盧黃欣,陳俊賢,李瑋婷,歐陽(yáng)彥楚,楊軍平△
1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西南昌 330006
T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(TIGIT)是一種具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的新型共抑制信號(hào)分子[1],作為免疫調(diào)控受體,也是T細(xì)胞活化、凋亡以及效應(yīng)功能發(fā)揮過(guò)程中重要的信號(hào)分子,其不僅對(duì)細(xì)胞的免疫激活、成熟、分化有直接調(diào)控作用,還與細(xì)胞凋亡機(jī)制有密切聯(lián)系[2]。TIGIT可以與多種配體相結(jié)合發(fā)揮作用,如CD155、CD122、CD113,其中TIGIT與CD155的親和程度最高[3]。TIGIT作為T細(xì)胞表面的負(fù)性共抑制受體,其細(xì)胞內(nèi)的ITIM基序旁邊還存在一個(gè)類似免疫球蛋白尾絡(luò)氨酸(ITT)的磷酸化基序,在TIGIT與CD155信號(hào)結(jié)合后,ITT樣基序在其基點(diǎn)Tyr225處磷酸化并與靶淋巴細(xì)胞中的適配器Grb2結(jié)合,從而傳遞抑制性信號(hào)進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,降低機(jī)體免疫調(diào)控功能[4]。
研究表明,在應(yīng)激反應(yīng)中,機(jī)體可通過(guò)影響下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),造成激素分泌異常[5];通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)(NEI)網(wǎng)絡(luò)的過(guò)度調(diào)控造成免疫損傷,導(dǎo)致胸腺出現(xiàn)萎縮,胸腺細(xì)胞出現(xiàn)衰竭[6];相關(guān)研究表明,特異性活躍表達(dá)于各種T細(xì)胞亞群和自然殺傷(NK)細(xì)胞中的TIGIT可通過(guò)影響T細(xì)胞自身活化通路或結(jié)合多種合作細(xì)胞干擾免疫因子的分泌,造成直接或間接的免疫功能抑制,并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞衰竭[7],同時(shí)TIGIT可與CD155結(jié)合,傳遞抑制性信號(hào),誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,降低機(jī)體免疫調(diào)控功能。本研究通過(guò)分析不同時(shí)程應(yīng)激“怒”模型大鼠中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)及相關(guān)免疫因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)表達(dá)水平,探討“怒”情志對(duì)免疫功能的影響,分析不同時(shí)程應(yīng)激“怒”模型大鼠胸腺中TIGIT及其配體CD155的蛋白表達(dá)水平和胸腺T細(xì)胞凋亡率,以及TIGIT分子在應(yīng)激反應(yīng)中與胸腺T細(xì)胞凋亡及外周免疫功能紊亂的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠48只,雄性SPF級(jí)SD大鼠12只,均為8周齡,體質(zhì)量為180~200 g;2種品系的大鼠均由濟(jì)南鵬悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)2019-0003,飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。購(gòu)置后,隨機(jī)分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,飲食不限,環(huán)境濕度35%~45%,溫度(20±4)℃,采用自動(dòng)明暗系統(tǒng)(7:00照明,19:00熄燈);7 d后,Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,對(duì)照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組,每組12只,對(duì)照組每6只1籠,模型各組分別單籠(50 cm×30 cm×20 cm)獨(dú)立飼養(yǎng)。SD大鼠作為入侵鼠,每6只1籠,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放棄不用。對(duì)照組Wistar大鼠與SD大鼠放置于同一飼養(yǎng)房間,模型組Wister大鼠放置于另外一個(gè)飼養(yǎng)房間。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過(guò)江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查,審查批號(hào):JZLLSC2019-0153。
1.2儀器與試劑 PowerPacTM通用Bio-Rad電泳儀購(gòu)自上海一恒科技有限公司。TIGIT多克隆抗體(批號(hào)PAN056Ra)、CD155抗體(批號(hào)PAB550Ra01)均購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone Corp.公司;內(nèi)參β-actin抗體(批號(hào)mAbcam8266)購(gòu)自美國(guó)mAbcam公司;一步法Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光檢測(cè)法,通用型)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;CRH、ACTH、IL-2、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)G1120)購(gòu)自北京索萊寶公司。
1.3方法
1.3.1大鼠應(yīng)激“怒”模型制備 參照文獻(xiàn)[8-9]方法,采用“社會(huì)隔離法”結(jié)合足底電擊法對(duì)獨(dú)立飼養(yǎng)的Wistar大鼠復(fù)制精神應(yīng)激“怒”模型。社會(huì)隔離法:制造晝夜顛倒的生存環(huán)境,每晚19:00開(kāi)燈,上午7:00熄燈,飲食不限,持續(xù)14 d(對(duì)照組大鼠與入侵鼠在正常光照節(jié)律房間飼養(yǎng));從第15天開(kāi)始,每天13:30-15:30進(jìn)行入侵鼠干擾(隨機(jī)選取1只入侵鼠放入獨(dú)立飼養(yǎng)籠中接觸模型大鼠,持續(xù)15 min);從第15天開(kāi)始,每天16:00-17:30進(jìn)行不可避免的足底電擊(電擊棒4 000 V,<0.5 mA,脈沖15 s,持續(xù)15 min)。模型大鼠結(jié)合性刺激分別持續(xù)7、14、21 d,完成應(yīng)激“怒”模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠制備,對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何刺激。
1.3.2取材及稱質(zhì)量 記錄4組大鼠實(shí)驗(yàn)前1 d及實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)完成后采取頸椎脫臼法處死大鼠,取出胸腺,以生理鹽水浸洗2次、定性濾紙吸干液體并稱質(zhì)量記錄,計(jì)算胸腺指數(shù),胸腺指數(shù)=胸腺凈質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)。
1.3.3HE染色 胸腺標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,進(jìn)行包埋、脫水、透明和浸蠟,將蠟塊固定于切片機(jī),切下2~4 μm厚度的胸腺組織于 40 ℃水中,60 ℃烘烤2 h。經(jīng)脫蠟、染色、透明和封片,于高清顯微鏡下拍照。
1.3.4胸腺細(xì)胞TIGIT、CD155蛋白表達(dá)水平測(cè)量(免疫印跡法) 提取各組大鼠胸腺組織蛋白,經(jīng)過(guò)灌膠、上樣、轉(zhuǎn)模、封閉、洗膜等工作后,分別浸入TIGIT、CD155、內(nèi)參一抗中孵育過(guò)夜,洗膜,孵育二抗完成后進(jìn)行顯影,用軟件Alphaview SA分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值。
1.3.5Tunel法檢測(cè)胸腺細(xì)胞凋亡率 按照1.3.3步驟將胸腺組織切片后進(jìn)行脫蠟,透明,然后放入盛有pH值6.0的枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中,92 ℃加熱30 min,進(jìn)行磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,用免疫組化筆外圈標(biāo)記,按照Tunel(FITC)Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行熒光染色,隨機(jī)選取染色完成后的分組標(biāo)本的切片,隨機(jī)視野下拍照,以Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度分析,并計(jì)算平均吸光度,分析胸腺T細(xì)胞凋亡率。
1.3.6血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平測(cè)量 采用真空無(wú)菌采血管取2 mL血液,以3 000 r/min離心15 min,用移液槍抽吸“透亮”上清液,轉(zhuǎn)移至EP管待測(cè)。后續(xù)操作過(guò)程嚴(yán)格遵從ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
2.14組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)后胸腺指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)前1 d,4組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),實(shí)驗(yàn)后4組大鼠體質(zhì)量均較實(shí)驗(yàn)前1 d升高(P<0.05),但“怒”模型各組大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組(P<0.05);實(shí)驗(yàn)后“怒”模型各組大鼠胸腺指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)后胸腺指數(shù)比較
2.24組大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察可見(jiàn):對(duì)照組大鼠胸腺皮質(zhì)部飽滿,幼稚T細(xì)胞布排整齊、細(xì)胞間隙疏松,結(jié)構(gòu)分明,其細(xì)胞核染色較深,呈深藍(lán)紫色,出現(xiàn)少量巨噬細(xì)胞呈淡紅色(圖1A)?!芭蹦P透鹘M大鼠胸腺皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損壞,幼稚T細(xì)胞布排紊亂無(wú)序或呈“條索狀”堆積,細(xì)胞間隙縮小,細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組降低,細(xì)胞核染色變淺,呈淡紫色,并出現(xiàn)不同程度的核固縮、核分裂、細(xì)胞溶解等凋亡細(xì)胞增多現(xiàn)象,其中以模型7 d組、模型14 d組較為明顯(圖1B、C、D)。
注:A、B、C、D分別為對(duì)照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺組織HE染色(×400),標(biāo)尺為200px。圖1 實(shí)驗(yàn)后4組大鼠胸腺組織HE染色結(jié)果
2.34組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT、CD155蛋白表達(dá)水平比較 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT蛋白表達(dá)水平比較,模型7 d組、模型14 d組高于對(duì)照組,模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組,模型14 d組高于模型 21 d組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);“怒”模型各組大鼠胸腺細(xì)胞CD155蛋白表達(dá)水平比較,模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3。
注:A、B、C、D分別為對(duì)照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺TIGIT和CD155蛋白表達(dá)水平。圖2 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT和CD155蛋白表達(dá)水平
注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型7 d組比較,bP<0.05;與模型14 d組比較,cP<0.05。圖3 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT/β-actin和CD155/β-actin的相對(duì)灰度值比
2.44組大鼠胸腺T細(xì)胞的凋亡率比較 熒光顯微鏡下(×400),以發(fā)射波長(zhǎng)515~565 nm觀察,可見(jiàn)胸腺凋亡細(xì)胞呈綠色熒光;DAPI陰性復(fù)染,以發(fā)射波長(zhǎng)340~380 nm觀察,可見(jiàn)凋亡細(xì)胞以外區(qū)域正常細(xì)胞胞核呈藍(lán)色熒光。4組大鼠胸腺組織凋亡細(xì)胞的吸光度比較,模型7 d組(19.92±4.04)、模型14 d組(13.53±1.56)、模型21 d組(7.97±1.37)高于對(duì)照組(5.01±1.35),模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組,模型14 d組高于模型21 d組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.5實(shí)驗(yàn)后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較 血清CRH、ACTH水平比較,模型7 d組、模型14 d組高于對(duì)照組及模型21 d組(P<0.05);IL-2水平比較,“怒”模型各組均低于對(duì)照組(P<0.05),且模型7 d組、模型14 d組低于模型21 d組(P<0.05);IL-10水平比較,“怒”模型各組均高于對(duì)照組(P<0.05),且模型14 d組高于模型7 d組及模型21 d組(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 實(shí)驗(yàn)后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較
2.6TIGIT、CD155表達(dá)水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數(shù)、胸腺細(xì)胞凋亡程度的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示,TIGIT的表達(dá)水平與CD155、ACTH、CRH、胸腺細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與IL-10、胸腺指數(shù)無(wú)相關(guān)性(P>0.05);CD155的表達(dá)水平與TIGIT、胸腺細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與ACTH、CRH、IL-10、胸腺指數(shù)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。
表3 TIGIT、CD155表達(dá)水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數(shù)、胸腺細(xì)胞凋亡程度的相關(guān)性
指標(biāo)IL-2rPIL-10rP胸腺指數(shù)rP胸腺細(xì)胞凋亡程度rPTIGIT-0.690<0.01 0.288>0.050.086>0.050.863<0.01CD155-0.570<0.05-0.317>0.050.099>0.050.562<0.05
隨著健康概念的更新和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式的改變,“怒”等負(fù)性情緒在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)理論之七情致病論也認(rèn)為情志與健康和疾病密切相關(guān),其中“怒”情志首傷肝,肝失疏泄,則諸病叢生。研究表明,“肝主疏泄”是機(jī)體調(diào)控免疫系統(tǒng)功能活動(dòng)的核心,與心理應(yīng)激的免疫功能調(diào)控密切相關(guān)[10]。同時(shí),長(zhǎng)期心理應(yīng)激和情緒異常容易導(dǎo)致機(jī)體NEI網(wǎng)絡(luò)被過(guò)度激活,HPA軸分泌異常,進(jìn)一步誘發(fā)多系統(tǒng)組織細(xì)胞損傷,從而增加自身免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、精神性疾病等的患病可能性[11-12]。
在情志致病模型中,“怒傷肝”類型是相對(duì)研究廣泛且較為成功的一種。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8-9]方法,采用“足底電擊”和“社會(huì)隔離入侵”的方法制備“怒傷肝”模型大鼠。其中“社會(huì)隔離法”由國(guó)外學(xué)者DAVIS發(fā)明,該法對(duì)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期的單獨(dú)隔離并日夜顛倒飼養(yǎng),有利于使動(dòng)物進(jìn)入“孤立無(wú)援”的生存狀態(tài),由此提高大鼠對(duì)環(huán)境刺激的敏感性,加入入侵鼠干擾以及足底電擊更能充分體現(xiàn)軀體性、社會(huì)性、心理性三類應(yīng)激源因素,在造模期間,大鼠表現(xiàn)為怒叫、呼吸加速、易激怒等明顯盛怒現(xiàn)象。
國(guó)外最新研究發(fā)現(xiàn),身體應(yīng)激和心理應(yīng)激能夠引起TIGIT高表達(dá),其對(duì)T細(xì)胞存在抑制性作用[13],并發(fā)現(xiàn)TIGIT的表達(dá)與在T細(xì)胞衰竭中起關(guān)鍵作用的幾種抑制調(diào)節(jié)因子的上調(diào)有關(guān)[14],同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),TIGIT和CD155表達(dá)水平的升高與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制、不良預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡法結(jié)果顯示,各模型組大鼠胸腺的TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)水平均有所上升,而CD155蛋白呈持續(xù)高水平表達(dá)趨勢(shì),以應(yīng)激7 d時(shí)效果最為明顯,提示了應(yīng)激反應(yīng)中大鼠胸腺幼稚T細(xì)胞的凋亡可能與TIGIT-CD155軸的表達(dá)活性存在正相關(guān)關(guān)系。目前應(yīng)激反應(yīng)中的NEI網(wǎng)絡(luò)存在多種機(jī)制相互協(xié)助,共同介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同時(shí)程的慢性“怒”應(yīng)激能有效提高大鼠血清中CRH、ACTH的分泌水平,提示“怒”應(yīng)激大鼠HPA軸功能亢進(jìn)并成功處于應(yīng)激狀態(tài),另外Tunel法結(jié)果顯示模型組大鼠胸腺皮質(zhì)部幼稚T細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組,以應(yīng)激7 d時(shí)效果最為明顯,而胸腺指數(shù)持續(xù)降低,說(shuō)明了在應(yīng)激反應(yīng)中,大鼠的胸腺抑制與HPA軸興奮有直接關(guān)系。研究表明樹(shù)狀突細(xì)胞(DC)上的CD155與TIGIT相結(jié)合,使DC的分泌格局發(fā)生改變,促進(jìn)抑制因子IL-10水平升高,活化因子IL-2水平下降,間接抑制T細(xì)胞的活化[18]。在本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠血清正性免疫調(diào)節(jié)因子IL-2水平明顯降低,而負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子IL-10水平明顯上升,符合TIGIT-CD155軸對(duì)DC的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)TIGIT及其配體CD155進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果提示TIGIT、CD155與HPA軸、IL-2密切相關(guān),共同作用抑制免疫應(yīng)答。值得注意的是,在此實(shí)驗(yàn)中TIGIT、ACTH、CRH、IL-2的水平變化及胸腺細(xì)胞凋亡程度均在模型7 d組效果最為明顯,而模型14 d組次之,模型21 d組趨于正常;而各模型組CD155表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05),但各模型組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示表達(dá)閾值及胸腺細(xì)胞凋亡情況可能與隨應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激源出現(xiàn)“適應(yīng)性”改變或者通過(guò)機(jī)體“內(nèi)環(huán)境”的穩(wěn)態(tài)調(diào)整進(jìn)行修復(fù)等有關(guān)[19],其中IL-10表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),以模型14 d組最為突出,其結(jié)果可能與應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞因子釋放時(shí)間的早晚有關(guān);胸腺指數(shù)的持續(xù)降低可能與應(yīng)激后體質(zhì)量保持持續(xù)低值有關(guān),其原因尚需更多研究說(shuō)明。
綜上所述,“怒”應(yīng)激可致HPA軸調(diào)節(jié)功能紊亂及免疫耐受能力下降,同時(shí)應(yīng)激反應(yīng)所造成的胸腺萎縮和胸腺細(xì)胞凋亡,可能是TIGIT-CD155軸以及HPA軸、IL-10、IL-2共同作用的結(jié)果。其結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍深入探討。本研究為闡述“怒”應(yīng)激致使免疫功能損傷提供新角度,旨在強(qiáng)調(diào)避免“怒”情志發(fā)生,預(yù)防疾病發(fā)生或復(fù)發(fā),為提高臨床療效提供新思路。
國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2022年1期