高產(chǎn)四甲基吡嗪芽孢桿菌的篩選及其對醬香型白酒堆積過程的影響

張 穎，李霄霄，李景輝，劉小敏，謝翔云，盧 君，李長文，張翠英，肖冬光,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 3004571；2.貴州國臺酒業(yè)股份有限公司，貴州仁懷 564501）

四甲基吡嗪（tetramethyl pyrazine，TTMP），是一種天然的香料，具有烤焙、堅果、可可等香氣，可以作為風(fēng)味添加劑[1]。TTMP也是白酒中重要風(fēng)味物質(zhì)的組成成分，賦予白酒一定的保健作用，在不同香型的白酒中含量不同，在醬香型白酒中含量最高。白酒釀造過程中TTMP主要是由芽孢桿菌發(fā)酵代謝合成，一方面微生物通過糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸，兩分子丙酮酸縮合形成α-乙酰乳酸，在α-乙酰乳酸脫羧酶的作用下生成乙偶姻；另一方面微生物酶分解原料中蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生氨，進(jìn)而乙偶姻和氨發(fā)生非酶促反應(yīng)合成TTMP。

通過分離篩選高產(chǎn)TTMP的微生物進(jìn)而來穩(wěn)定和提高白酒中四甲基吡嗪含量是一種常用的手段，徐巖等[2]將具有相應(yīng)釀造功能的微生物菌劑進(jìn)行復(fù)配組合，使用菌劑生產(chǎn)的芝麻香型白酒頭段酒中的吡嗪類物質(zhì)含量達(dá)到175 μg/L，相比未使用菌劑提高了33.6%。袁建國等[3]通過添加芽抱桿菌B-010，使芝麻香型白酒中的TTMP含量由0.4 mg/L提高到1.8 mg/L；張溫清[4]將高產(chǎn)TTMP芽孢桿菌菌液接入芝麻香型白酒堆積糟醅中培菌后入窖發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種功能菌 XJB-104原酒中TTMP含量從0.06 mg/L增加到1.39 mg/L；王曉丹等[5]從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌添加到窖池中層的糟醅中，按照粹沙工藝制酒取樣，結(jié)果最佳菌株添加量為5%，此時發(fā)酵后的酒醅TTMP含量為6.81 μg/g，是對照組的3.03倍，酒樣中TTMP相對百分含量為0.028%。

TTMP在醬香型、芝麻香型和兼香型白酒中的含量顯著高于其它香型白酒的主要原因，是都有堆積培菌過程，在堆積糟醅中有較高的含氧量，有利于好氧芽孢桿菌的生長代謝，合成較多的TTMP。如直接入窖發(fā)酵，糟醅中的氧在發(fā)酵前期很快被兼性厭氧的酵母菌等微生物耗盡，好氧芽孢桿菌的生長與TTMP的合成將受到限制。本研究從醬香型白酒大曲中篩選出的1 株高產(chǎn)TTMP的地衣芽孢桿菌，并將其種子液添加到醬香型白酒第5輪次的酒醅中進(jìn)行堆積培菌，探究地衣芽孢桿菌對堆積培菌過程的影響，進(jìn)而探討在醬香白酒生產(chǎn)中使用的可行性，旨在通過該菌劑強(qiáng)化堆積培菌過程提高白酒中的TTMP含量，從而改善白酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糟醅、高溫大曲 貴州國臺酒業(yè)公司；氫氧化鈉、斐林試劑、葡萄糖、硫酸、甲醛、鹽酸等 均為國產(chǎn)分析純；四甲基吡嗪、乙偶姻、無水乙醇 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA提取試劑盒 成都福際生物技術(shù)有限公司。

7890B氣相色譜儀、1200SL液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；CX21FS1型生物顯微鏡 日本OLYMPUS會社；LD5-10離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基與溶液 分離培養(yǎng)基的配制。LB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基的配制。干酪素10.0 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH為7.0~7.2，121 ℃滅菌20 min。

一級種子培養(yǎng)基的配制。LB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

代謝發(fā)酵培養(yǎng)基的配制。12°BX高粱水解液，酵母浸粉15 g/L，K2HPO45 g/L，NaCl 5 g/L，pH調(diào)至6.0，于115 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。貴州國臺酒第5輪次蒸酒后糟醅。

0.1 mol/L PBS緩沖液：A液（0.1 mol/L KH2PO4）：1.361 g KH2PO4溶于100 mL蒸餾水；B液（0.1 mol/L Na2HPO4）：1.78 g Na2HPO4·2H2O溶于100 mL蒸餾水；A液與B液按照1:19的比例混合，pH為8.0，于115 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2.2 高產(chǎn)蛋白酶活力芽孢桿菌菌株的分離與篩選

1.2.2.1 菌種分離 稱取大曲粉10 g，放入含有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶，在85 ℃水浴10 min，以200 r/min轉(zhuǎn)速在37 ℃振蕩培養(yǎng)箱過夜擴(kuò)培，吸取培養(yǎng)液1 mL，放入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，吹吸混勻，按上述操作繼續(xù)稀釋，稀釋到1×10?6，取稀釋度為1×10?4~1×10?6各1 mL分別涂板分離，以37 ℃培養(yǎng)24 h。分離出不同菌落形態(tài)的菌株，將菌株劃線純化，于?80 ℃下超低溫保存。

1.2.2.2 高產(chǎn)蛋白酶活力菌株的篩選 蛋白酶透明圈實(shí)驗：將分離得到的菌株用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基做透明圈實(shí)驗，以透明圈作為考察指標(biāo)進(jìn)行初篩。將菌株以點(diǎn)接法接種到酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d后觀察透明圈大小，并用直尺測量透明圈直徑D（mm）和菌落直徑d（mm）的比值（D/d），選出能產(chǎn)生較大透明圈的菌株。

1.2.3 高產(chǎn)TTMP菌株的篩選與分子鑒定

1.2.3.1 高產(chǎn)TTMP菌株的篩選 一級培養(yǎng)：將分離出的芽孢桿菌經(jīng)活化后接入LB種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

代謝發(fā)酵：按5%接種量接入裝有50 mL代謝培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，以200 r/min轉(zhuǎn)速在43 ℃下振蕩培養(yǎng)84 h。代謝發(fā)酵結(jié)束后，利用HPLC檢測發(fā)酵液中乙偶姻和四甲基吡嗪含量。

1.2.3.2 分子鑒定 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒對各菌株提取菌株基因組DNA，利用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物交由上海金唯智公司進(jìn)行測序鑒定，對菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析。

1.2.4 地衣芽孢桿菌GTBL-168對醬香型白酒堆積過程的影響 在糟醅中加入7%的大曲粉拌勻，每個250 mL三角瓶中分裝120 g，挑選代謝發(fā)酵液中TTMP含量最高的菌株，將其發(fā)酵液作為種子液按照0%、3%、5%、7%的比例接種于拌有大曲的糟醅中，拌勻，6層紗布封口，30 ℃堆積12 h，37 ℃堆積36 h，在無菌條件換成膠塞后繼續(xù)在45 ℃下堆積24 h，同時做平行實(shí)驗，測定堆積結(jié)束后糟醅的乙偶姻和TTMP含量、理化指標(biāo)及菌群結(jié)構(gòu)。

1.2.5 乙偶姻含量的檢測方法 發(fā)酵液樣品的前處理：取發(fā)酵液2 mL，12000 r/min離心5 min，取上清，用流動相5 mmol/L的稀硫酸溶液稀釋10倍后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，直接進(jìn)樣。

堆積糟醅樣品的前處理：取10 g糟醅加100 mL蒸餾水超聲30 min，12000 r/min離心2 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的水相膜過濾后進(jìn)行液相色譜檢測。

高效液相色譜條件：Aglient HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），檢測器為示差檢測器（RID）（45 ℃），柱溫65 ℃，流動相為5 mmol/L的稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

采用HPLC檢測乙偶姻含量，通過外標(biāo)法進(jìn)行乙偶姻的定量分析，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=190998x?52137，R2=0.9935。

1.2.6 TTMP含量的檢測方法

1.2.6.1 發(fā)酵液中TTMP的測定方法 樣品的前處理：取發(fā)酵液2 mL，12000 r/min離心5 min，取上清，用40%乙醇溶液稀釋10倍后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，直接進(jìn)樣。

高效液相色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18（4.6×250 mm），紫外（Ultra Violet，UV）檢測器，以甲醇:水（v/v）=35:65作為流動相，柱溫40 ℃，流速為1 mL/min，檢測波長278 nm，檢測時間45 min，進(jìn)樣量20 μL。

采用HPLC檢測發(fā)酵液中TTMP含量，通過外標(biāo)法進(jìn)行TTMP的定量分析，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=63.563x?0.4614，R2=1。

1.2.6.2 堆積糟醅中TTMP的檢測方法 樣品的前處理：取50 g堆積培養(yǎng)結(jié)束后的糟醅加5 mL無水乙醇和200 mL蒸餾水進(jìn)行蒸餾，接取100 mL餾分，將餾分經(jīng)0.22 μm無機(jī)濾膜過濾后直接進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜分析，分析餾分中TTMP含量。

氣相色譜條件：色譜柱 HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為純度 99.99%的氮?dú)?；柱流速?.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度150 ℃；程序升溫，起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL；分流進(jìn)樣，分流比為10:1。

采用GC檢測堆積糟醅中TTMP含量，通過外標(biāo)法進(jìn)行TTMP的定量分析，標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=212.9x?230.85，R2=0.9995。

1.2.7 堆積糟醅理化指標(biāo)的測定 酸度的測定：采用酸堿滴定指示劑法；殘淀粉的測定：采用斐林試劑法；氨基酸態(tài)氮的測定：酸度計法；殘?zhí)堑臏y定：斐林試劑法。具體參照DB 34/T 2264-2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》[6]。

1.2.8 糟醅群落組成分析

1.2.8.1 樣品的前處理 將100 mL PBS緩沖液（pH8.0）和酒醅樣品充分混合，使用布氏漏斗過濾混合液體，并用200 mL PBS緩沖液沖洗濾渣3~5次。將濾液在7000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集底部菌泥于?20 ℃保存。

1.2.8.2 群落組成分析 將預(yù)處理后的樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進(jìn)行16S和ITS測序，按照QIIME2 dada2分析流程進(jìn)行序列去噪或OTU聚類，使用云平臺分析菌落多樣性指數(shù)及群落組成變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS23分析實(shí)驗數(shù)據(jù)，各實(shí)驗均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均通過方差（ANOVA）方法進(jìn)行分析，所有均值均以P<0.05的水平進(jìn)行分離。通過差異分析了不同實(shí)驗數(shù)據(jù)的意義。所得數(shù)據(jù)均使用Origin軟件繪制數(shù)據(jù)柱狀圖?；贗llumina MiSeq測序平臺，群落組成圖利用R語言工具進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)蛋白酶活力芽孢桿菌菌株的分離與篩選

蛋白酶分解蛋白質(zhì)生成的氨基酸為釀造體系提供N源，同時也是風(fēng)味前體物質(zhì)，氨基酸進(jìn)一步分解生成氨，為合成TTMP提供了前體物質(zhì)。按照1.2.2.2的方法進(jìn)行蛋白酶透明圈實(shí)驗，測得其透明圈直徑與菌落直徑比值HC值，結(jié)果如表1所示。菌株144的HC值最大，說明其對培養(yǎng)基中干酪素的分解利用能力較強(qiáng)，即產(chǎn)蛋白酶的活力較高。挑選HC值大于等于1.3的菌株進(jìn)行液態(tài)代謝發(fā)酵。

表1 透明圈HC值Table 1 HC value of the transparent circle

2.2 產(chǎn)TTMP芽孢桿菌的篩選與鑒定

白酒中的TTMP由乙偶姻和氨反應(yīng)生成。按照1.2.5和1.2.6的方法測定發(fā)酵液中乙偶姻和TTMP的含量，實(shí)驗結(jié)果如圖1所示。5株芽孢桿菌中有2株產(chǎn)TTMP，其中菌株GTBL-168產(chǎn)乙偶姻含量為17.51 g/L，產(chǎn)TTMP含量為12.22 mg/L。對照表1蛋白酶活性大小，菌株GTBT-144雖具有較高的蛋白酶活力，但產(chǎn)乙偶姻較少，而菌株GTBT-90乙偶姻含量較多，但蛋白酶活力相對較低，均未合成TTMP。因此，高產(chǎn)TTMP的功能菌篩選需同時具有較高的產(chǎn)蛋白酶和乙偶姻能力，該菌才可能代謝生成高含量的TTMP。

圖1 液態(tài)發(fā)酵液中乙偶姻、TTMP含量Fig.1 Content of acetoin and TTMP in liquid fermentation broth

按照1.2.3.2的方法，將菌株GTBL-168測序結(jié)果提交至NCBI，并進(jìn)行BLAST同源性比對，菌株GTBL-168與地衣芽孢桿菌的同源性達(dá)到99%以上，用 MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將菌株GTBL-168鑒定為一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖2 菌株GTBL-168 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain GTBL-168 based on the 16S rDNA gene homology

2.3 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積過程酒醅理化指標(biāo)的影響

在酒的生產(chǎn)過程中，受不同的原料、菌種和生產(chǎn)工藝等因素的影響，酒的風(fēng)味各有不同，醬香型白酒獨(dú)特的高溫堆積和高溫制曲工藝對醬香風(fēng)味有重要作用。在堆積過程加入功能芽孢桿菌與傳統(tǒng)大曲協(xié)同堆積發(fā)酵，影響菌群結(jié)構(gòu)，酒醅的理化指標(biāo)受到影響，從而影響酒的質(zhì)量。

按照方法1.2.7測定堆積后糟醅的理化指標(biāo)，結(jié)果如圖3所示，在堆積過程結(jié)束后的糟醅中，相比于對照組實(shí)驗，功能芽孢桿菌的添加對堆積過程各理化指標(biāo)影響較明顯，當(dāng)接種量為7%時，總酸含量和氨基氮含量有所增加，氨基氮的增加促進(jìn)了產(chǎn)酸菌的生長，從而總酸含量也有所提高。地衣芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶最適作用pH為7.0[7]，而糟醅酸度較大，不適于蛋白酶發(fā)揮作用，因此氨基氮含量較對照組差異不顯著，芽孢桿菌接種量不斷增加至7%時，才有一定的積累。

圖3 堆積糟醅中理化指標(biāo)情況Fig.3 Physical and chemical indicators in piled fermented glutinous rice

2.4 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積糟醅中乙偶姻和TTMP含量的影響

按照方法1.2.5和1.2.6分別檢測糟醅中乙偶姻的含量和糟醅餾分中TTMP的含量，結(jié)果如圖4所示，加菌組較空白組的酒醅中乙偶姻含量隨接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為7%時乙偶姻含量為6.05 g/L，較對照組2.23 g/L增加了171.30%，同時TTMP含量也有所增加，當(dāng)接菌量為7%時含量為2.66 mg/L，比對照組增加了24.88%。據(jù)報道乙偶姻和氨合成TTMP的最適pH為6.5[8]，本次堆積實(shí)驗中乙偶姻提高幅度大，而TTMP增加幅度較小，可能是由于白酒糟醅酸度較大，且體系中氨的含量較少，不利于乙偶姻轉(zhuǎn)化合成TTMP。

圖4 堆積糟醅中乙偶姻和TTMP含量Fig.4 Content of acetoin and TTMP in the piled grains

2.5 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積過程菌群結(jié)構(gòu)的影響

利用16S、ITS測序技術(shù)對添加不同量功能菌進(jìn)行堆積發(fā)酵實(shí)驗后的糟醅中微生物進(jìn)行多樣性分析。對測序結(jié)果進(jìn)行嵌體過濾，得到有效數(shù)據(jù)，后續(xù)所有分析將建立在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

2.5.1 堆積過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.5.1.1 細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 細(xì)菌測序結(jié)果共得到498423條高質(zhì)量的序列，平均每個樣本具有124605±7059條序。在OTU聚類結(jié)果中，對樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，可估算環(huán)境群落物種的豐度和多樣性[9]。分別用Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)表示菌群豐富度指數(shù)和菌群多樣性指數(shù)。Shannon可估計微生物多樣性，Shannon值越大，群落多樣性越高。Chao指數(shù)是用Chao1算法估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù)，值越大代表物種總數(shù)越多。

各堆積樣本細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)如表2所示，按照相似性將得到的樣品所對應(yīng)的分類序列條數(shù)歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中，接種量為3%的堆積糟醅中OTU數(shù)量最多，共2229個，所有樣品共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為170；Chao值代表細(xì)菌豐富度指數(shù)，Shannon值代表細(xì)菌多樣性指數(shù)，各堆積酒醅樣品的Chao1指數(shù)在1586.38~3107.84之 間，Shannon指 數(shù) 在5.36~6.92之間，接種量為3%的堆積糟醅的Shannon指數(shù)最高，值為6.92；所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.9826~0.9926之間，所以測序結(jié)果能夠完整反映各接種量堆積糟醅樣品細(xì)菌菌群組成信息?？梢姽δ芫奶砑訉Χ逊e過程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)有所影響。

表2 酒醅細(xì)菌菌落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of bacteria community sequencing data of fermented grains

2.5.1.2 不同接種量堆積樣品細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析對比不同接種量堆積糟醅中屬水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，四個堆積糟醅中細(xì)菌屬水平TOP10如圖5所示，其中豐度大于1%的有9個屬，包括鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、氣單孢菌屬（Aeromonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、Muribaculaceae屬。其中，有4個屬豐度較高，是堆積過程的絕對優(yōu)勢菌屬，分別是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。其中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）占絕對優(yōu)勢，相對豐度為24.55%~37.12%，且豐度隨著功能菌接種量的變化而變化?？肆_彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）相對豐度為18.58%~38.58%，豐度隨著功能菌接種量的增加而增加，豐度從最初的18.58%增加至38.58%。芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度隨著功能菌接種量的增加而增加，從最初的4.99%增加至12.21%。海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）隨接種量的增加先增加后減少，接種量為3%時豐度最大，為6.44%。

圖5 屬水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析Fig.5 Distribution of bacterial community structure at genus level

鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）廣泛存在于堆積酒醅中，具有較強(qiáng)的代謝能力，可將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成酸?？梢酝茰y該菌屬可能是導(dǎo)致堆積糟醅酸含量較高的重要原因?？肆_彭斯特菌屬（Kroppenstedtia），是高溫大曲中細(xì)菌厚壁菌門（Firmicutes）的第2優(yōu)勢菌屬，且是一種嗜熱菌屬[10]。王歡等[11]也發(fā)現(xiàn)其為醬香白酒機(jī)械化釀造的核心細(xì)菌屬。目前在白酒中的作用尚不明確。在洋河大曲評定高通量測序中，為優(yōu)等曲的優(yōu)勢菌屬，是有益菌[12]。袁再順[2]發(fā)現(xiàn)其與酸性蛋白酶，纖維素酶，糖化酶和液化酶的活力呈顯著正相關(guān)。芽孢桿菌屬（Bacillus）是白酒醬香風(fēng)味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)菌屬，是產(chǎn)四甲基吡嗪的主要菌種?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生典型的醬香風(fēng)味，氣質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)這倆株菌代謝產(chǎn)生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亞麻酸等新的風(fēng)味成分[13]。一些枯草芽孢桿菌、環(huán)狀芽抱桿菌等均有較強(qiáng)的蛋白酶和淀粉酶活力，可以降解原料中的大分子物質(zhì)[14]。其隨著接種量的增加豐度不斷增加，與在接種量7%時TTMP含量最高相吻合，可見其是堆積糟醅中TTMP的主要功能菌。海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus），主要分布于深海環(huán)境、發(fā)酵食品與發(fā)酵設(shè)備[15]。在醬香型白酒高溫大曲傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲過程中第二次翻曲階段，該屬為主要菌屬，但具體功能未見報道[16]。且該屬的某些物種可以用于生產(chǎn)工業(yè)酶制劑，包括氧化酶、淀粉酶、過氧化氫酶、酯酶和脲酶等[17]。

2.5.2 堆積過程中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.5.2.1 真菌群落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 真菌測序結(jié)果共得到514831條高質(zhì)量的序列，平均每個樣本具有128707±16879條序列。分別用Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)表示菌群豐富度指數(shù)和菌群多樣性指數(shù)。各堆積樣本真菌群落測序數(shù)據(jù)如表3所示，按照相似性將得到的樣品所對應(yīng)的分類序列條數(shù)歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit, OTU）。其中，空白實(shí)驗的堆積糟醅中OTU數(shù)量最多，共104個，所有樣品共有的真菌OTU數(shù)量為31；Chao值代表真菌豐富度指數(shù)，Shannon值代表真菌多樣性指數(shù)，各堆積酒醅樣品的Chao1指數(shù)在71.50~118.10之間，Shannon指數(shù)在1.95~2.63之間，接種量為7%的堆積糟醅的Shannon指數(shù)最高，值為2.63；所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999958~0.999984之間，所以測序結(jié)果能夠完整反映各接種量堆積糟醅樣品真菌菌群組成信息。可見功能菌的添加對堆積過程真菌菌群結(jié)構(gòu)有所影響。

表3 酒醅真菌菌落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 3 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

2.5.2.2 不同接種量堆積樣品真菌種群結(jié)構(gòu)分析對比不同接種量堆積糟醅中屬水平下真菌群落結(jié)構(gòu)組成，將豐度低于1%的菌屬合并在“其他”中顯示，四個堆積糟醅中真菌屬水平TOP10如圖6所示，其中豐度大于1%的有9個屬，主要包括紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、毛霉屬（Mucor）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、雞土從菌屬（Termitomyces）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）。其中，有5個屬豐度較高，是堆積過程的優(yōu)勢菌屬，分別是紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）。其中紅曲霉屬（Monascus）相對豐度為4.91%~10.79%，豐度隨著功能菌接種量的變化而變化。Rasamsonia屬相對豐度為3.48%~7.57%，在接種量3%時豐度最大。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）相對空白來說，添加功能菌后的堆積糟醅中其相對豐度均有所增加，且接種量3%時豐度最大。

圖6 屬水平下真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析Fig.6 Distribution of fungal community structure at genus level

紅曲霉屬（Monascus），是白酒釀造過程中的重要功能菌屬，有較高的糖化酶、蛋白酶等多種酶活力，同時具有較強(qiáng)的酯化能力，且在白酒釀造中產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，從而平衡協(xié)調(diào)口感，增強(qiáng)酒體的綿柔度[18]。其也是紅心曲中主要產(chǎn)紅色素的優(yōu)勢菌株。固態(tài)發(fā)酵時可以產(chǎn)酯類物質(zhì)，在醬香型白酒中發(fā)現(xiàn)有紅曲霉的大曲是好曲[19]。紅曲霉可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和酯酶，且具有生產(chǎn)紅曲色素、Lovastatin、麥角固醇和乙醇的能力[20]。芽孢桿菌的添加使紅曲霉相對豐度降低，可能是因為其他菌屬因氮源增加而豐度增加，但紅曲霉生長較慢，從而使相對豐度減少。Rasamsonia屬是一種絲狀真菌，在堆積糟醅及大曲的微生物多樣性實(shí)驗中均有發(fā)現(xiàn)[21?23]，目前功能尚不明確。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），是醬香型白酒大曲中的優(yōu)勢菌群[24]，能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定的水解酶，在白酒釀造過程中能夠降解原料中的淀粉或纖維素大分子物質(zhì)，是重要的功能菌屬[25]。曲霉屬（Aspergillus）也是一種絲狀真菌，該菌屬為醬香型白酒大曲和酒醅中的優(yōu)勢菌屬，環(huán)境耐受性較強(qiáng)，可以同時分泌產(chǎn)生糖化酶和蛋白酶，是醬香型白酒釀造過程中的重要產(chǎn)酶功能菌[26]。其可以調(diào)控大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力，并且代謝產(chǎn)生有機(jī)酸等，催化生成芳香脂類物質(zhì)，進(jìn)而改善酒體風(fēng)味[27]。嗜熱真菌屬（Thermomyces）是醬香型白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌屬，能產(chǎn)生高活力且耐熱的纖維素酶、蛋白酶等酶類，有利于微生物的繁殖生長代謝以及產(chǎn)酒生香[16]。

3 結(jié)論與討論

從大曲中分離出了13株菌，并挑選出蛋白酶透明圈HC值大于等于1.3的5株菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果篩選出了一株產(chǎn)TTMP含量較高的地衣芽孢桿菌GTBL-168，其產(chǎn)乙偶姻含量為17.51 g/L，產(chǎn)TTMP含量為12.22 mg/L；結(jié)合產(chǎn)蛋白酶情況可以發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)TTMP的功能菌需同時具有較高的產(chǎn)蛋白酶和乙偶姻能力，該菌才可能代謝生成高含量的TTMP，研究結(jié)果為進(jìn)一步選育高產(chǎn)TTMP菌株提供了理論指導(dǎo)。

將該功能菌株的液態(tài)發(fā)酵液作為種子液添加到拌有大曲的糟醅中協(xié)同堆積培養(yǎng)，通過加菌組和空白組酒醅的對比，該功能芽孢桿菌提高了堆積糟醅中TTMP的含量，當(dāng)接菌量為7%時增量最大，乙偶姻含量為6.05 g/L，較對照組2.23 g/L增加了171.30%，TTMP含量為2.66 mg/L，比對照組增加了24.88%，可能是因為糟醅酸度較高且氨含量不足，因此乙偶姻轉(zhuǎn)化合成TTMP效率較低，而氨含量的不足可能是因為蛋白酶活力不高導(dǎo)致的。如果對該菌株通過誘變等手段提高其蛋白酶活力，則可能會大輻度提高TTMP的產(chǎn)量。

功能菌的添加對堆積過程糟醅的理化性質(zhì)影響較明顯，氨基氮含量和總酸均有所提高，推測是氨基氮的提高促進(jìn)了產(chǎn)酸菌的生長；堆積糟醅中除紅曲霉屬以外的其他優(yōu)勢細(xì)菌屬和真菌屬相對豐度均有所增加，可能是因為芽孢桿菌的添加提高了糟醅中氮源含量從而促進(jìn)了其他菌屬的生長，而紅曲霉生長速度較慢導(dǎo)致相對豐度降低；且糟醅中芽孢桿菌屬豐度的增加與TTMP含量增加相吻合。地衣芽孢桿菌GTBL-168的添加對白酒整體風(fēng)味的影響，有待通過進(jìn)一步生產(chǎn)試驗驗證。