透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中Sema4D的表達(dá)及臨床意義

許競(jìng)澤，楊天宇，鈕 慧，婁曉莉，沈珊珊，張永勝

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟惡性腫瘤的90%以上，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC常見的組織學(xué)類型之一，占RCC的70%～80%。與其它泌尿系統(tǒng)腫瘤不同，ccRCC對(duì)放療和化療均不敏感，因此大部分腫瘤通過(guò)手術(shù)方式進(jìn)行切除。然而，約30%的ccRCC患者在初診時(shí)已發(fā)生不同程度的擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，20%～40%患者術(shù)后仍會(huì)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)者預(yù)后較差[2]。因此，尋找可靠的預(yù)后指標(biāo)及有效的治療靶點(diǎn)對(duì)提高ccRCC患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。Semaphorin 4D(Sema4D)是信號(hào)素Semaphorins家族成員之一。Sema4D在免疫調(diào)節(jié)、軸突引導(dǎo)、血管生成、骨重塑、腫瘤遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用。目前，Sema4D在ccRCC中表達(dá)的相關(guān)研究較少。因此，本文旨在探討Sema4D在ccRCC中的表達(dá)意義，為ccRCC患者的預(yù)后評(píng)估提供新的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2009年10月～2019年7月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院存檔的手術(shù)切除的ccRCC標(biāo)本285例及癌旁正常腎臟組織標(biāo)本253例作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師均確診為ccRCC；(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它器官惡性腫瘤；(2)術(shù)前接受放療和化療等相關(guān)治療；(3)有遺傳性家族病史。285例ccRCC中，男性194例，女性91例。年齡21～88歲，平均58.6歲，中位年齡60歲，其中≥60歲147例，<60歲138例。腫瘤直徑≥5 cm 100例，<5 cm 185例。根據(jù)2009年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第七版分期標(biāo)準(zhǔn)：TNM分期Ⅰ+Ⅱ期272例，Ⅲ+Ⅳ期13例。按照ISUP/WHO核分級(jí)將病例分為1～4級(jí)，其中193例為低分級(jí)(1～2級(jí))，80例為高分級(jí)(3～4級(jí))。本實(shí)驗(yàn)獲得蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。隨訪截至2021年3月，隨訪時(shí)間1～129個(gè)月，中位時(shí)間51個(gè)月。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法染色檢測(cè)Sema4D蛋白在ccRCC組織中的表達(dá)。按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項(xiàng)計(jì)分結(jié)果相加作為最終結(jié)果：0～2分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

1.3 qRT-PCR采用Trizol試劑盒提取ccRCC和癌旁正常組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qRT-PCR法檢測(cè)Sema4D基因表達(dá)。Sema4D引物序列：上游5′-AAGCAGCATGAGGTGTATTGG-3′，下游5′-AGTTGAGGCACTCTGTCTGTT-3′。內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGT TCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s、63 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線，每個(gè)組織樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia cancer-pku.cn/)分析523例ccRCC組織中Sema4D mRNA的表達(dá)與患者總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間的關(guān)聯(lián)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析比較ccRCC中Sema4D表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較組間的生存差異。應(yīng)用Prism 7.0軟件繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC和癌旁正常組織中Sema4D蛋白的表達(dá)285例ccRCC組織中，Sema4D高表達(dá)89例(31.2%)，低表達(dá)196例(68.8%)(圖1A～D)；在253例癌旁正常組織中，高表達(dá)219例(86.6%)(圖1E)，低表達(dá)34例(13.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=167.664，P<0.001)。

2.2 ccRCC中Sema4D的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Sema4D蛋白表達(dá)與ccRCC的ISUP/WHO核分級(jí)(χ2=7.262，P=0.007)和脈管轉(zhuǎn)移(χ2=4.066，P=0.044)有關(guān)；與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤發(fā)生部位、TNM分期等無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中Sema4D表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ccRCC和癌旁正常組織中Sema4D mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)ccRCC組織和癌旁正常組織結(jié)果顯示，Sema4D mRNA相對(duì)表達(dá)量在ccRCC組織中為0.013 2±0.002 9，在癌旁正常組織中為0.031 5±0.004 1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.807，P=0.001)，表明Sema4D mRNA在ccRCC組織中表達(dá)下調(diào)。

ABCDE圖1 Sema4D蛋白在不同級(jí)別透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá),En-Vision法:A.ISUP/WHO 1級(jí)呈高表達(dá),評(píng)分4分;B.ISUP/WHO 2級(jí)呈低表達(dá),評(píng)分2分;C.ISUP/WHO 3級(jí)呈低表達(dá),評(píng)分2分;D.ISUP/WHO 4級(jí)呈低表達(dá),評(píng)分0分;E.癌旁正常組織呈高表達(dá),評(píng)分6分

2.4 Sema4D表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Sema4D基因與ccRCC患者生存期的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Sema4D基因高表達(dá)ccRCC患者的無(wú)瘤生存時(shí)間(P=0.000 52)和總生存時(shí)間(P=0.001 6)均高于Sema4D基因低表達(dá)ccRCC患者(圖2A、B)，提示Sema4D基因高表達(dá)與ccRCC患者的預(yù)后良好密切相關(guān)。同時(shí)，收集207例ccRCC患者的隨訪資料進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，ccRCC中Sema4D蛋白高表達(dá)組患者的生存時(shí)間高于低表達(dá)組(χ2=3.868，P=0.049，圖2C)，提示Sema4D蛋白低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。

圖2 A. Sema4D mRNA表達(dá)與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間的關(guān)系；B. Sema4D mRNA表達(dá)與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者總生存時(shí)間的關(guān)系；C. 透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中Sema4D高表達(dá)組和低表達(dá)組患者生存曲線

3 討論

Sema4D又稱CD100，屬于Semaphorins信號(hào)素家族Ⅳ類成員。Semaphorins家族是一類具有高度保守結(jié)構(gòu)的分泌蛋白和跨膜蛋白分子家族，其N端有一由500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的Semaphorins結(jié)構(gòu)域和下游的叢狀蛋白-信號(hào)素-整合素結(jié)構(gòu)域(plexin-semaphorin-integrin, PSI)，這一特征結(jié)構(gòu)與信號(hào)素的活性有關(guān)，并在一定程度上決定了受體結(jié)合的特異性[3]。根據(jù)Semaphorin分子結(jié)構(gòu)的不同，可分為8個(gè)家族亞族：無(wú)脊椎動(dòng)物種屬中的Semaphorin蛋白為Ⅰ、Ⅱ類，脊椎動(dòng)物種屬中的Semaphorin蛋白為Ⅲ～Ⅷ類，非神經(jīng)來(lái)源的病毒種屬中的Semaphorin蛋白屬于Ⅷ類[4]。Sema4D蛋白主要以同源二聚體膜結(jié)合糖蛋白形式存在，在炎癥和腫瘤發(fā)生時(shí)也可從細(xì)胞表面釋放，以可溶性蛋白形式存在[5]。Sema4D可通過(guò)結(jié)合叢狀蛋白Plexin-B1、Plexin-B2和CD72等受體發(fā)揮血管生成、免疫調(diào)節(jié)、軸突引導(dǎo)等生理功能。Plexin-B1受體是Sema4D親和力最高的受體，其主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，Sema4D的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域與Plexin-B1結(jié)合并激活酪氨酸激酶受體Met和相關(guān)的巨噬細(xì)胞刺激蛋白受體Ron，從而促進(jìn)血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程[6]。Sema4D是人類免疫系統(tǒng)中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的信號(hào)素，CD72分子主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞，如B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，是B細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控因子。Sema4D可誘導(dǎo)CD72分子的酪氨酸去磷酸化，導(dǎo)致酪氨酸磷酸酶SHP-1從CD72胞質(zhì)區(qū)尾部分離，從而關(guān)閉CD72的負(fù)調(diào)控作用，誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、活化[7]。

多項(xiàng)研究表明，Sema4D在癌癥中可能扮演著雙重角色。Sema4D和Plexin-B1在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢上皮細(xì)胞癌[10]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[11]等。Conrotto等[12]發(fā)現(xiàn)了Sema4D可作為一種促血管生成因子，介導(dǎo)Plexin-B1與Met酪氨酸激酶受體結(jié)合，從而促進(jìn)血管生成。Lu等[13]研究發(fā)現(xiàn)Sema4D也能在膀胱癌中作為關(guān)鍵因子，通過(guò)激活PI3K/AKT通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。已有研究證明，破骨細(xì)胞可產(chǎn)生Sema4D，其與成骨細(xì)胞上的Plexin-B1受體結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及隨后獲得產(chǎn)生新骨的能力[14]。Yang等[15]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Sema4D分子，其能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-8并刺激破骨細(xì)胞生成，從而促進(jìn)乳腺癌的溶解性骨轉(zhuǎn)移。Sema4D還可通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境(包括血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì))，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。Wu等[6]發(fā)現(xiàn)Sema4D通過(guò)抑制單核細(xì)胞遷移和促進(jìn)單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化來(lái)調(diào)控腫瘤微環(huán)境，而M2型巨噬細(xì)胞可作為腫瘤啟動(dòng)子。另一方面，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumour-associated macrophages, TAM)通過(guò)蛋白酶裂解膜結(jié)合Sema4D，使其以可溶性形式釋放，從而允許Sema4D作用于局部和遠(yuǎn)處的腫瘤微環(huán)境[16]，使腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成成為可能。然而，Lu等[17]發(fā)現(xiàn)Sema4D在嫌色性腎細(xì)胞癌、ccRCC和甲狀腺癌中的表達(dá)下降，且在包括膀胱癌、ccRCC、黑色素瘤和胸腺瘤等實(shí)體腫瘤中，Sema4D高表達(dá)與更長(zhǎng)的總生存時(shí)間相關(guān)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，Sema4D表達(dá)與各種腫瘤的免疫浸潤(rùn)水平及多種免疫標(biāo)志物呈正相關(guān)，如在包括ccRCC、黑色素瘤和胸腺瘤在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中，Sema4D表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)，TAM標(biāo)志物如CCL2、CD86和IL10均與Sema4D高表達(dá)顯著相關(guān)，提示Smea4D可能參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。Sema4D和Plexin-B1也可在乳腺癌中作為抑癌因子發(fā)揮作用。Malik等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)瘤生存的患者相比，乳腺癌局部復(fù)發(fā)患者的Sema4D、Plexin-B1和Plexin-B2表達(dá)降低，且Sema4D下調(diào)與更差的無(wú)瘤生存時(shí)間有關(guān)(中位生存時(shí)間111.6個(gè)月，95%CI=96.5～126.7)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ER可能參與調(diào)節(jié)信號(hào)素和叢狀蛋白的表達(dá)：與ERα陰性患者相比，ERα陽(yáng)性患者的Sema4D和Plexin-B1表達(dá)增加。另外，Gómez等[19]研究發(fā)現(xiàn)Plexin-B1在ccRCC中的表達(dá)也下降。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，ccRCC組織中Plexin-B1 mRNA表達(dá)水平下降達(dá)2～6倍。免疫組化顯示209例ccRCC組織中Plexin-B1的陽(yáng)性率為19.1%，而在所有正常腎組織中均陽(yáng)性。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Plexin-B1載體的細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組ACHN細(xì)胞系?？傊琍lexin-B1可能作為抑癌因子，通過(guò)抑制ccRCC細(xì)胞的增殖來(lái)發(fā)揮抑癌功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)Sema4D基因和蛋白在ccRCC組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，Sema4D基因和蛋白表達(dá)均降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sema4D蛋白表達(dá)與ccRCC的ISUP/WHO分級(jí)和脈管轉(zhuǎn)移有關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，ccRCC中Sema4D蛋白高表達(dá)組患者的生存時(shí)間長(zhǎng)于低表達(dá)組；同時(shí)GEPIA在線數(shù)據(jù)結(jié)果表明，Sema4D基因高表達(dá)ccRCC患者的無(wú)瘤生存期和總生存期均高于低表達(dá)患者，以上結(jié)果提示Sema4D蛋白與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可能成為ccRCC潛在的治療靶點(diǎn)，為ccRCC患者的預(yù)后評(píng)估提供重要指標(biāo)。

綜上所述，Sema4D在許多實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，而本研究發(fā)現(xiàn)Sema4D基因和蛋白在ccRCC組織中表達(dá)下降，且與ccRCC的ISUP/WHO分級(jí)和脈管轉(zhuǎn)移相關(guān)，其生物學(xué)機(jī)制相關(guān)報(bào)道仍少見，這也為我們未來(lái)的研究指明了新的方向。鑒于Sema4D蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，相信隨著對(duì)其作用機(jī)制研究的不斷深入，其有望在腫瘤的治療上成為新的有效靶點(diǎn)。