尤因肉瘤轉移機制的研究進展

吳春華，周小婷，王 華，2

尤因肉瘤(Ewing sarcoma)是好發(fā)于兒童和青少年骨及軟組織的小圓細胞惡性腫瘤，部分病例在早期階段具有一定轉移潛能，有的病例在原發(fā)灶較小時即可出現(xiàn)微轉移。盡管手術、化療及放療能有效治療原發(fā)灶腫瘤，但對轉移和復發(fā)患者的療效較差。為改善患者預后，對尤因肉瘤轉移的分子機制進行深入研究，尋找其靶向治療相關的新線索勢在必行。近年，對于尤因肉瘤轉移的分子機制研究主要集中在EWS-FLI1融合蛋白、miRNA、細胞骨架分子、Wnt信號通路、血管生成信號通路等方面。

1 EWS-FLI1融合蛋白

尤因肉瘤的重要特征是頻繁出現(xiàn)特異性染色體易位，其中85%的尤因肉瘤存在t(11;22)(q24:q12)，產生EWS-FLI1融合基因，并編碼相應融合蛋白。EWS-FLI1融合蛋白作為轉錄因子，通過調節(jié)下游信號轉導分子影響尤因肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移[1-2]。EWS-FLI1表達水平的變化使尤因肉瘤細胞表型具有高度可塑性。EWS-FLI1高表達時，細胞具有高增殖潛能；EWS-FLI1低表達時，細胞內肌動蛋白結合蛋白、細胞骨架結構相關蛋白和整合素明顯上調，而細胞間黏附蛋白(如緊密連接蛋白、橋粒蛋白)表達下降，導致腫瘤細胞間黏附向細胞與細胞外基質黏附轉化，細胞遷移、侵襲和轉移潛能增加[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，EWS-FLI1低表達狀態(tài)下，Rho信號通路關鍵上游調控因子(如CYR61、CTGF)以及調控肌動蛋白纖維形成和穩(wěn)定的因子(如TAGLN、CALD-1和TPM-1)表達上調，進而影響Rho和Hippo信號通路效應子MRTFB和TEAD。MRTFB通過與TEAD相互作用募集到染色質中，正向調控細胞骨架Rho-F肌動蛋白信號通路的基因轉錄。在EWS-FLI1負向調控基因的遠端區(qū)域有MRTFB和TEAD結合域的富集。EWS-FLI1可結合到MRTFB遠端區(qū)域，強烈干擾MRTFB的活性。因此，EWS-FLI1可通過干擾MRTFB/TEAD/YAP-1信號通路抑制Rho-肌動蛋白通路，進而抑制細胞骨架的自我調節(jié)(圖1)[3]。Hippo信號通路的效應子YAP-1/TAZ作為TEAD的輔助因子，在尤因肉瘤中可通過RASSF1C激活，并表現(xiàn)出與EWS-FLI1拮抗的轉錄活性。此外，EWS-FLI1可結合到編碼TAZ的WWTR1基因座上，降低TAZ mRNA的表達[4]。EWS-FLI1低表達時，YAP/TAZ與TEAD的結合增加，用低濃度YAP抑制劑維替泊芬(VP)處理即可顯著降低腫瘤細胞的遷移能力。RNA-seq全基因轉錄組分析顯示，與EWS-FLI1抑制有關的基因，尤其與細胞骨架、遷移及細胞外基質信號傳遞等相關的基因(如PLAU、FBNI和COL5A1等)顯著富集。同時，F(xiàn)-肌動蛋白和黏著斑的組裝也受到明顯阻斷。在小鼠異種移植模型中，術前給予不同劑量VP可延遲肺部轉移，提示VP對轉移潛能的抑制作用[5]。因此，TEAD/YAP-1/TAZ抑制劑有望用于尤因肉瘤的靶向治療和防止轉移的發(fā)生。

圖1 EWS-FLI1對細胞骨架的影響：A. EWS-FLI1高表達時，可通過干擾MRTFB 與TEAD/YAP-1的相互作用，抑制肌動蛋白細胞骨架相關基因(TAGLN、TPM-1、CALD-1)和細胞外基質與受體作用相關基因(CYR61、CTGF)的表達，進而阻礙細胞骨架組裝；B. EWS-FLI1低表達時，MRTFB/TEAD/YAP-1調控的細胞骨架相關因子表達增加，通過Rho通路促進肌動蛋白聚合，最終改變細胞形態(tài)，使其遷移能力增加

2 miRNA

2.1 miRNA-124多種miRNA參與了尤因肉瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉移等環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124可負向調控鋅指轉錄抑制因子SNAIL家族成員SLUG的表達，促進細胞間質-上皮轉化，使其遷移和侵襲能力降低。將miRNA-124穩(wěn)定表達的尤因肉瘤細胞A673注入裸鼠的側尾靜脈，6周后觀察到裸鼠肺轉移結節(jié)明顯減少，肉瘤細胞中miRNA-124呈高表達，而SLUG和vimentin的表達被抑制[6]。尤因肉瘤中miRNA-124表達受表觀遺傳調控，用二甲基轉移酶抑制劑5′-氮-2′-脫氧胞苷和組蛋白脫乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A處理miRNA-124低表達的A673細胞后，細胞的遷移和間充質特征明顯受到抑制，提示高甲基化介導了miR-124的低表達狀態(tài)，進而影響尤因肉瘤的間充質表型、促進轉移[6]。

2.2 miRNA-34miRNA-34家族包括3個成員：miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c。尤因肉瘤中miRNA-34a通常呈低表達，且在轉移瘤中的表達水平比原發(fā)灶明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a表達與Cyclin D1表達呈負相關。Cyclin D1是尤因肉瘤轉化的關鍵驅動因子，其表達受EWS-FLI1正向調控，參與誘導腫瘤細胞遷移、侵襲、血管生成等與轉移相關的過程。因此，推測miRNA-34a可能通過降低Cyclin D1表達來減弱部分EWS-FLI1的功能，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[7]。相反，miRNA-34b在尤因肉瘤中呈高表達，且在EWS-FLI1陽性病例中有更高水平的表達。進一步研究表明，miRNA-34b表達受EWS-FLI1融合蛋白的正向調控，并可結合NOTCH1的3’-UTR區(qū)直接下調NOTCH1的表達，在體外實驗中可顯著促進腫瘤細胞的增長、遷移和侵襲能力[8]。

2.3 miRNA-30dmiRNA-30d是新近鑒定的miRNA-30家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30d可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Ye等[9]用miRNA-30d轉染尤因肉瘤SKES1細胞后，細胞侵襲和遷移能力減弱，同時與腫瘤轉移密切相關的蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達均明顯降低，表明miRNA-30d過表達可能通過抑制MMP-2和MMP-9表達抑制尤因肉瘤細胞的侵襲和遷移。此外，在miRNA-30d高表達的細胞模型中，p-MEK1/2、p-ERK1/2和p-Akt的表達水平明顯降低，而這些分子的非磷酸化表達水平無明顯改變。提示miRNA-30d作為MEK/ERK和PI3K/Akt途徑上游信號的負向調節(jié)分子，通過調控上述分子的磷酸化水平，促進尤因肉瘤細胞S期阻滯和凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。

2.4 miRNA-130b尤因肉瘤中miRNA-130b可直接靶向抑制Arhgap1的表達[10]；同時Arhgap1又是Cdc42負性調節(jié)劑，可將活性Cdc42水解為非活性的GDP狀態(tài)。Cdc42作為Rho GTPase家族成員，是腫瘤轉移的關鍵蛋白，在尤因肉瘤中處于活化狀態(tài)。Arhgap1表達瞬時敲低出現(xiàn)了與miRNA-130b過表達相同的效果，即PAK1和下游分子c-JUN均被明顯激活；而活化的c-JUN可導致轉錄因子AP-1活化，并轉位到細胞核誘導靶基因如MMP-1、Cyclin D1等的表達，促進轉移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AP-1可與miRNA-130b啟動子結合，經激活劑TPA處理后的AP-1，僅4 h就可誘導miRNA-130b前體的轉錄，表明miRNA-130b與AP-1之間存在正反饋調節(jié)環(huán)路。因此，miRNA-130b通過負性調控尤因肉瘤細胞中Arhgap1的表達，減少Cdc42水解，激活與轉移有關的Cdc42-PAK1-AP-1反饋環(huán)路，最終促進尤因肉瘤轉移(圖2)。此外在Cdc42-PAK1-AP-1反饋環(huán)路中，應用PAK1抑制劑可減弱miRNA-130b和AP-1誘導的效應，為抗腫瘤治療靶點研究提供新線索。

圖2 尤因肉瘤中miR-130b/Cdc42/PAK1/AP-1促進轉移的正反饋環(huán)路圖

3 Wnt/β-catenin信號通路

在部分尤因肉瘤中，R-脊椎蛋白配體和(或)其細胞表面受體富亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體LGR5呈高表達，兩者可以協(xié)同作用并激活Wnt/β-catenin/TCF及LEF信號通路，促進尤因肉瘤轉化成侵襲性表型[11]。Wnt/β-catenin活化細胞中，一些抑制基因與EWS-FLI1誘導基因明顯重疊，而其上調基因則與EWS-FLI1抑制基因明顯重疊，且EWS-FLI1轉錄物及蛋白表達水平均降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號與EWS-FLI1表達存在拮抗作用[11]。在EWS-FLI1抑制而Wnt/β-catenin激活的基因中，包括zyxin在內的許多細胞骨架基因和腱生蛋白C顯著表達，細胞偽足小體形成增多，擴散、遷移能力增強，小鼠模型中肺部轉移也顯著增加[11]。Wnt/β-catenin信號通路可減弱EWS-ETS對Ⅱ型TGF-β受體表達的抑制[12]，此外，還可誘導尤因肉瘤細胞中分泌蛋白發(fā)生改變，特別是促進細胞外基質相關蛋白的分泌，包括多種與血管基質蛋白高度重疊的細胞外基質蛋白(如TNC、LUM、MMP-2等)[13]，從而誘導內皮細胞增殖，增加腫瘤血管形成[12]。

目前已有針對Wnt通路抑制劑的研發(fā)，如Wnt974，一種特異性?；D移酶Porcupine抑制劑。Wnt配體分泌以及與受體的相互作用需要通過Porcupine的棕櫚?；揎?，Wnt974通過抑制Porcupine的作用來抑制Wnt通路的激活。用Wnt974處理尤因肉瘤細胞系后，與上皮-間質轉化和轉移相關的基因(如TWIST1、ZEB2和SNAIL1)顯著下調。雖然Wnt974對小鼠原發(fā)腫瘤的生長無明顯影響，但可延遲轉移的發(fā)生，且原發(fā)腫瘤切除后生存期也明顯延長。將Wnt974處理后的尤因肉瘤細胞直接通過尾靜脈注射到血液循環(huán)中，繞過轉移級聯(lián)的早期步驟，發(fā)現(xiàn)對小鼠轉移瘤形成和生存期無明顯影響，提示W(wǎng)nt974主要在轉移早期發(fā)揮抑制作用，從而導致轉移延遲[14]。因此，該藥物在尤因肉瘤中具有早期靶向抑制轉移形成的特性。

4 CAV1/MEK/ERK/MMP-9信號通路

CAV1(Caveolin-1)是一種多功能支架蛋白，與RNA聚合酶Ⅰ和轉錄釋放因子(polymerase Ⅰ and transcription released factor, PTRF)一起形成細胞膜穴樣內陷所必需的復合蛋白[15]。研究證實CAV1可通過IQGAP1激活MEK/ERK通路，促進MMP-9表達并調節(jié)其活性，促進尤因肉瘤細胞的遷移侵襲。CAV1沉默的尤因肉瘤細胞中，核糖體蛋白S6(RPS6)和RSK1磷酸化水平減少，其中RPS6是ERK的下游分子，可以被RSK蛋白磷酸化。在RSK1沉默的細胞模型中，雖然RPS6磷酸化水平和MMP-9的表達和活性未受影響，但細胞遷移和侵襲能力卻明顯降低。敲低RSK1的小鼠模型中，尤因肉瘤肺部轉移從83%減少到33.33%[16]，提示RSK1是促進轉移的關鍵因子，為針對CAV1誘導的尤因肉瘤轉移及其治療提供新的思路，MEK/ERK和RSK1抑制劑有望成為抑制轉移的靶向治療藥物。

盡管CAV1在尤因肉瘤細胞中高表達，但腫瘤細胞的細胞膜上卻只有很少的細胞膜穴樣內陷形成，這可能與形成細胞膜穴樣內陷所必需的另一個分子PTRF低表達有關。在一項86例尤因肉瘤中的PTRF表達分析顯示，只有38.37%病例PTRF陽性，且PTRF陽性患者的總生存率更高，表明PTRF可能是尤因肉瘤的腫瘤抑制因子和預后標志物。PTRF低表達與CpGs高度甲基化有關。PTRF和CAV1在尤因肉瘤中呈共定位并相互作用，導致細胞膜穴樣內陷形成，細胞凋亡顯著增加，呈p53依賴性。在p53野生型細胞中導入PTRF可引起顯著的細胞凋亡，并可中和CAV1的致癌活性。對于p53野生型尤因肉瘤細胞，使用表觀遺傳學藥物恢復PTRF表達可能成為潛在的治療方法，也可設想將針對PTRF治療與恢復p53活性的藥物結合起來，治療TP53缺失突變的尤因肉瘤[17]。

5 血管生成

異常血管生成與惡性腫瘤的進展和轉移密切相關[18]。尤因肉瘤主要以兩種方式形成血管網(wǎng)絡，一種是血管內皮細胞增生遷移形成新生血管，另一種是通過腫瘤細胞誘導血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)。多種因素參與了血管形成的調節(jié)，如Wnt通路激活可明顯增加血管基質蛋白分泌[12]。在血管生成初始階段易發(fā)生缺氧，血管生成通過激活低氧誘導因子誘導VEGF、FGFs和一些趨化因子的表達[19]。此外，抑制元素1-沉默轉錄因子(REST)在尤因肉瘤中過表達，并受EWS-FLI1正向調控，通過CRISPR/Cas9敲除REST基因后，腫瘤在體內的生長和向肺部的轉移減少，腫瘤血管呈點狀，血管周細胞明顯減少，血管灌注減少，通透性增加，加速缺氧和細胞凋亡[20]。

Eph受體酪氨酸激酶及其膜錨定配體(Ephrins)構成最大的受體酪氨酸激酶(RTK)亞家族，是促血管生成的主要RTK家族成員。Ephrins存在時，EphA2與CAV1相互作用，激活AKT信號傳導并促進bFGF表達，誘導內皮細胞遷移[21]。多種尤因肉瘤細胞系存在EphA2絲氨酸897位點的磷酸化，通過MEK/ERK途徑，參與尤因肉瘤細胞的遷移。EphA2沉默可引起ERK的磷酸化改變，而更多實驗表明，在EphA2和ERK之間存在相互調節(jié)反饋環(huán)，EphA2可能作為ERK激酶的下游底物和效應物在尤因肉瘤轉移中起重要作用[22]。

與其它侵襲性腫瘤(如黑色素瘤)相似，尤因肉瘤細胞可分化為具有內皮特征的細胞，進而形成豐富的VM。在VM陽性的尤因肉瘤組織中，CD44呈高表達，尤其在血湖(血管生成結構)周圍的腫瘤細胞表達更加顯著。CD44作為一種跨膜糖蛋白，通過與透明質酸結合促進細胞與細胞外基質的黏附，敲除CD44后，腫瘤細胞的遷移和VM均受到明顯抑制[23]。此外，腫瘤細胞可通過分泌血小板衍生生長因子PDGF-B，募集周細胞并誘導基膜蛋白表達，以維持血管樣網(wǎng)狀結構的穩(wěn)定、促進血管出芽[24]。Thijssen等[25]在黑色素瘤小鼠模型中研究顯示，PDGF受體阻斷劑伊馬替尼可有效減少微血管密度和周細胞的數(shù)量。TGF-β家族受體之一的內皮糖蛋白是另一種可在腫瘤細胞表面表達的血管生成相關蛋白。近期Puerto-Camacho等[26]在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，針對內皮糖蛋白的靶向藥OMTX703能有效延緩尤因肉瘤細胞系和患者來源的異種移植瘤的生長。

6 外泌體

外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡，直徑30～150 nm，含有DNA、mRNA、miRNA和蛋白質，可以攜帶并輸送功能性小分子物質，介導細胞間通訊和調控腫瘤微環(huán)境，已成為腫瘤研究的熱點。Miller等[27]首次鑒定出尤因肉瘤細胞系衍生的外泌體，發(fā)現(xiàn)其中含有尤因肉瘤特異性EWS-FLI1轉錄子及mRNA，并富集了與G蛋白偶聯(lián)信號傳導、神經遞質信號傳導和干細胞相關的轉錄物，提示外泌體可作為尤因肉瘤外周血中最小殘留物的診斷標志物。CD99是尤因肉瘤細胞表面分子標志物，在尤因肉瘤中協(xié)同促進EWS-FLI1的致癌作用、調控細胞遷移，并能抑制肉瘤細胞的神經分化。CD99沉默細胞產生的外泌體可調節(jié)受體細胞的基因表達，如上調半乳糖凝集素3結合蛋白基因、下調轉錄因子EGR1基因等的表達，這些基因在調節(jié)尤因肉瘤細胞的侵襲、遷移中起重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)CD99沉默的細胞通過釋放外泌體，遞送能夠抑制腫瘤細胞惡性生物學行為的miRNA，促進尤因肉瘤受體細胞明顯降低其增殖和遷移能力[28-29]。其中miRNA-34a可抑制NOTCH-NF-κB信號通路，誘導尤因肉瘤細胞的神經分化[28]。富集最多的miRNA-199a-3p是抑制尤因肉瘤細胞生長和遷移的關鍵驅動因子，在出現(xiàn)肺部或骨轉移的患者中明顯少于未轉移患者[29]。將尤因肉瘤細胞置于miRNA-199a-3p或富含miRNA-199a-3p的外泌體中，均可以復制CD99沉默細胞來源外泌體的調節(jié)效應、抑制AP-1活性及其靶基因如MMP-9、MMP-1和CCND1的表達，細胞生長和遷移能力降低，并向神經細胞分化。上述研究提示外泌體在腫瘤細胞的生命活動中起非常重要的作用，深入研究其在修飾尤因肉瘤相關微環(huán)境及發(fā)展中的作用，將為腫瘤治療提供更多新途徑。

7 結語

綜上，近年對尤因肉瘤轉移機制的研究，包括miRNA、Wnt信號通路、血管形成以及外泌體等方面取得了一些進展，對闡明尤因肉瘤轉移的分子機制、尋找新的靶向治療藥物奠定了基礎。由于尤因肉瘤轉移患者的治療效果和預后尚不理想，與轉移相關的一些具體機制仍不十分清楚。因此深入分析尤因肉瘤轉移中涉及的信號轉導通路、微環(huán)境調控、聯(lián)合靶向藥物等問題，將為尤因肉瘤的治療帶來新希望。