶出[26]。三種成分的提取量均在30 min時(shí)達(dá)到峰值，連翹酯苷A為65.44 mg/g，連翹苷為19.92 mg/g，蘆丁為23.30 mg/g。綜合考慮選擇最佳提取時(shí)間為30 min，并將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)研究參數(shù)。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響Fig.4 Effects of different extraction times on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.4 不同提取溫度對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響

由圖5可知，提取溫度對(duì)連翹酯苷A提取量影響較顯著，對(duì)連翹苷和蘆丁的提取量影響較小。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，連翹酯苷A提取較完全，為57.88 mg/g。隨著提取溫度的繼續(xù)增加，總提取量開始下降，推測(cè)其原因可能是連翹酯苷A分子中具有酯鍵，較高溫度易水解[27]。綜合考慮選擇最佳提取溫度為50 ℃，并將其作為響應(yīng)面試驗(yàn)研究參數(shù)。

圖5 不同提取溫度對(duì)連翹葉多指標(biāo)提取量的影響Fig.5 Effects of different extraction temperature on theextraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表4進(jìn)行Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，研究各因素對(duì)連翹葉連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁提取量和綜合評(píng)分M的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

2.3.1 綜合評(píng)分（M）計(jì)算 本實(shí)驗(yàn)采用熵權(quán)法對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)。熵權(quán)法是一種用于衡量指標(biāo)的離散程度的客觀賦權(quán)法，離散程度越大，表明該指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響越大[28]，已廣泛應(yīng)用于提取工藝研究[29?31]。本研究利用信息熵這個(gè)工具，計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重，最終計(jì)算得到連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的權(quán)重值分別為0.2022、0.4204、0.3774。按M=連翹酯苷A提取量×0.2022+連翹苷提取量×0.4204+蘆丁提取量×0.3774，計(jì)算不同試驗(yàn)號(hào)下各指標(biāo)成分綜合評(píng)分（M），結(jié)果見表4。

2.3.2 模型建立及方差分析 利用Design-Expert 11.0.4.0軟件對(duì)表4中綜合評(píng)分M進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸方程M=30.48+2.98A+1.47B+0.3811C+1.30D?0.6789AB?0.9088AC?0.9716AD?0.0121BC?0.1739BD?0.5509CD?1.97A2?0.5733B2?0.5891C2?2.43D2（R2=0.9472）。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知該回歸模型極顯著，說(shuō)明其擬合度及預(yù)測(cè)性良好；模型的一次項(xiàng)A項(xiàng)、B項(xiàng)、D項(xiàng)極顯著（P<0.01），C項(xiàng)不顯著；交互項(xiàng)均不顯著；二次項(xiàng)A2項(xiàng)和D2項(xiàng)影響極顯著（P<0.01），B2項(xiàng)、C2項(xiàng)不顯著；這表明各因素與綜合評(píng)分M間并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)的P值為0.1922>0.05，對(duì)綜合評(píng)分M影響不顯著，說(shuō)明該模型的擬合度良好，可以利用該模型確定最優(yōu)提取工藝條件。

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Box-Behnken response surface test design and results

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Results of ANOVA

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design-Expert 11.0.4.0軟件根據(jù)模型繪制各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分M影響的響應(yīng)面圖，見圖6。響應(yīng)曲面坡度越大，代表該因素對(duì)響應(yīng)值影響越大。對(duì)比圖6響應(yīng)面圖曲面坡度可知各因素對(duì)綜合評(píng)分M影響大小為乙醇濃度（A）>液料比（B）>提取溫度（D）>提取時(shí)間（C）。根據(jù)模型擬合結(jié)果，預(yù)測(cè)連翹葉最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度為50.01%，液料比為28.41:1 mL/g，提取24.98 min，提取溫度為51.01 ℃，綜合評(píng)分為31.90。

圖6 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on comprehensive score

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取連翹葉粉末3份，按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行處理，考慮實(shí)際操作，將提取工藝調(diào)整為50%乙醇，液料比為28:1 mL/g，提取25 min，提取溫度為51 ℃。按此工藝條件重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。綜合評(píng)分的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值（31.90）的偏差為0.62%。表明該模型基本準(zhǔn)確，響應(yīng)面分析與熵權(quán)法相結(jié)合得到的連翹葉提取工藝參數(shù)穩(wěn)定、可靠。

表6 工藝驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Process validation results

3 結(jié)論

本研究以連翹葉中三種主要活性成分連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，針對(duì)乙醇濃度、液料比、提取溫度及提取時(shí)間進(jìn)行單因素考察，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳提取工藝為乙醇濃度：50%，液料比28:1 mL/g，提取溫度：51 ℃，提取時(shí)間：25 min。該條件下，連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的提取量分別為69.69、22.87、22.46 mg/g，綜合評(píng)分為32.18，符合響應(yīng)面模型驗(yàn)證結(jié)果。影響提取量的四個(gè)因素影響程度大小順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>液料比（B）>提取溫度（D）>提取時(shí)間（C）。該工藝條件簡(jiǎn)單，操作控制容易，穩(wěn)定性好，為連翹葉的綜合開發(fā)利用提供了新途徑。