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    前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的作用

    2022-01-19 08:31:46龍瓊先張旭乾廖文華
    關(guān)鍵詞:緩沖液細(xì)胞周期前列腺癌

    龍瓊先,伍 季,彭 勇,張旭乾,廖文華

    國(guó)際癌癥研究中心(IARC)的GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,2020年前列腺癌新發(fā)病例1 414 259例,死亡病例375 304例,是全球第四大常見(jiàn)癌癥和男性第二大常見(jiàn)癌癥[1]。原鈣黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)屬于非聚集型原鈣黏蛋白家族,與已證實(shí)的抑癌基因PCDH8、PCDH17、PCDH20同位于染色體13q21,可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用,以及調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子,其表達(dá)缺失可引起腫瘤增殖甚至轉(zhuǎn)移[2]?,F(xiàn)有研究顯示,PCDH9在多種實(shí)體腫瘤(如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌)組織中表達(dá)下降,且與腫瘤惡性程度及患者預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)研究對(duì)65例未經(jīng)治療的中國(guó)前列腺癌患者及良性配對(duì)組織進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中存在PCDH9缺失,其可以作為一個(gè)新的潛在的前列腺癌抑制基因[3]。然而,PCDH9缺失對(duì)抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的影響報(bào)道甚少,其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)分析PCDH9在調(diào)控前列腺癌細(xì)胞周期中的作用,探討其表達(dá)缺失在抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制,為明確前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料收集2018~2020年南充市中心醫(yī)院存檔的92例前列腺癌、36例良性前列腺石蠟包埋組織,所有組織常規(guī)HE染色后均經(jīng)2位以上病理專家診斷。92例前列腺癌患者年齡48~87歲,平均(64.33±5.46)歲。按照2016版前列腺癌WHO/ISUP分級(jí)分組系統(tǒng)將前列腺癌分為1~5個(gè)組別:1組8例,2組15例,3組17例,4組21例,5組31例。術(shù)前PSA≤20 ng/mL 23例,>20 ng/mL 69例。所有患者均行手術(shù)切除治療,患者術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素等治療。

    1.2 主要試劑PCDH9兔抗人抗體購(gòu)自Abcam公司,STAT3、Cyclin D1和C-myc抗體均購(gòu)自福州邁新公司;免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。

    1.3 免疫組化取石蠟包埋組織蠟塊3 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟至水。Multimer標(biāo)記兩步法檢測(cè),由全自動(dòng)多功能病理檢測(cè)系統(tǒng)(Benchmark GX,羅氏公司)按步驟操作?;緱l件設(shè)定為:抗原修復(fù)30 min,用緩沖液沖洗,加入U(xiǎn)V DAB inhibitor(Ultraview Universal DAB Detection Kit,羅氏公司),37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗,添加一抗(PCDH9、Cyclin D1和C-myc),37 ℃ 30 min。緩沖液沖洗,加UV HRP multimer(Ultraview Universal DAB Detection Kit,羅氏公司),37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗,加入等體積的DAB和DAB H2O2(Ultraview Universal DAB Detection Kit,羅氏公司),37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗,加入U(xiǎn)V copper(DAB試劑盒內(nèi)),37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗,蘇木精Ⅱ核復(fù)染,37 ℃ 8 min。用緩沖液沖洗,加入Bluing Reagent,37 ℃ 4 min,緩沖液沖洗,封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

    1.4 結(jié)果判斷組織切片由2名病理醫(yī)師重復(fù)觀察,隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野,按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分,11%~25%為2分,26%~50%為3分,51%~100%為4分;按陽(yáng)性染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分相加作為最終評(píng)分:≤2分為陰性,>2分為陽(yáng)性。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 前列腺癌組織和良性前列腺組織中PCDH9的表達(dá)PCDH9陽(yáng)性呈棕黃色或棕褐色顆粒,主要定位于細(xì)胞質(zhì)。PCDH9蛋白在前列腺癌組織中低表達(dá),陽(yáng)性率為72.8%(67/92),顯著低于良性前列腺癌組織(100%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.157,P<0.001)(圖1A~C)。

    2.2 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性前列腺癌組織中細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D1的陽(yáng)性率為68.5%(63/92)(圖1D),C-myc的陽(yáng)性率為64.1%(59/92)(圖1E),與良性前列腺組織相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。63例Cyclin D1陽(yáng)性前列腺癌組織中25例存在PCDH9蛋白表達(dá)缺失,25例PCDH9表達(dá)缺失病例中均存在C-myc蛋白過(guò)表達(dá)。同時(shí)Spearman檢驗(yàn)分析前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)與Cyclin D1、C-myc的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.414、-0.457,P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

    表1 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性

    2.3 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達(dá)的相關(guān)性STAT3陽(yáng)性主要位于細(xì)胞核,其在前列腺癌組織中高表達(dá),陽(yáng)性率為82.6%(76/92)(圖1F)),76例STAT3陽(yáng)性的前列腺癌組織中24例存在PCDH9蛋白表達(dá)缺失,Spearman檢驗(yàn)分析顯示,前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)與STAT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.216,P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

    ABCDEF

    表2 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達(dá)的相關(guān)性

    2.4 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析前列腺癌組織中PCDH9、STAT3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在高WHO/ISUP分級(jí)分組、PSA>20 ng/mL及Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌組織中PCDH9的陽(yáng)性率顯著降低(P<0.01),PCDH9表達(dá)與患者年齡、脈管神經(jīng)侵犯無(wú)關(guān)(P>0.05)。前列腺癌組織中STAT3表達(dá)與WHO/ISUP分級(jí)分組、PSA水平相關(guān)(P<0.05),在WHO/ISUP分級(jí)分組5組、PSA>20 ng/mL組中,STAT3的陽(yáng)性率最高,而不同年齡、有無(wú)脈管神經(jīng)侵犯及不同臨床分期組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。>

    表3 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

    3 討論

    近年來(lái),中國(guó)男性前列腺癌的發(fā)病率逐漸升高,尤其是70歲以上的老年患者,嚴(yán)重影響了老年男性的生活及健康[4]。早期前列腺癌缺乏特異的臨床癥狀,發(fā)病較為隱匿,臨床上主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿增多、尿流細(xì)弱,與前列腺增生癥狀類似;當(dāng)出現(xiàn)明顯的癥狀時(shí),疾病多已發(fā)展至中晚期[5],易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,臨床上多數(shù)患者初診時(shí)即失去了根治性治療的機(jī)會(huì)。因此,探究中國(guó)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,對(duì)前列腺癌的早預(yù)防、早診斷及早治療具有重要的意義。

    PCDH9屬于非集簇原鈣黏蛋白家族,可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用和調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子,其表達(dá)缺失可引起腫瘤增殖甚至轉(zhuǎn)移[2]。Wang等[6]在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中觀察到PCDH9表達(dá)下調(diào),而PCDH9的外源表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。PCDH9可以通過(guò)激活GSK-3β信號(hào)并抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail1的表達(dá)來(lái)抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p在卵巢癌中表達(dá)上調(diào),過(guò)表達(dá)的miR-200a-3p通過(guò)靶向PCDH9促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[8]。上述研究提示惡性腫瘤中存在PCDH9表達(dá)缺失,且與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中PCDH9的缺失率為27.2%,與良性前列腺組織相比,其表達(dá)下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),PCDH9表達(dá)與前列腺癌的分級(jí)分組、臨床分期和PSA水平等預(yù)后指標(biāo)密切相關(guān)。Zhang等[9]檢測(cè)了24例前列腺癌和對(duì)應(yīng)正常組織中PCDH9的表達(dá),結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)低于正常組織。究其腫瘤組織中PCDH9表達(dá)缺失的原因,有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中不僅存在PCDH9的雜合性缺失,而且還存在DNA甲基化[10];而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-215-5p可以通過(guò)結(jié)合其啟動(dòng)子和3′UTR來(lái)抑制PCDH9的表達(dá)[11]。除了miRNA靶向PCDH9 mRNA影響蛋白表達(dá),蛋白-蛋白相互作用也可能造成PCDH9表達(dá)缺失。最近有研究顯示前列腺癌細(xì)胞中PCDH9表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致AKT磷酸化和活性增加,PCDH9在轉(zhuǎn)錄后受piR-001773和piR-017184調(diào)控,進(jìn)一步揭示了前列腺癌中PCDH9表達(dá)下調(diào)的意義[9]。

    上述研究結(jié)果顯示,前列腺癌組織中存在PCDH9表達(dá)下調(diào),但其在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制仍不清楚。STAT3是一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子,多種惡性腫瘤細(xì)胞中都存在異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3的異常激活[12-13]。STAT3表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖,而其下調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,其是激活多種生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子信號(hào)通路上的關(guān)鍵點(diǎn)。目前,已鑒定出許多STAT3的靶基因,包括編碼抗凋亡基因BCL-x和MCL-1,細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D1和C-myc,以及促血管發(fā)生因子VEGF。Cyclin D1基因的擴(kuò)增、染色體重排或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)均可導(dǎo)致其蛋白過(guò)表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)生癌變,STAT3可能通過(guò)調(diào)節(jié)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[14]。同時(shí),STAT3通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與Src結(jié)合,激活C-myc基因并上調(diào)Cyclin D1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期[15]。Cyclin D1在正常組織中表達(dá)量較少甚至不表達(dá),在多數(shù)惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌中Cyclin D1表達(dá)顯著高于良性卵巢腫瘤,其表達(dá)與腫瘤分級(jí)、FIGO分期、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),且Cyclin D1陽(yáng)性組的LVD計(jì)數(shù)高于Cyclin D1陰性組。C-myc已經(jīng)被證明在多種人類癌癥組織中呈高表達(dá),并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[17]。當(dāng)染色體易位或信號(hào)通路基因突變等情況發(fā)生時(shí),C-myc會(huì)發(fā)生不依賴于生長(zhǎng)因子刺激的擴(kuò)增,導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖和腫瘤產(chǎn)生[18]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了STAT3信號(hào)通路在介導(dǎo)前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的作用。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中Cyclin D1、C-myc的表達(dá)明顯高于良性前列腺組織,且隨腫瘤分級(jí)分組、臨床分期的增高而增高,與前列腺癌患者的預(yù)后有著密切關(guān)系。PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和C-myc過(guò)表達(dá)密切相關(guān),PCDH9表達(dá)缺失率隨著Cyclin D1和C-myc過(guò)表達(dá)率增高而增高,PCDH9表達(dá)缺失病例常存在Cyclin D1和C-myc的過(guò)表達(dá),提示前列腺癌組織中PCDH9表達(dá)缺失可能會(huì)引起腫瘤細(xì)胞周期紊亂,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)。為此,本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)觀察了前列腺癌組織中STAT3的表達(dá),并分析了PCDH9表達(dá)下調(diào)與STAT3表達(dá)上調(diào)的關(guān)系,結(jié)果顯示PCDH9表達(dá)缺失病例中存在STAT3的過(guò)表達(dá),進(jìn)一步提示STAT3信號(hào)通路在介導(dǎo)前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中具有重要的作用。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能存在PCDH9的表達(dá)缺失,其作用機(jī)制可能是STAT3信號(hào)通路介導(dǎo),通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,PCDH9可能成為進(jìn)展期前列腺癌治療的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。

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