多組織蠟塊在常規(guī)HE染色中的質(zhì)控作用

孫 炎，茍繼周，李曉星，彭 程，張鴻英，周光德

HE染色是病理組織染色的基礎(chǔ)，覆蓋了大部分的常規(guī)病理技術(shù)工作，病理醫(yī)師可進(jìn)行免疫組化、特殊染色、原位雜交等檢查。HE染色切片質(zhì)量直接影響病理醫(yī)師的判斷，因此技術(shù)人員常在HE染色前進(jìn)行預(yù)染色保障質(zhì)量。許多醫(yī)院病理科會(huì)使用預(yù)留的組織白片或者每天切片時(shí)先切一些組織片用來(lái)預(yù)染色，較為消耗人力、浪費(fèi)載玻片及染色液等資源；同時(shí)由于切片中的組織種類少，而不能全面反應(yīng)染色情況。本科室為提高染色效率和質(zhì)量，使用多組織蠟塊的切片染色，觀察其在HE染色中的質(zhì)量控制作用。

1 材料與方法

1.1 材料選取深圳市第三人民醫(yī)院病理科取材后剩余的胎盤(pán)、乳腺、肝臟、子宮肌、結(jié)腸、扁桃體、甲狀腺、闌尾、肺組織標(biāo)本。

1.2 多組織蠟塊制備把收集的組織分別切成大小0.7 cm×3 cm長(zhǎng)條狀，取1塊胎膜組織切成大小5 cm×8 cm片狀備用，將上述8種組織排列整齊在片狀胎膜內(nèi)，卷成羊膜卷后與常規(guī)標(biāo)本一起行脫水、透明、浸蠟處理。包埋時(shí)用刀片把浸蠟后的羊膜卷兩端稍作修剪，切成大小0.3 cm×0.5 cm組織塊后包埋，切片厚3.5 μm[1]。

1.3 儀器與試劑染色機(jī)選用徠卡ST5020，封片劑選用徠卡CV5030，數(shù)字切片掃描儀選用麥克奧迪VM1000，Harris蘇木精、水溶性伊紅、碳酸鋰、鹽酸乙醇分化液，均購(gòu)于珠海貝索公司。

1.4 方法設(shè)置染色機(jī)HE染色程序：二甲苯3次，每次5 min；無(wú)水乙醇3次，每次1 min；75%乙醇1 min，自來(lái)水洗1 min；蘇木精13 min，自來(lái)水洗1 min；0.3%鹽酸乙醇分化1 s，自來(lái)水洗1 min；碳酸鋰飽和液1 min，自來(lái)水洗2 min；伊紅5 min，自來(lái)水洗1 min；95%乙醇20 s，無(wú)水乙醇3次，每次1 min；二甲苯3次，每次3 min；中性樹(shù)膠封固[2]。本實(shí)驗(yàn)分別在試劑不同條件情況下對(duì)切片進(jìn)行HE染色，并比較染色結(jié)果。

2 結(jié)果

選取制作好的多組織蠟塊切片，按照上述設(shè)定的染色程序在不同條件下進(jìn)行HE染色(圖1)。當(dāng)使用新鮮染色試劑染色時(shí)：結(jié)腸腸黏膜藍(lán)紫色，結(jié)構(gòu)清楚(圖2)，甲狀腺組織紅藍(lán)對(duì)比明顯(圖3)；肝細(xì)胞胞核、淋巴細(xì)胞胞核藍(lán)亮，染色質(zhì)清晰；子宮肌纖維層次感較強(qiáng)，伊紅著色能力及乙醇分化效果良好，分化及藍(lán)化徹底。當(dāng)鹽酸乙醇分化液調(diào)低為0.1%濃度時(shí)，淋巴細(xì)胞胞核深染不清晰；當(dāng)鹽酸乙醇分化液調(diào)高為1.5%濃度時(shí)，細(xì)胞核藍(lán)色過(guò)淡。蘇木精染色超過(guò)4 000 張切片，腸黏膜上細(xì)胞核灰暗(圖4)；伊紅染色超過(guò) 4 000 張切片，肝臟細(xì)胞質(zhì)紅色極淺，背景暗藍(lán)。第一缸脫水乙醇改為無(wú)水乙醇時(shí)，組織整體紅染，紅藍(lán)對(duì)比不清晰；第一缸脫水乙醇濃度調(diào)低為75%濃度時(shí)，對(duì)伊紅脫色較重，扁桃體隱窩上皮幾乎伊紅不著色。使用兩周未更換的二甲苯脫蠟部分甲狀腺膠質(zhì)發(fā)白不著色(圖5)。

①②③④⑤

3 討論

影響HE染色的因素繁多，除了烤片的溫度和時(shí)間、石蠟融點(diǎn)和浸蠟溫度、實(shí)驗(yàn)室的溫、濕度等因素外[3-5]，還應(yīng)該考慮到染色過(guò)程中自來(lái)水的酸堿度等。偏酸和偏堿性的自來(lái)水沖洗切片，會(huì)導(dǎo)致組織pH環(huán)境發(fā)生變化，偏酸使得細(xì)胞核發(fā)暗紫色、染色淡，偏堿會(huì)讓纖維、胞質(zhì)等嗜酸性組織對(duì)伊紅著色較為困難，易被低濃度乙醇脫色而著色較弱。我科室自來(lái)水pH值未到7.0，蘇木精染色效果不佳，技術(shù)組針對(duì)偏酸環(huán)境問(wèn)題，設(shè)置多組織對(duì)照，改良染色程序，減短水洗時(shí)間，減少蘇木精配方里冰醋酸的量，降低鹽酸乙醇分化液濃度，細(xì)胞核染色效果明顯提升。此外，在染色機(jī)自來(lái)水槽里使用加熱鋁棒加溫，使之成微弱堿性，或依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室環(huán)境選擇合適種類的蘇木精，均可解決染色問(wèn)題[6]。所以，不能僅僅照搬其他實(shí)驗(yàn)室的操作流程、試劑配方直接應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)置質(zhì)控體系來(lái)解決染色問(wèn)題。還可以使用多組織蠟塊判斷染色試劑的質(zhì)量及染色程序設(shè)置是否合適，如腸黏膜上皮、子宮肌纖維等組織可以觀察伊紅著色強(qiáng)度、乙醇分化程度、自來(lái)水pH值是否偏堿；扁桃體、肝細(xì)胞核等嗜堿性細(xì)胞能觀察胞核蘇木精染色情況，可以推算蘇木精染液的老化、鹽酸乙醇分化液濃度、藍(lán)化液和自來(lái)水的pH值是否達(dá)標(biāo)；闌尾、甲狀腺組織可反應(yīng)伊紅蘇木精染色紅藍(lán)對(duì)比度情況。

多組織蠟塊在特殊染色的質(zhì)控中也可有較大的發(fā)揮空間。如多組織中的各種纖維成分含量豐富，對(duì)Masson染色、網(wǎng)狀纖維染色、彈力纖維染色等具有較好的質(zhì)控效果。每種真菌對(duì)不同染料的著色親和度不同，如曲霉菌在六胺銀染色里著色時(shí)間多于其他真菌1倍時(shí)間，我們可以針對(duì)性的收集隱球菌、曲霉菌、馬爾尼菲青霉菌等陽(yáng)性組織標(biāo)本制作蠟塊，用作各種真菌染色如PAS染色、六胺銀染色、愛(ài)先藍(lán)染色等特殊染色方法的陽(yáng)性對(duì)照[7]。部分肝病患者組織中可見(jiàn)多種色素及金屬沉積，可以用作膽色素、脂褐素、銅染色、鐵染色等染色的陽(yáng)性對(duì)照[8]。

多組織蠟塊通常作為免疫組化陽(yáng)性對(duì)照使用，但在日常工作中，我們發(fā)現(xiàn)多組織蠟塊切片可替代其他方法來(lái)作為HE預(yù)染色的質(zhì)控。在HE染色前，只需要使用1～2張多組織蠟塊切片上機(jī)染色，便可觀察染色效果，節(jié)約成本的同時(shí)操作簡(jiǎn)單便捷，有臨床應(yīng)用價(jià)值。