CD68、CD11c和CD163陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在乳腺癌組織中表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

汪園圓，朱 丹，杜光燁

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起基本作用，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage, TAM)作為炎癥與腫瘤相關(guān)性的重要調(diào)節(jié)者，是腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞，在連接慢性炎性介質(zhì)反應(yīng)與腫瘤之間發(fā)揮重要的橋梁作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，特別是與腫瘤血管和淋巴管的生成密切相關(guān)[1-3]。有研究顯示TAM有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，在未來(lái)的腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[4-5]。TAM可極化并表現(xiàn)出M1或M2表型[6]。其中M1型具有促炎功能，并激活輔助T細(xì)胞以誘導(dǎo)針對(duì)病原體的致死性T細(xì)胞反應(yīng)，限制腫瘤生長(zhǎng)[7]。M2型可產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，參與血管發(fā)生和腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型分化，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，被認(rèn)為是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志[7-8]。因此，這些TAM種類(lèi)分布的平衡決定了巨噬細(xì)胞成分的抗腫瘤或促腫瘤作用。CD68是通用型巨噬細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物，可識(shí)別M1和M2型；CD163是M2型巨噬細(xì)胞的高度特異性標(biāo)志物[9-10]；CD11c近年來(lái)被認(rèn)為是M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[11]。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)CD11c被用于原發(fā)性乳腺癌中TAM標(biāo)志物的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)81例乳腺癌組織中CD68、CD11c和CD163的表達(dá)，通過(guò)將腫瘤間質(zhì)(tumor stroma, TS)中的TAM(M1、M2)進(jìn)行量化、分組，分析比較兩組臨床病理特征、生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院病理科存檔的81例乳腺癌標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未行放、化療及其它相關(guān)腫瘤的治療?；颊吣挲g30～84歲，中位年齡62歲。根據(jù)患者的病歷和病理報(bào)告收集患者的臨床病理資料，包括患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)等級(jí)和隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)。按WHO(2012)乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)及第7屆美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)81例患者HE切片進(jìn)行病理及臨床診斷，81例患者均獲得隨訪(fǎng)資料，隨訪(fǎng)時(shí)間5～45個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間35個(gè)月。另收集同期50例乳腺腺病石蠟標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5～6 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。95～99 ℃抗原修復(fù)液中處理20 min，室溫冷卻30 min。濃縮型兔抗人巨噬細(xì)胞CD68、CD163、CD11c多克隆抗體購(gòu)自Ventana Medical Systems檢測(cè)試劑盒，即用型鼠抗人巨噬細(xì)胞單克隆抗體和免疫組化試劑盒(EnVision兩步法)購(gòu)自上海杰浩公司。室溫下2 h或4 ℃孵育過(guò)夜。二抗為室溫下孵育30 min。檢測(cè)CD68、CD163、CD11c表達(dá)，分別計(jì)數(shù)TAM的總量及M1和M2的數(shù)量，明確乳腺癌組織中TAM的分化情況。

通過(guò)計(jì)數(shù)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的數(shù)目確定CD68、CD11c和CD163的表達(dá)。在審查了每種情況下包含核心的TAM載玻片后，選擇最大表達(dá)強(qiáng)度的區(qū)域。在每種情況下，使用ImageScope(Aperio Technologies，Vista公司，USA)選擇了陽(yáng)性TAM浸潤(rùn)密度最高的3個(gè)視野，最終放大倍數(shù)為400×(1 mm2)。在3個(gè)視野中計(jì)數(shù)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)，僅計(jì)數(shù)具有單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞，取平均值。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，根據(jù)截止點(diǎn)在TS中分別對(duì)CD68+、CD11c+或CD163+TAM進(jìn)行計(jì)數(shù)，按M2/M1比率中位數(shù)0.8為界，分為高M(jìn)2/M1表達(dá)組和低M2/M1表達(dá)組，分析兩組臨床病理特征之間的相關(guān)性。評(píng)估CD68+、CD11c+或CD163+TAM對(duì)乳腺癌中TS的影響。

1.3 隨訪(fǎng)從患者術(shù)后出院即開(kāi)始隨訪(fǎng)，主要以門(mén)診和電話(huà)形式進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截至2020年8月31日?？偵嫫?overall survival, OS)定義為從腫瘤確診至與腫瘤相關(guān)原因或死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征81例乳腺癌中，導(dǎo)管原位癌15例(15/81，18.5%)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌61例(61/81，75.3%)，浸潤(rùn)性小葉癌5例(5/81，6.2%)。組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)10例(10/81，12.3%)，Ⅱ級(jí)59例(59/81，72.8%)，Ⅲ級(jí)12例(12/81，14.8%)。TNM分期：T1期15例(15/81，18.5%)，T2期45例(45/81，55.6%)，T3期17例(17/81，21.0%)，T4期4例(4/81，4.9%)。發(fā)病年齡30～84歲，中位年齡62歲。接受乳房切除術(shù)的患者66例(66/81，81.5%)，接受保乳手術(shù)的患者15例(15/81，18.5%)。術(shù)后71例患者(71/81，87.7%)行放、化療或內(nèi)分泌治療。所有患者中位隨訪(fǎng)時(shí)間35個(gè)月(5～45個(gè)月)，其中有13例(13/81，16.0%)死亡，16例(16/81，19.8%)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

2.2 TAM在乳腺癌中計(jì)數(shù)的比較對(duì)81例乳腺癌組織進(jìn)行免疫組化染色，用CD68標(biāo)記TS中巨噬細(xì)胞(圖1)；用CD11c標(biāo)記巨噬細(xì)胞，CD11c陽(yáng)性計(jì)數(shù)為M1細(xì)胞(圖2)；用CD163標(biāo)記巨噬細(xì)胞，CD163陽(yáng)性計(jì)數(shù)為M2細(xì)胞(圖3)。樣本中M1和M2細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖4，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，把TS中M1和M2的分化進(jìn)行量化，M2/M1的比值結(jié)果數(shù)值見(jiàn)圖5。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖4 不同乳腺癌患者中TAM及M1和M2細(xì)胞數(shù)量

圖5 不同乳腺癌患者中M2/M1比率

2.3 乳腺癌中M2/M1比率與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系81例乳腺癌患者，腫瘤體積中位數(shù)為31.5 cm3，體積范圍2～120 cm3。高M(jìn)2/M1表達(dá)組和低M2/M1表達(dá)組在病理分級(jí)、AJCC分級(jí)方面差異有顯著性(P<0.05，表1)。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)結(jié)果顯示，高M(jìn)2/M1表達(dá)組乳腺癌患者的OS低于低M2/M1表達(dá)組，兩者差異有顯著性(P<0.001，圖6)。

表1 乳腺癌中M2/M1比率和臨床病理特征的關(guān)系

圖6 M2/M1比率與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

乳腺癌作為威脅女性身心健康的常見(jiàn)腫瘤，是引起女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，目前全球乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位[12]。炎癥與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性，TAM作為腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞，是炎癥與腫瘤相關(guān)性的重要調(diào)節(jié)者，巨噬細(xì)胞極化成M1或M2表型會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌和功能發(fā)生變化。M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和腫瘤壞死因子，在細(xì)胞中具有致命的抗微生物和抗腫瘤作用。M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括IL-10、Ⅱ型IL-1受體拮抗劑和IL-1誘餌受體。它們調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫，并促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)。由于IL-10的分泌和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，TAM在功能上類(lèi)似于M2巨噬細(xì)胞。通過(guò)表達(dá)M2巨噬細(xì)胞的特征，TAM促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6]。由此可見(jiàn)，M1、M2種類(lèi)分布的平衡決定了巨噬細(xì)胞成分的抗腫瘤或促腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)標(biāo)記及計(jì)數(shù)M1、M2，探尋其與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)、預(yù)后之間的關(guān)系。

CD68是最著名的泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，通常用作TAM的標(biāo)志物[13]。既往研究顯示，在乳腺癌CD68+TAM高浸潤(rùn)與腫瘤大小和預(yù)后不良相關(guān)[13-15]；提示乳腺癌與TAM相互作用并誘導(dǎo)支持腫瘤生長(zhǎng)的免疫應(yīng)答。CD68+TAM浸潤(rùn)與乳腺癌、子宮頸癌和膀胱癌的不良預(yù)后相關(guān)，但與前列腺癌、肺癌和腦瘤的預(yù)后良好有關(guān)[16]。這些結(jié)果可能是由于M1和M2巨噬細(xì)胞的CD68表達(dá)相似有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)CD68+TAM進(jìn)一步分類(lèi)標(biāo)記為M1、M2。

CD163是M2巨噬細(xì)胞的最佳標(biāo)記[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中大量CD163+TAM與快速增殖、分化差、ER陰性和導(dǎo)管組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)，較高的CD163+TAM數(shù)量與預(yù)后不良、組織學(xué)分級(jí)高、腫瘤體積較大、Ki-67增殖指數(shù)高、ER和PR陰性有關(guān)[17-18]。高級(jí)別腫瘤可能分泌更高水平的單核細(xì)胞集落刺激因子，IL-10和(或)TGF-β，從而導(dǎo)致CD163+TAM數(shù)量眾多[17]。考慮到M2巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)重塑蛋白在腫瘤進(jìn)展中起作用[18]，CD163+TAM數(shù)目的增加可解釋不良的預(yù)后。

已知腫瘤浸潤(rùn)的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞預(yù)后良好。然而，未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞與預(yù)后并不相關(guān)[19]。CD11c在與髓樣和單核細(xì)胞相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞乃至一些活化的B和T細(xì)胞中都過(guò)表達(dá)[20]。在本實(shí)驗(yàn)中乳腺癌中M2/M1比率和腫瘤臨床指標(biāo)的關(guān)系存在有一定的相關(guān)性。高M(jìn)2/M1染色組和低M2/M1染色組在病理分級(jí)、AJCC分級(jí)、OS方面差異有顯著性(P<0.05)。由此可見(jiàn)腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型分化，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志，而TS中CD11c+TAM可提示預(yù)后良好。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌TS中CD68+或CD163+TAM表達(dá)，結(jié)果顯示兩者浸潤(rùn)與臨床病理特征相關(guān)，并與OS不良有關(guān)，TS中CD11c+TAM的浸潤(rùn)與OS良好有關(guān)。有研究表明TS中CD68+TAM與臨床病理特征或生存相關(guān)[14]，而不是腫瘤巢(TN)中的CD68+TAM，這與本實(shí)驗(yàn)相似。然而，既往在黑色素瘤中的研究表明，TN中CD68+TAM浸潤(rùn)與較差的OS和無(wú)瘤生存期有關(guān)[21]。在子宮內(nèi)膜癌中，TN中CD68+TAM浸潤(rùn)與復(fù)發(fā)率降低呈正相關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)建議在檢查惡性腫瘤中的TAM時(shí)，還應(yīng)考慮其定位情況。

綜上所述，乳腺癌中包括M2巨噬細(xì)胞在內(nèi)的TAM與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。TS中CD68+或CD163+TAM浸潤(rùn)提示乳腺癌患者預(yù)后不良，而TS中CD11c+TAM可提示預(yù)后良好。此外，除了分析TAM的浸潤(rùn)程度外，了解TAM的位置對(duì)于評(píng)估患者預(yù)后亦很重要。