AHSG與CEA聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷價值*

劉牟林，丁大朋

大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116011

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，是危害人類身心健康的主要疾病之一[1-2]。膀胱癌患者早期臨床表現(xiàn)多為尿頻、尿急等非特異性癥狀，導致臨床漏診率和誤診率較高。目前，膀胱鏡檢查與組織活檢是診斷膀胱癌的金標準[3-4]，但以上方法為侵入性的有創(chuàng)檢查手段，很多患者對其心理接受度低且要承受更多痛苦，加上較高的經(jīng)濟成本和尿路感染、出血等風險，使其無法成為常規(guī)篩查方法。血液作為無創(chuàng)類檢查標本，可以提供DNA、RNA和蛋白質(zhì)等來源信息，是尋找腫瘤標志物的理想標本。血液檢查具有標本用量少、易取得且創(chuàng)傷小、患者易接受等優(yōu)點[5]。本研究利用在線腫瘤數(shù)據(jù)庫starBase和Oncomine分析血清胎球蛋白A(AHSG)在膀胱癌中的mRNA表達情況，并采用Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)驗證AHSG在膀胱癌組織中的蛋白表達水平。同時，利用受試者工作特征(ROC)曲線分析AHSG與CEA聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷價值，為膀胱癌篩查提供新的、潛在的客觀評價指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月就診于本院的膀胱癌患者30例作為膀胱癌組，其中男24例、女6例，年齡41～83歲、平均(64.9±11.27)歲。入選標準：(1)年齡大于18歲；(2)病理檢查明確診斷為膀胱癌；(3)未接受手術、放化療等治療。排除標準：患有急性或慢性感染及其他膀胱相關疾病者。選擇本院同期30例體檢健康者作為健康組，健康組年齡和性別與膀胱癌組患者相匹配，各項生化指標正常，無膀胱癌家族史且無重要臟器疾病與惡性腫瘤。本研究通過本院倫理委員會批準(YJ-KY-SB-2017-50)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 北京威士達公司SunriseTM酶標儀，羅氏Cobas e601全自動化學發(fā)光免疫分析儀，美國P&D公司人AHSG ELISA試劑盒。

1.3方法

1.3.1在線腫瘤數(shù)據(jù)庫分析AHSG mRNA及蛋白的表達水平 在starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)數(shù)據(jù)庫中的“Pan-Cancer”模塊中選擇“Gene Differential Expression”，在“Gene”選項中輸入“AHSG”，得到AHSG在各種腫瘤中的表達數(shù)據(jù)，選擇“BLCA(Bladder Urothelial Carcinoma)”得到AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達數(shù)據(jù)，mRNA表達水平由RNA-seq數(shù)據(jù)通過log2(FPKM+0.01)獲得。

在Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)數(shù)據(jù)庫的“Search”選項中輸入“AHSG”，在“Analysis Type”選項中的“Cancer vs. Normal Analysis”下選擇“Bladder Cancer vs. Normal Analysis”，“THRESHOLD BY：P-VALUE”選擇“0.05”，得到AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達數(shù)據(jù)。

在HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫的“Search”選項中輸入“AHSG”，點擊“TISSUE”中的“Urinary bladder”得到AHSG蛋白在正常膀胱組織中的表達結(jié)果；點擊“PATHOLOGY”中的“Urothelial cancer”得到AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達結(jié)果。

1.3.2在線腫瘤數(shù)據(jù)庫分析AHSG預測膀胱癌患者預后的價值 在Kaplan-Meier Plotter(KM Plotter，http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)數(shù)據(jù)庫中選擇“Start KM Plotter for pan-cancer”，在“Gene symbol”選項中輸入“AHSG”，在“Survival”選項中選擇“OS(n=7 462)”，在“Select all(n=7 489)”選項中選擇“Bladder Carcinoma”，點擊“Draw Kaplan-Meier plot”，得到AHSG預測膀胱癌患者總體生存概率的生存曲線；在“Survival”選項中選擇“RFS(n=4 420)”，在“Select all(n=7 489)”選項中選擇“Bladder Carcinoma”，點擊“Draw Kaplan-Meier plot”，得到AHSG預測膀胱癌患者無復發(fā)生存概率的生存曲線。

1.3.3血清標本采集與儲存 采集受試者清晨空腹靜脈全血3～5 mL，置于10 mL含促凝劑的真空采血管中，室溫下垂直靜置1 h，使血液充分凝固。然后將標本以3 000 r/min離心10 min，充分分離血清，取上層血清分裝于2.0 mL凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4血清AHSG和CEA水平檢測 利用ELISA商品化試劑盒檢測受試者血清AHSG水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，利用SunriseTM酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，根據(jù)標準曲線法計算血清AHSG水平并進行統(tǒng)計分析。利用羅氏Cobas e601全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測血清CEA水平，檢測過程嚴格按照儀器操作規(guī)程進行。

2 結(jié) 果

2.1AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達水平升高 利用starBase(圖1A)和Oncomine(圖1B、C)數(shù)據(jù)庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中AHSG mRNA表達水平明顯升高，且與腫瘤分級(圖1D)高低、有無遠處轉(zhuǎn)移(圖1E)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1F)密切相關(P<0.05)。當膀胱癌患者腫瘤分級越高、伴有遠處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，AHSG的表達也隨之升高。

注：A為starBase數(shù)據(jù)庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況；B、C為Oncomine數(shù)據(jù)庫分析AHSG mRNA在膀胱癌中的表達情況；D、E、F分別為Oncomine數(shù)據(jù)庫分析不同腫瘤分級、有無遠處轉(zhuǎn)移和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌的AHSG mRNA表達情況。圖1 starBase和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況

2.2AHSG是預測膀胱癌患者預后的潛在標志物 利用HPA數(shù)據(jù)庫驗證AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中AHSG蛋白表達水平更高(圖2)。ELISA發(fā)現(xiàn)，本研究中膀胱癌組血清AHSG水平較健康組明顯升高(P<0.05)，見圖3A。KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，AHSG高表達的膀胱癌患者較AHSG低表達的患者具有更高的無復發(fā)生存概率(P<0.05)，表明AHSG是潛在的膀胱癌患者預后分析的客觀評價標志物，見圖3B、C。

注：A、B分別為HPA數(shù)據(jù)庫分析AHSG蛋白在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達情況。圖2 HPA數(shù)據(jù)庫驗證AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達情況

注：A為本研究膀胱癌組與健康組血清AHSG水平比較；B、C分別為KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析AHSG預測膀胱癌患者總體生存概率和無復發(fā)生存概率的生存曲線。與健康組比較，***P<0.001。圖3 膀胱癌患者血清AHSG水平及其預后預測價值分析

2.3AHSG、CEA檢測對膀胱癌的診斷效能分析 為分析AHSG與CEA聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷價值，本研究首先驗證了膀胱癌組患者血清CEA水平高于健康組(P<0.05)，見圖4。同時，ROC曲線(圖5)顯示，AHSG單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.855，靈敏度為66.7%，特異度為86.7%；CEA單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.851，靈敏度為93.3%，特異度為70.0%。與AHSG相比，CEA檢測診斷膀胱癌的靈敏度(93.3%)較AHSG(66.7%)高，特異度(70.0%)較AHSG(86.7%)稍有降低，但降低幅度小。當AHSG與CEA聯(lián)合檢測診斷膀胱癌時，AUC為0.952，靈敏度為90.0%，特異度為93.3%，其診斷價值優(yōu)于AHSG、CEA單獨檢測。

注：與健康組比較，***P<0.001。圖4 健康組與膀胱癌組血清CEA水平比較

圖5 AHSG、CEA診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討 論

膀胱癌起病隱匿，惡性程度高，手術是目前臨床上治療膀胱癌的首選方案，但患者術后生存率較低，其中轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者的5年生存率僅為6%[6]。早期發(fā)現(xiàn)是膀胱癌診斷、治療和預后的關鍵。膀胱鏡檢查與組織活檢是傳統(tǒng)的診斷膀胱癌的有效方法，但其操作復雜，對患者損傷大，難以成為膀胱癌篩查和常規(guī)檢測的手段。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)有效的血清學標志物來提高膀胱癌的臨床診斷率具有重要意義。近年來，血清蛋白質(zhì)組學已成為發(fā)現(xiàn)腫瘤標志物的重要手段，且已證實血清標志物具有較高的靈敏度和特異度[7-10]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是臨床上檢測血液、體液等標本的成熟質(zhì)譜技術，具有操作簡便、檢測快速、高選擇性、高靈敏度和高特異性等特點。鄭愛文等[11]利用MALDI-TOF-MS檢測了子宮內(nèi)膜癌患者和健康女性的血清多肽譜，發(fā)現(xiàn)12個差異多肽峰，其中質(zhì)荷比(m/z)為2 768.0、3 402.0和6 441.0的3種血清多肽聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌的靈敏度為88.1%，特異度為75.8%，鑒別子宮內(nèi)膜癌和子宮良性病變的靈敏度為94.9%，能較準確地區(qū)分子宮內(nèi)膜癌患者、健康女性和子宮良性病變患者，有助于子宮內(nèi)膜癌的早期篩查。本研究前期利用MALDI-TOF-MS篩選并驗證了膀胱癌患者血清中5種表達上調(diào)的差異血清多肽(m/z為2 081.0、3 938.3、1 954.0、4 268.8和3 946.5)，通過納米級液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜技術進行鑒定，并與UniProt數(shù)據(jù)庫比對，確定了其中2種血清多肽對應的蛋白，分別是m/z為2 018.0對應的AHSG和m/z為1 954.9對應的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)[12]。

AHSG是一種可分泌到體液中的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，AHSG可以作為多種腫瘤如口腔鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌和胃癌等的標志物。JAIN等[13]利用液相色譜儀-質(zhì)譜儀(LC-MS)分析，發(fā)現(xiàn)AHSG在口腔鱗狀細胞癌中表達升高，其診斷口腔鱗狀細胞癌的靈敏度為78.0%，特異度為87.5%，是口腔鱗狀細胞癌輔助診斷的潛在標志物。SHI等[14]分析了32例胃癌患者和30例健康對照者血清標本中AHSG的蛋白表達變化，并利用ELISA驗證差異纖維蛋白原ɑ鏈、AHSG和載脂蛋白A-I水平，發(fā)現(xiàn)它們在胃癌患者中表達水平升高，且具有良好的診斷價值，可成為診斷胃癌的潛在血清學標志物。目前，較少見AHSG在膀胱癌中表達水平的研究。根據(jù)前期研究結(jié)果，本研究選擇AHSG進行后續(xù)驗證和研究。首先利用starBase和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析確定了AHSG mRNA在膀胱癌中高表達，且與膀胱癌的腫瘤分級高低、有無遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。同時HPA數(shù)據(jù)庫和ELISA也驗證了AHSG蛋白在膀胱癌中的高表達。KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與AHSG低表達的膀胱癌患者相比，AHSG高表達膀胱癌患者具有更高的無復發(fā)生存概率。ROC曲線顯示，AHSG單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.855，靈敏度為66.7%，特異度為86.7%，表明AHSG是膀胱癌診斷和預后分析的潛在血清學標志物。

目前，膀胱癌缺乏特異的血清學腫瘤標志物，主要通過檢測CEA水平來監(jiān)測患者病情變化[15]。CEA是由黏膜上皮細胞分泌的可溶性跨膜糖蛋白，在健康人群血清中含量極低，是高效、廣譜的腫瘤標志物。血清或尿CEA檢測在膀胱癌的診斷和監(jiān)測中具有重要的應用價值。正常情況下，機體內(nèi)CEA水平低于10 ng/mL。當膀胱組織癌變或腫瘤復發(fā)時，尿CEA水平會快速升高，其與腫瘤大小和病情嚴重程度密切相關，是膀胱癌診斷和預后評估的有效指標[16]。AHMADI等[17]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者術前血清CEA和糖類抗原(CA)19-9水平升高，是判斷患者預后不良的獨立預測因子。本研究驗證了膀胱癌患者血清CEA水平升高，并利用ROC曲線分析AHSG、CEA對膀胱癌的診斷價值，發(fā)現(xiàn)AHSG與CEA聯(lián)合檢測診斷膀胱癌的AUC為0.952，較AHSG或CEA單獨檢測更高，說明AHSG與CEA聯(lián)合檢測診斷膀胱癌的臨床應用價值更高。

綜上所述，AHSG在膀胱癌中的表達明顯升高，是膀胱癌診斷和預后預測的客觀評價指標，其與CEA是膀胱癌診斷和預后分析中臨床應用價值更高的、潛在的血清學標志物。