糞便HMGB1、AI-2和HBD2在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中的臨床意義及與腸道菌群的關(guān)系*

冉亞林，蔣秋容

1.重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院兒科，重慶 400084；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，重慶 400038

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)可較為迅速地進(jìn)展為腸壞死、腸穿孔和多器官衰竭，甚至導(dǎo)致新生兒死亡[1]?，F(xiàn)階段臨床診斷NEC的方法主要包括影像學(xué)和血液學(xué)指標(biāo)，但因病情進(jìn)展迅速，當(dāng)影像學(xué)顯示腸壁異常、門靜脈積氣、腸袢固定、氣腹和腹腔積液時(shí)，NEC往往已經(jīng)處于危重期。新生兒反復(fù)的靜脈穿刺操作難度較大[2-3]，而糞便檢測(cè)指標(biāo)具有便捷、快速、對(duì)新生兒影響小和可多次檢測(cè)的特點(diǎn)，尋找可以在疾病早期診斷NEC和判斷病情的糞便指標(biāo)，具有重要的臨床意義。

高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可被腸道中的炎性細(xì)胞和壞死的上皮細(xì)胞表達(dá)并分泌，從而在糞便中被檢測(cè)到，最新研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1水平在NEC患兒糞便中升高[4]。自誘導(dǎo)分子-2(AI-2)具有在細(xì)菌之間傳遞信息的作用，并參與腸組織的炎性反應(yīng)[5]。人β-防御素2(HBD2)主要由與外界接觸的黏膜細(xì)胞表達(dá)，包括腸黏膜細(xì)胞，其具有殺傷細(xì)菌和免疫趨化的作用，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其在NEC患兒體內(nèi)異常表達(dá)[6]，但是其在NEC中的臨床意義尚不清楚。因此，本研究主要分析糞便HMGB1、AI-2和HBD2在NEC中的臨床意義，以及它們與腸道菌群間的關(guān)系，為臨床更好地診斷NEC提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2019年9月重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院收治的105例NEC患兒作為NEC組，以及同期出生的50例健康新生兒作為對(duì)照組。2組患兒的一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究符合赫爾辛基宣言，獲得重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試新生兒家長(zhǎng)知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組新生兒一般資料比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)日齡2～10 d；(2)經(jīng)組織學(xué)、影像學(xué)等檢查，符合NEC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)患兒臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并獲得性免疫缺陷綜合征、血液性疾病、免疫疾病等患兒；(2)合并惡性腫瘤等患兒。

1.3方法

1.3.1糞便標(biāo)本的采集及檢測(cè) 采集健康新生兒出生2～10 d的糞便標(biāo)本，以及NEC患兒確診入院時(shí)(急性期)和病情好轉(zhuǎn)且母乳喂養(yǎng)3 d后(恢復(fù)期)的糞便標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(試劑盒由上海研謹(jǐn)生物科技有限公司提供)檢測(cè)糞便中HMGB1和HBD2水平，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的方法，分別加入抗體的顯色劑，終止顯色后使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HMGB1和HBD2水平(每克糞便的含量)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)糞便標(biāo)本的AI-2水平，將40 mg糞便標(biāo)本與1.5 mL的AI-2專業(yè)培養(yǎng)基哈維弧菌BB 170(ATCC?14126，美國(guó)ATCC公司)混合，在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后接種到培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)糞便標(biāo)本的生物發(fā)光值，以1 μmol/L的AI-2溶液(美國(guó)Sigma公司)作為對(duì)照，標(biāo)本檢測(cè)值的百分比數(shù)值即為AI-2水平。

1.3.2NEC患兒病情及腸道菌群紊亂程度評(píng)估 使用改良Bell-NEC分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，根據(jù)患兒全身癥狀、胃腸道癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果及治療情況，對(duì)患兒的病情和預(yù)后進(jìn)行分級(jí)評(píng)估，Ⅰ級(jí)和Ⅱa為輕度NEC，Ⅱb和Ⅲ級(jí)為重度NEC。所有患兒在確診當(dāng)日采集糞便標(biāo)本，并立即進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[9]將腸道菌群紊亂程度分為4個(gè)等級(jí)：(1)基本正常，糞便標(biāo)本細(xì)菌總數(shù)處于正常值范圍,革蘭陽(yáng)性菌數(shù)大于革蘭陰性菌數(shù),革蘭陽(yáng)性或陰性球菌少見;(2)Ⅰ度失調(diào)，糞便標(biāo)本細(xì)菌總數(shù)略低于正常值,革蘭陽(yáng)性菌數(shù)小于革蘭陰性菌數(shù),革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌增多;(3)Ⅱ度失調(diào)，糞便標(biāo)本細(xì)菌總數(shù)明顯低于正常值,革蘭陰性桿菌總數(shù)增多,革蘭陽(yáng)性球菌數(shù)目較多,有少量酵母樣菌;(4)Ⅲ度失調(diào)，糞便標(biāo)本細(xì)菌總數(shù)極少,未見或很少見革蘭陽(yáng)性或陰性桿菌,酵母樣菌比例較多。分級(jí)越高，腸道菌群紊亂程度越嚴(yán)重。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組及急性期不同病情嚴(yán)重程度NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 根據(jù)Bell-NEC分期，NEC患兒分為輕度NEC組54例，重度NEC組患兒51例。對(duì)照組、輕度NEC組、重度NEC組HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，NEC組糞便HMGB1水平升高，AI-2和HBD2水平降低，且重度NEC組HMGB1水平高于輕度NEC組，AI-2和HBD2水平低于輕度NEC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 對(duì)照組和不同病情嚴(yán)重程度急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.2急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平與NEC病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，糞便HMGB1水平與NEC病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.412，P<0.05)，AI-2和HBD2水平與NEC病情嚴(yán)重程度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.405、-0.381，P<0.05)。

2.3對(duì)照組及不同NEC時(shí)期患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 對(duì)照組、急性期、恢復(fù)期HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，急性期和恢復(fù)期HMGB1水平升高，且恢復(fù)期低于急性期(P<0.05)；急性期AI-2水平低于對(duì)照組及恢復(fù)期，且恢復(fù)期高于對(duì)照組(P<0.05)；急性期和恢復(fù)期HBD2水平低于對(duì)照組，且恢復(fù)期高于急性期(P<0.05)，見表3。

表3 對(duì)照組及不同NEC分期患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.4對(duì)照組及不同腸道菌群紊亂程度急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 對(duì)照組及不同腸道菌群紊亂程度的NEC患兒急性期糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組糞便HMGB1水平<Ⅰ度失調(diào)組<Ⅱ度失調(diào)組<Ⅲ度失調(diào)組(P<0.05)，而對(duì)照組AI-2和HBD2水平>Ⅰ度失調(diào)組>Ⅱ度失調(diào)組>Ⅲ度失調(diào)組(P<0.05)，見表4。

表4 對(duì)照組及不同腸道菌群紊亂程度NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.5急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平與腸道菌群紊亂程度的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，HMGB1水平與腸道菌群紊亂程度呈正相關(guān)(r=0.368，P<0.05)，AI-2和HBD2水平與腸道菌群紊亂程度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.432、-0.406，P<0.05)。

3 討 論

NEC的臨床表現(xiàn)主要為腹脹、嘔吐和便血，但目前尚不清楚其確切病因，且發(fā)病率和病死率始終較高。據(jù)報(bào)道，在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，NEC的發(fā)病率為2%～5%，其中極低出生體質(zhì)量?jī)喊l(fā)病率為4.5%～8.7%，病死率為20%～30%，超低出生體質(zhì)量?jī)翰∷缆蕜t高達(dá)30.0%～50.9%[10-12]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NEC的危險(xiǎn)因素包括早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量狀態(tài)、腸和免疫系統(tǒng)的發(fā)育不成熟，以及配方奶喂養(yǎng)等[13]。此外，最新研究結(jié)果顯示，腸道菌群失調(diào)也與NEC密切相關(guān)[14]，益生菌的破壞和潛在致病菌的過(guò)度生長(zhǎng)是早產(chǎn)兒NEC發(fā)生的重要原因[15-16]。但腸道菌群培養(yǎng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法對(duì)患兒的早期治療提供指導(dǎo)作用，而二代測(cè)序技術(shù)又較為昂貴，應(yīng)用有限。為此，本研究旨在尋找可有效反映NEC病情和判斷腸道菌群失調(diào)情況的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快捷的臨床檢測(cè)指標(biāo)。

HMGB1是一種從受損細(xì)胞中釋放的DNA結(jié)合蛋白，具有類似炎癥細(xì)胞因子的特性，并且可以由巨噬細(xì)胞分泌，也可以由受損的腸黏膜上皮細(xì)胞分泌[17]。HMGB1不但可反映炎癥的嚴(yán)重程度，還可通過(guò)激活Toll樣受體4相關(guān)通路削弱腸道上皮細(xì)胞的遷移和黏附，阻礙組織修復(fù)[18]，而這會(huì)進(jìn)一步引起腸黏膜屏障受損，導(dǎo)致腸道菌群入侵和異常繁殖[19]。本研究結(jié)果顯示，NEC患兒糞便中HMGB1水平明顯升高(P>0.05)，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.412，P<0.05)，而隨著疾病的控制，HMGB1水平則逐漸降低(P>0.05)。本研究結(jié)果還顯示，HMGB1與腸道菌群紊亂程度有關(guān)(r=0.368，P<0.05)。羅若谷等[20]的研究顯示，糞便中HMGB1水平升高，且可作為早期診斷NEC的指標(biāo)，但該研究未分析其與NEC病情的關(guān)系。在成人潰瘍性結(jié)腸炎中，糞便中HMGB1水平升高預(yù)示著病情加重[21]，這提示在NEC患兒中，糞便中HMGB1水平升高可能反映腸道上皮組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，腸黏膜組織受損且組織修復(fù)能力受阻，并且可反映腸道菌群紊亂程度，而隨著病情的改善，腸道細(xì)胞損傷降低，且炎性反應(yīng)得到緩解，從而使HMGB1水平降低。因此，HMGB1水平可作為早期判斷NEC患兒病情和腸道菌群紊亂程度的指標(biāo)，并且其水平降低可能提示病情好轉(zhuǎn)。

腸道菌群紊亂與機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)有關(guān)，近年來(lái)的研究結(jié)果顯示其參與了NEC的發(fā)病進(jìn)程，擬桿菌門/屬細(xì)菌水平的失調(diào)是誘發(fā)NEC的高危因素，并且腸道菌群紊亂程度也與NEC病情具有相關(guān)性[15]。HBD2由腸道細(xì)胞分泌，不但可以調(diào)控免疫反應(yīng)，還具有抑制細(xì)菌過(guò)度繁殖和調(diào)控菌群平衡作用[22]。AI-2是革蘭陰性或者陽(yáng)性菌群之間交流的信號(hào)，當(dāng)AI-2水平降低時(shí)，細(xì)菌過(guò)度繁殖，有研究結(jié)果顯示糞便AI-2作為腸道菌群標(biāo)志物的應(yīng)用，但其在NEC中的臨床意義仍不清楚[23]。本研究結(jié)果顯示，急性期NEC患兒糞便中HBD2和AI-2水平明顯降低(P<0.05)，且與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.405、-0.381，P<0.05)，而隨著疾病的控制，HBD2和AI-2水平逐漸升高，其中AI-2水平高于健康新生兒(P<0.05)。此外，本研究結(jié)果還顯示，HBD2和AI-2水平降低與NEC患兒腸道菌群失衡嚴(yán)重程度有關(guān)(r=-0.432、-0.406，P<0.05。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜中的HBD2水平降低，而病情得到緩解后腸黏膜中表達(dá)的HBD2水平明顯升高[24]。王雨等[25]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損后，HBD2水平降低，會(huì)引起腸道菌群異常。最新研究結(jié)果也顯示，在NEC患兒恢復(fù)期，糞便中AI-2水平會(huì)明顯升高，這期間雖然腸道菌群可能仍舊異常，但病情正在好轉(zhuǎn)[26]。這提示腸黏膜損傷導(dǎo)致的HBD2和AI-2表達(dá)水平降低，會(huì)促進(jìn)腸黏膜細(xì)菌的過(guò)度繁殖，進(jìn)而參與NEC的進(jìn)展，而菌群過(guò)度繁殖也會(huì)進(jìn)一步損傷腸黏膜。在NEC恢復(fù)過(guò)程中，腸黏膜修復(fù)促進(jìn)HBD2的表達(dá)，AI-2水平升高也會(huì)進(jìn)一步調(diào)控菌群平衡。因此，糞便中HBD2和AI-2水平可作為反映NEC病情和腸道菌群紊亂的指標(biāo)，并且其水平升高提示腸黏膜的修復(fù)和腸道菌群平衡趨于正常，預(yù)示著NEC病情的好轉(zhuǎn)。通過(guò)及時(shí)檢測(cè)糞便HMGB1、HBD2和AI-2水平，不但有助于在早期評(píng)估NEC病情，還可判斷疾病的改善情況，具有便捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。然而，關(guān)于HMGB1、HBD2和AI-2在NEC病情和預(yù)后中的診斷與臨床價(jià)值，仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，其參與NEC的機(jī)制仍需要深入探究。

綜上所述，糞便HMGB1、HBD2和AI-2水平與NEC的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，且可以反映腸道菌群紊亂情況，而HMGB1水平的降低，及HBD2、AI-2水平的升高預(yù)示著腸黏膜組織的修復(fù)和菌群過(guò)度繁殖狀況得到抑制。