日本血吸蟲重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑對小鼠心肌梗死預后的影響及其免疫調節(jié)機制

李燕楠，楊小迪，陳思宇，頡麗英，劉思麒，高爾和，左琳

1. 山西醫(yī)科大學細胞生理學教育部重點實驗室基礎醫(yī)學院生理學系，山西 太原 030001；2. 蚌埠醫(yī)學院安徽省感染與免疫重點實驗室微生物學與寄生蟲學系，安徽 蚌埠 233030；3. 天普大學醫(yī)學院轉化醫(yī)學中心，美國 費城 19140

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一類以冠狀動脈血供減少或中斷為基礎，伴隨心肌細胞壞死、溶解，漸由肉芽組織取代的不可逆的心血管疾?。?-2］。有數(shù)據(jù)顯示，目前我國心血管病患病人數(shù)約2. 9 億，該病死亡率占所有疾病的40%，位居第一，其中，MI是風險最高的危險因素［3］，其死亡率在我國呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人們的生命健康［4-5］。

目前，臨床上采用藥物溶栓、心肌再灌注、心臟再同步化及左室輔助裝置等方法治療MI，可在一定程度上改善心肌缺血，降低心肌耗氧量，緩解患者急性期的臨床癥狀［6］，但并不能從根本上減少心肌細胞的丟失及后期心室的不良重塑［7］。有研究認為，在一定程度上控制炎癥反應可減少心肌細胞丟失，對MI 后不良的心肌重塑有一定保護作用［8-10］。因此，對MI 早期炎癥反應進行適當干預是治療MI 的一條有效途徑。MI 后心臟的炎癥反應期是MI 修復的始動期［11］，死亡的心肌細胞會激活機體的先天免疫系統(tǒng)，一方面，白細胞趨化至損傷部位，造成鄰近心肌細胞的急性壞死；另一方面，炎性細胞清除壞死細胞及基質碎片，為組織修復奠定基礎［12］。MI 后長期過度的炎癥反應使組織嚴重損傷、心室不良重塑及心功能惡化，最終將導致心室壁瘤、心臟破裂、心力衰竭，甚至猝死等惡性不良事件［13-15］。目前，臨床上對無菌性炎癥反應的調控尚無抗炎特效藥，研究表明，給予適量地塞米松（dexamethasone，Dex）預處理，可減少心梗面積、心臟肌鈣蛋白I 的釋放及心肌細胞的凋亡，對心臟有一定的保護效應，其機制可能與其促進白介素-10（interleukin-10，IL-10）分泌有關［16-18］，但糖皮質激素不可長期使用［19-20］。因此，尋找針對無菌性炎癥的抗炎藥物對治療MI 顯得尤為重要。

蠕蟲體內的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）是半胱氨酸蛋白酶的高效抑制劑，其在蠕蟲體內分布廣泛，具有抑制蛋白酶活性、阻礙抗原提呈、調控抗炎因子和誘導抑炎特性的M2 型巨噬細胞生成等作用，利于發(fā)揮抗炎效應，對炎癥性疾病具有較好的治療效果［21-23］。有報道表明，日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）重組 cystatin（rSjcystatin）對結腸炎、膿毒癥、關節(jié)炎和Ⅰ型糖尿病的治療效果顯著，但對MI產生炎癥的療效尚未明確［23-26］，且rSjcystatin 對不同程度的炎癥疾病，使用劑量也有差異。因此本研究通過建立MI 小鼠模型，監(jiān)測小鼠生存率、心臟黏連率、炎性細胞浸潤及心臟結構和功能的變化，評價rSjcystatin 對MI 療效的影響，并檢測小鼠血清中炎性因子的水平，初步探討rSjcystatin 治療MI 的可能機制，以期為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 主要試劑及儀器 PBS 購自美國HyClone 公司；HE 染色試劑盒及Masson 三色染色液試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗CD45 單克隆抗體（#70257）購自美國 Cell Signaling Technology 公司；PV-9001 兔二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和 IL-10 ELISA 試劑盒購自上海達科為生物技術有限公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒購自中國ABclonal 公司；rSjcystatin 蛋白由安徽省蚌埠醫(yī)學院楊小迪教授惠贈；小動物高分辨率成像超聲儀器購自中國S-Sharp 公司。

1. 2 實驗動物 清潔級C57BL ／ 6J 小鼠，雄性，約8周齡，體重20 ~ 22 g，購自山西醫(yī)科大學動物中心，動物許可證號為：SCXK（晉）2015-0001。動物實驗操作過程符合山西醫(yī)科大學動物倫理學相關法規(guī)及各項規(guī)定，且獲得倫理委員會認可。

1. 3 小鼠MI 模型的建立 用異氟烷氣體麻醉小鼠，仰臥位固定，于左胸剪一斜型切口，止血鉗鈍性分離肌肉組織，于第4 肋間隙將心臟暴露于胸外，用外科手術線阻斷冠狀動脈左前降支，心尖部成為白色即造模成功。

1. 4 動物分組及給藥 將C57BL ／ 6J 小鼠隨機分為4 組：Sham 組（心臟左冠狀動脈前降支不結扎）、PBS 組（建模后 1、3、5、7、14、28 d 分別經腹腔注射 PBS，0. 1 mL ／ 只）及 10、25 μg rSjcystatin 治療組（建模后1、3、5、7、14、28 d 分別經小鼠腹腔注射含 10 及 25 μg rSjcystatin 蛋白的 PBS 混合液，0. 1 mL ／ 只）。Sham組8 只小鼠，其他每組均25 只。上述各組小鼠用于存活率的計算。相同方法另建PBS 組及10、25 μg rSjcystatin 治療組，用于小鼠心功能、心臟黏連、心室結構重塑情況、心臟損傷、心臟炎性細胞浸潤程度及血清中炎癥因子水平的檢測。

1. 5 小鼠存活率的計算 MI 術后28 d，統(tǒng)計小鼠存活數(shù)量，并按下式計算各組小鼠的存活率。

小鼠存活率（%）=每組小鼠存活只數(shù)／每組小鼠總數(shù)×100%

1. 6 小鼠心功能的檢測 MI 術后 1、3、7、14、28 d，將 PBS 組及 10、25 μg rSjcystatin 治療組小鼠經異氟烷麻醉，仰臥固定于超聲臺，調節(jié)超聲探頭角度置左心室，在M Mode 狀態(tài)下從左室乳頭肌水平二維左室短軸切面分別記錄左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVID，d）及心率（heart rate，HR）。

1. 7 小鼠心臟黏連情況的檢測 MI 術后28 d 心功能檢測后，開胸，用注射器逆行插入主動脈將PBS 推注心臟血管，至心腔血液沖洗干凈，再用中性福爾馬林推注，結扎血管叢，取心臟，置中性福爾馬林溶液，固定24 ~ 48 h，觀察黏連情況，并按下式計算心臟前壁與胸壁的黏連率。

心臟黏連率（%）= 每組心臟黏連小鼠只數(shù) ／ 每組小鼠只數(shù) × 100%

1. 8 小鼠心室結構重塑情況的檢測 采用Masson染色法。將1. 7 項摘取的小鼠（各組取5 只）心臟組織冠狀切開，保留梗死部分，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，切成厚度為 3 ~ 4 μm 的切片，60 ℃烤片，室溫干燥。石蠟切片置65 ℃干燥箱干燥約50 min，采用Masson 三色染色液試劑盒進行脫蠟水化及Weigert 鐵蘇木素、麗春紅品紅、苯胺藍染色，封片。應用Image Pro Plus 6. 0 軟件測量各組小鼠MI 術后28 d 心臟梗死面積百分比及左心室游離壁厚度。

1. 9 小鼠心臟損傷情況的檢測 采用HE 染色法。于 MI 術后 1、3、7 d，PBS 組及 10、25 μg rSjcystatin治療組各取5 只小鼠，按1. 8 項方法制備心臟組織石蠟切片，采用HE 染色試劑盒進行蘇木素、伊紅染色后封片，置熒光倒置顯微鏡下拍照，觀察心臟組織結構的變化及炎癥細胞浸潤的情況。

1. 10 小鼠心臟炎性細胞浸潤程度的檢測 采用免疫組化染色法。將1. 9 項制備的石蠟切片置65 ℃干燥箱干燥約30 min；常規(guī)脫蠟，PBS 洗滌2 次，EDTA抗原修復20 min；室溫冷卻，PBS 洗滌3 次；滴加內源性過氧化物酶阻斷劑（PV-9001 兔二步法檢測試劑盒自帶），避光封閉 20 min；PBS 洗滌 3 次，加入兔抗 CD45 單克隆抗體（1 ∶200 稀釋），于 4 ℃濕盒孵育過夜；室溫放置30 min，PBS 洗滌3 次，加入二抗反應增強液，避光孵育30 min；PBS 洗滌3 次，加入羊抗兔IgG（PV-9001 兔二步法檢測試劑盒自帶），避光孵育 1 h；PBS 洗滌 3 次，DAB 顯色，蘇木素染色 35 s，三蒸水洗滌，滴加分化液，變淺藍即刻放入PBS 中，脫水透明，封片。應用Image J 軟件測量棕黃色炎性細胞顆粒的平均光密度值。

1. 11 小鼠血清中炎癥因子水平的檢測 采用ELISA法。于 MI 術后 7 d，PBS 組及 25 μg rSjcystatin 治療組各取5 只小鼠，經眼球采血，分離血清，采用相應ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1 的含量。

1. 12 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 6. 01 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均采用均值± 標準誤（mean ± SEM）表示，兩組間生存率的比較采用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗，其他結果多組間差異的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間差異的比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠的存活率 MI 術后 28 d，Sham 組小鼠 8 只全部存活，PBS 組、10 及 25 μg rSjcystatin 治療組分別死亡7、3 和2 只小鼠，存活率分別為72%、88%和92%。與 PBS 組比較，10 和 25 μg rSjcystatin 治療組小鼠存活率均呈上升趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（t 分別為 2. 082 和 3. 149，P > 0. 05），見圖 1。小鼠死亡主要發(fā)生在MI 術后7 d 內，其原因主要為左心室壁梗死變薄，在左室應力作用下破裂出血，導致胸腔積血。

圖1 MI 術后各組小鼠的存活率Fig. 1 Survival rates of mice in various groups after MI

2. 2 小鼠的心功能 MI 術后28 d，PBS 組超聲圖前后室壁活動范圍小，尤其是前壁的運動，室腔明顯變大；與 PBS 組比較，10 及 25 μg rSjcystatin 治療組室壁的運動功能明顯改善，且后者的左室前壁活動幅度明顯大于前者，見圖2。3 組小鼠術后各時間點的HR 總體維持在約430 次 ／ min，組間差異無統(tǒng)計學意義（t = 0. 104 ~ 3. 132，P > 0. 05）。MI 術后 28 d，25 μg rSjcystatin 治療組的 LVFS 及 LVEF 顯著高于PBS 組和 10 μg rSjcystatin 治療組（t=2.809~4.212，P < 0. 05）；10 和 25 μg rSjcystatin 治療組的 LVID，d均顯著低于 PBS 組（t 分別為 2.778 和 3.650，P<0.05），但兩者間差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.535，P﹥0. 05）。見圖3。表明rSjcystatin 可有效改善MI 后心室壁運動及左心室血流動力學變化，利于心臟功能活動，25 μg 治療劑量的效果優(yōu)于 10 μg。

圖2 MI 術后28 d 各組小鼠的心臟超聲圖Fig. 2 Echocardiography of hearts of mice in various groups 28 d after MI

圖3 各組小鼠的心功能情況Fig. 3 Cardiac function of mice in various groups

2. 3 小鼠的心臟黏連率 PBS組、10和25μgrSjcystatin治療組小鼠的心臟黏連率分別為44. 44%（8 ／ 18）、40.91%（9 ／22）和 17.39%（4 ／23），表明 rSjcystatin 治療可降低MI 后小鼠心臟的黏連率，25 μg 治療劑量的效果優(yōu)于10 μg。

2. 4 小鼠心室結構的重塑 兩個劑量rSjcystatin治療組藍色膠原纖維區(qū)域明顯少于PBS 組，見圖4。PBS 組、10 和 25μg rSjcystatin 治療組的左室梗死面積百分比分別為（21. 00 ± 2. 40）%、（15. 80 ± 1. 96）%和（10. 13 ± 0. 66）%，25 μg rSjcystatin 治療組顯著低于 PBS 組和 10 μg rSjcystatin 治療組（t 分別為 3. 483和 2. 744，P 分別 < 0. 01 和 0. 05）。PBS 組、10 和25 μg rSjcystatin 治療組的左室游離壁厚度分別為（109.6 ± 2.97）、（156.3 ± 7.28）和（200.1 ± 4.72）mm，與 PBS 組比較，10 和 25 μg rSjcystatin 治療組明顯升高（t 分別為 7. 087 和 15. 830，P < 0. 001），后者顯著高于前者（t = 5. 055，P < 0. 001）。表明rSjcystatin 可顯著改善MI 后小鼠心臟的纖維化程度、梗死范圍與室壁厚度，25 μg 治療劑量的效果優(yōu)于 10 μg。

圖4 各組小鼠心臟切片的Masson 染色圖（標尺為：1 000 μm）Fig. 4 Masson staining of heart section of mice in various groups（bar = 1 000 μm）

2. 5 小鼠心臟損傷情況 MI 術后 1、3、7 d，與 PBS組比較，10 及 25 μg rSjcystatin 治療組心肌組織損傷減輕、心肌纖維疏松斷裂程度和藍色炎性細胞的浸潤減少，見圖5。表明MI 術后7 d，rSjcystatin 腹腔治療可適度減弱MI 后的心臟損傷。

圖5 各組小鼠心臟切片的HE 染色圖（標尺為：200 μm）Fig. 5 HE staining of heart section of mice in various groups（bar = 200 μm）

2. 6 小鼠心臟炎性細胞浸潤程度 MI 術后1、3 d，25 μg rSjcystatin 治療組棕黃色炎性細胞顆粒平均光密度值明顯低于 PBS 組（t 分別為 5.501 和 4.825，P<0. 05），10 μg 與 25 μg rSjcystatin 治療組間差異無統(tǒng)計學意義（t 分別為 2.177 和 1.747，P<0.05）；MI 術后 7d，25 μg rSjcystatin 治療組顯著低于 PBS 組和 10 μg rSjcystatin 治療組（t 分別為 3.806 和 12.710，P 分別 <0. 05 和 < 0. 001），見圖6 和圖7。表明建模后7 d，rSjcystatin 腹腔治療可適度減弱MI 后損傷部位的炎性細胞聚集浸潤程度，防止炎癥過度對心臟的損害，25 μg 治療劑量的效果優(yōu)于 10 μg。

圖6 各組小鼠心臟切片免疫組化染色圖（標尺為：500 μm）Fig. 6 Immunohistochemical staining of heart sections of mice in various groups（bar = 500 μm）

圖7 各組小鼠心臟棕黃色陽性顆粒的平均光密度值Fig. 7 Mean optical density of brown yellow positive granules in heart of mice in various groups

2. 7 血清中炎癥因子水平 MI 術后7 d，與PBS 組比較，25 μg rSjcystatin 治療組小鼠血清 TNF-α 和IL-6 含量顯著降低（t 分別為 2. 527 和 27. 460，P 分別為 < 0. 05 和 < 0. 01），TGF-β1 含量顯著升高（t =9. 069，P < 0. 001），IL-10 含量呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（t = 0. 556，P > 0. 05），見表 1。表明建模后7 d，25 μg rSjcystatin 可調控小鼠血清中的炎癥因子水平，適度減少促炎因子分泌，且增加抗炎因子分泌，利于減輕MI 時炎癥對組織的損傷，加強心肌修復。

表1 小鼠血清中炎癥因子的表達水平（pg ／ mL，，n = 5）Tab.1 Expression levels of cytokines in sera of mice（pg ／mL，，n = 5）

表1 小鼠血清中炎癥因子的表達水平（pg ／ mL，，n = 5）Tab.1 Expression levels of cytokines in sera of mice（pg ／mL，，n = 5）

注：與 PBS 組比較，a 表示 P<0.05，aa 表示 P<0.01，aaa 表示 P<0. 001。

組別 TNF-α IL-6 TGF-β1 IL-10 25 μg rSjcystatin 治療組 26. 95 ± 3. 93a 2. 38 ± 0. 03aa 42 739 ± 1 705aaa 61. 41 ± 19. 35 PBS 組 47. 75 ± 0. 01 3. 91 ± 0. 05 24 133 ± 1 142 49. 58 ± 8. 86

3 討 論

cystatin 是一類分布廣泛的半胱氨酸內肽酶抑制劑，可保護細胞免受蛋白酶的降解，參與機體的免疫、感染及細胞凋亡等生理病理過程，cystatin 依據(jù)氨基酸序列被分為 Stefins、Cystatins 和 Kininogens 3 大家族［27］。通過基因工程技術可制備大量活性較好的蠕蟲cystatin 蛋白，使用時劑量易控制，且安全性較好，無明顯毒副作用［28-29］。cystatin 蛋白可通過上調抗炎細胞因子，下調促炎細胞因子，調節(jié)T 細胞反應及促進巨噬細胞的極化來調控機體的免疫反應，在結腸炎、膿毒癥、關節(jié)炎和Ⅰ型糖尿病等炎癥性疾病的治療過程中療效顯著［23-24，30］。本研究結果表明，MI 模型小鼠經rSjcystatin 多次腹腔注射治療后，可顯著減輕心臟與胸壁的黏連程度，減少心肌損傷（P <0. 05），改善MI 小鼠的心功能，同時緩解MI 后的心肌重構（P<0.05），具有一定的心肌保護效應，25 μg rSjcystatin 的治療及保護效果優(yōu)于10 μg。

rSjcystatin 可通過影響組織炎性細胞的水平來發(fā)揮其抗炎作用［31］。研究表明，rSjcystatin 可減少膿毒癥小鼠的單核細胞活化［23］；絲蟲來源的cystatin治療哮喘后可顯著減少炎癥細胞，尤其是嗜酸性粒細胞向肺組織的募集，從而減輕局部組織損傷［20］；華支睪吸蟲和馬來絲蟲的cystatin 能夠使結腸炎小鼠的炎癥明顯減輕，其機制與激活腸道內M2 型巨噬細胞，參與組織修復有關［32］。已知CD45 分子在白細胞上均有表達，是反映炎性細胞浸潤情況的重要標記物，因此本實驗用其反映炎性細胞浸潤情況。本研究結果顯示，rSjcystatin 治療MI 小鼠后，可在一定程度上減輕MI 局部炎癥細胞的浸潤，尤其是炎癥早期的中性粒細胞浸潤，降低炎癥活性物質釋放所產生的級聯(lián)反應，從而防止缺血心肌的慢性病理損害，可在一定程度上延緩心室壁變薄的進程，對心衰的發(fā)生有一定延緩作用。cystatin 的抗炎作用可通過影響血清炎癥因子水平實現(xiàn)［33-35］。有研究發(fā)現(xiàn)，用rSjcystatin 治療小鼠結腸炎，可促炎細胞因子TNF-α 及IL-6 明顯下調（P < 0. 05），抗炎細胞因子 IL-10 及TGF-β 呈上調的趨勢［25］。另外，rSjcystatin 能通過增加調節(jié)性T 細胞的數(shù)量，抑制IFNγ 的分泌，同時增加 IL-10、TGF-β 的表達，改善Ⅰ型糖尿病的預后［22］。還有學者證實，rSjcystatin 對類風濕關節(jié)炎的緩解作用與 IL-4、IL-10 升高及 IFNγ、IL-6、IL-17、TNF-α 等促炎因子的顯著降低均密切相關［24］。本研究結果提示，25 μg rSjcystatin 治療 MI 可明顯下調促炎因子TNF-α 和 IL-6（P<0.05），明顯上調抗炎因子 TGF-β1（P < 0. 001），可上調IL-10 水平，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0. 05），從而減輕心臟過度的炎癥損害，為后期的修復組織奠定了環(huán)境基礎。

本實驗結果表明，經rSjcystatin 治療小鼠MI 后，可適度減弱炎細胞浸潤、降低促炎因子TNF-α 和IL-6的分泌、增加抗炎因子IL-10 和TGF-β1 的分泌，從而抑制MI 后的炎癥反應，在一定程度上延緩小鼠MI 后心肌結構及功能重構的發(fā)生，具有一定的心肌保護作用，本實驗為rSjcystatin 應用于臨床治療提供了實驗依據(jù)。