臭氧對肉鴨水線中細菌及藥物殘留清除效果的評估

張亞茹 ， 孫 偉 ， 鄭荷花 ， 王 沖 ， 盧國民 ， 肖大勇 ， 劉宗強 ， 許 毅

(1. 山東新希望六和集團有限公司 ， 山東 青島 266061 ； 2. 新希望六和股份有限公司 ， 山東 青島 266000)

水是家禽養(yǎng)殖過程中重要的營養(yǎng)元素，一般家禽飲水量是采食量的2～3倍，但是養(yǎng)殖人員往往關注飼料問題，而忽略了家禽飲水量是否充足，飲用水質(zhì)是否符合要求[1-2]，尤其容易忽略水質(zhì)管理問題。研究發(fā)現(xiàn)，種禽場和商品雞場水源水和水線水都存在細菌污染的問題[3-5]，一旦受細菌污染的水被家禽攝入體內(nèi)后，會引起腹瀉等腸道疾病，最終損害生產(chǎn)性能。另有研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場飲水給藥20周后，水線中仍然有抗菌藥殘留[6]，這將威脅食品安全。如何對水線細菌和抗菌藥殘留進行有效控制成為家禽安全生產(chǎn)困擾的問題之一。

常見的消毒劑如氯制劑等，對水線內(nèi)的微生物有良好的殺滅作用，但是對生物膜無明顯作用，細菌很容易再次滋生。另外消毒后的副產(chǎn)物具有致癌、致畸、致突變作用[7]，并且長時間使用會引起細菌產(chǎn)生耐藥性[8]。而臭氧作為強有效、作用快、無殘留的消毒劑，能夠殺滅細菌、病毒、芽孢等病原微生物。另外，臭氧能夠通過直接氧化和自由基間接氧化反應與抗菌藥分子進行作用[9-10]，氧化分解水線中殘留抗菌藥，已廣泛應用于水處理和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。在養(yǎng)殖行業(yè)，研究表明利用臭氧處理水和飼料后飼喂肉雞，可以減少抗菌藥使用，改善料肉比，提高出欄只重[11]。但是關于臭氧在養(yǎng)殖行業(yè)水線處理方面的研究較少，本試驗旨在通過研究臭氧對養(yǎng)殖水線中細菌及抗菌藥的清除效果，為養(yǎng)殖行業(yè)的水線消毒處理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 平板計數(shù)培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術股份有限公司；大腸桿菌標準菌株由新希望六和動保中心提供。

1.2 主要儀器 臭氧沖洗消毒機，購自山東舍拜恩環(huán)?？萍加邢薰?；超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；全溫振蕩搖床，購自常州市國旺儀器制造有限公司；質(zhì)譜儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 試驗處理

1.3.1 臭氧殺菌效果—實驗室部分 為探究臭氧的殺菌消毒作用，挑選大腸桿菌標準菌株進行復蘇，然后挑取單個菌落培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液加入200 mL的營養(yǎng)肉湯搖4～6 h，用分光光度計測定菌液濃度后，將菌液進行10倍倍比稀釋至107、106、105、104、103CFU/mL，分別制備5 L菌液，組別為D1～D5。按照廠家說明書將D1～D5組的5 L菌液分別通入到臭氧消毒機5 min進行殺菌處理，處理后對應組別為D1-1～D5-1。對處理前后的菌液使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，對比細菌生長情況。

1.3.2 臭氧殺菌效果—鴨場試驗部分 選取同一棟處于空舍期的多層立體網(wǎng)養(yǎng)鴨舍(80 m×15 m)，配有乳頭式飲水系統(tǒng)。隨機選取12條水線，其中6條作為臭氧沖洗試驗組(Ozone disinfection，OZD)，使用臭氧沖洗消毒機進行沖洗消毒;另外6條作為對照組(Control，CON)，使用高壓沖洗法進行水線清洗。在沖洗前，分別使用15 mL滅菌離心管，采集水源樣品3個、水線末端的樣品6個，臭氧沖洗消毒2、5 min和8 min后，每個時間點分別采集水線末端樣品6個，對照組在同一時間點采集水線末端樣品6個。

觀察臭氧沖洗消毒前后水線中水質(zhì)渾濁程度變化；對試驗組和對照組的沖洗前后水樣進行細菌含量檢測，不同沖洗時間段的水樣進行抗菌藥含量檢測。

1.4 檢測指標 參照 GB/T 5750.2—2006《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集與保存》，用滅菌離心管采集鴨場水源和水線水的樣品，采集后4 ℃保存，送實驗室進行細菌和抗菌藥含量檢測。

細菌檢測指標包括：菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。參照GB/T 5750.12—2006《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》，分別使用平板計數(shù)培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基進行檢驗；判別標準參照GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》，結(jié)合實驗室內(nèi)部檢測標準：菌落總數(shù)<100 CFU/mL判定為合格，100～1 000 CFU/mL為警告，>1 000 CFU/mL為超標；大腸菌群不得檢出。

抗菌藥指標包括：多西環(huán)素、氟苯尼考、痢菌凈、喹氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水樣中抗菌藥含量，所用儀器為Exactive 組合型四極桿 Orbitrap 質(zhì)譜儀。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用獨立樣本t檢驗及配對樣本t檢驗，而不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗：Mann-Whitney U檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臭氧殺菌效果—實驗室部分 從表1和圖1可以看出，消毒處理前培養(yǎng)基上均有大腸桿菌生長，菌液濃度越高，細菌生長越多；而臭氧試驗組D1-1(處理前大腸桿菌的菌液濃度為107CFU/mL)，細菌生長較多，其菌落計數(shù)超過1 000 CFU/mL，消毒后依然處于嚴重污染狀態(tài)；D2-1、D3-1、D4-1、D5-1只有零星大腸桿菌生長，其數(shù)量不超過2 CFU/mL。因此，大腸桿菌的菌液濃度低于106CFU/mL時，臭氧的殺菌作用良好。

表1 大腸桿菌菌液在臭氧消毒前后的菌落計數(shù)情況Table 1 Escherichia coli colony counts before and after ozone disinfection (CFU/mL)

圖1 大腸桿菌菌液在臭氧消毒前后的細菌生長情況Fig.1 Escherichia coli growth before and after ozone disinfectionD1～D5：處理前，其菌液濃度分別為107、106、105、104、103 CFU/mL; D1-1～D5-1：臭氧處理組，與D1～D5相對應D1-D5:The untreated group，the concentration was 107,106,105,104,103 CFU/mL; D1-1-D5-1:Ozone disinfection group，corresponding to D1-D5

2.2 臭氧沖洗水線后水質(zhì)眼觀變化 從圖2可以看出，最初進行水線沖洗時，水質(zhì)十分渾濁，含有大量的污染物，伴隨著沖洗時間的延長，水中的絮狀雜質(zhì)逐漸減少，水質(zhì)由渾濁逐漸變?yōu)榍宄骸?/p>

圖2 水線經(jīng)過臭氧沖洗后水質(zhì)的眼觀變化Fig.2 Visual changes of water quality after ozone disinfection從左向右:分別為沖洗前、沖洗2、5 min和8 minFrom left to right: Before washing,after washing for 2,5 min and 8 min

2.3 臭氧沖洗消毒后水線中細菌含量變化 從表2可看出，水源水中菌落總數(shù)合格(<100 CFU /mL)，而大腸菌群數(shù)超標；水線沖洗前菌落總數(shù)嚴重超標(>1 000 CFU/mL)，大腸菌群數(shù)也超標。臭氧沖洗消毒后，與沖洗前比較，試驗組水線的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)均顯著降低(P<0.05)，并且菌落總數(shù)降低了42倍，水線菌落總數(shù)從嚴重超標降低到警告水平。而對照組進行高壓沖洗后，與沖洗之前比較，水線的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)雖顯著降低(P<0.05)， 但其數(shù)值依然處于超標水平，尤其是菌落總數(shù)嚴重超標。沖洗結(jié)束后，試驗組菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 水線沖洗前后細菌含量變化情況Table 2 Changes of bacterial content in waterline before and after flushing (CFU/mL)

2.4 臭氧沖洗消毒前后水線中抗菌藥含量變化 從表3可以看出，水源水中無抗菌藥殘留，但是水線在沖洗前，除了無痢菌凈殘留之外，其他抗菌藥均有殘留，并且多西環(huán)素的殘留量高達21.8 μg/L和22.47 μg/L。沖洗2 min后，試驗組氟苯尼考含量較沖洗前顯著降低(P<0.05)；8 min后，試驗組多西環(huán)素、喹氟沙星和恩諾沙星含量較沖洗前顯著降低(P<0.05)，并且所測的抗菌藥均未檢出，臭氧沖洗對抗菌藥的清除效果為100%。而對照組進行高壓沖洗8 min后，其水線中的抗菌藥較沖洗前也存在降低現(xiàn)象，尤其是多西環(huán)素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星的含量顯著降低(P<0.05)，其抗菌藥的清除效率為69.63%～88.92%，沖洗8 min后并不能完全清除水線中的抗菌藥。與對照組相比，沖洗8 min后，試驗組水線中抗菌藥的含量顯著降低(P<0.05)，臭氧沖洗對抗菌藥的清除效果顯著優(yōu)于高壓沖洗。

表3 水線沖洗前后抗菌藥含量變化情況Table 3 Changes of antibiotic content in waterline before and after flushing (μg/L)

3 討論

家禽飼養(yǎng)過程中水質(zhì)安全問題一直易被忽略，并且常規(guī)的水線消毒處理方式并不是很理想，本試驗從實驗室角度和肉鴨養(yǎng)殖使用場角度說明了臭氧對水處理的良好效果，通過對水線進行臭氧沖洗消毒，不僅能夠有效緩解水線中細菌污染情況，而且能夠完全清除水線中的抗菌藥殘留，是目前水線消毒處理的新型有效方法。

在對肉鴨場的水線進行臭氧沖洗消毒過程中，本試驗發(fā)現(xiàn)鴨舍內(nèi)水線的細菌污染程度很高，眼觀水質(zhì)渾濁程度的變化也說明了水線污染嚴重(圖2)。本試驗與袁東方等[3]、吳艷萍等[4]在商品雞場水質(zhì)的研究結(jié)果一致，說明養(yǎng)殖場的水質(zhì)需要引起關注。這主要由于禽舍中的水線很容易形成生物膜，而在養(yǎng)殖過程中添加營養(yǎng)藥、添加劑和抗菌藥等，會促使生物膜的形成，從而導致水線中的細菌進一步滋生[12]，其中以大腸桿菌為主[13]。此外,生物膜的形成會降低藥物、疫苗接種的有效性，這提示養(yǎng)殖人員應定期對飲水系統(tǒng)進行清洗和消毒。本試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高壓沖洗后，水線中的細菌總數(shù)含量顯著降低，消除效率達到84.62%，只是依然處于超標的水平。而水線經(jīng)過臭氧消毒后，水線中的細菌含量顯著降低，從超標降低至警告水平，消除效率達97.70%，說明臭氧能有效殺滅水線中的細菌。臭氧消毒過程中水質(zhì)由渾濁變?yōu)榍宄?，也證實了臭氧沖洗消毒能夠有效去除生物膜。但是消毒結(jié)束后，水線中的水依然處于不合格狀態(tài)，可能因為所選用的鴨場水線消毒管理不到位，細菌含量過高，同時水線長度較長，短時間內(nèi)不能將細菌有效清除，可以通過延長沖洗消毒時間，多次沖洗直至水線中細菌含量合格為止。

近幾年，公眾對食品安全的關注度愈加上升，而水線中的抗菌藥殘留成為了食品安全的威脅之一。本試驗發(fā)現(xiàn)，水線中常用抗菌藥存在不同程度的殘留，尤其是多西環(huán)素殘留量最大，抗菌藥在水線中的殘留與Harn等的研究結(jié)果一致[6]。水線中多西環(huán)素含量為44.17 μg/L時，使用臭氧沖洗消毒水線8 min左右，水線中抗菌藥殘留清除率達到100%。這主要是由于臭氧沖洗消毒機能夠產(chǎn)生臭氧，采用脈沖式的沖洗方式，一方面能將附著在水線生物膜上的抗菌藥沉積物沖出水線，另一方面能夠通過直接氧化和自由基間接氧化反應與抗菌藥分子進行作用，將其分解轉(zhuǎn)化[9-10]，因此，臭氧能夠?qū)⑺€中的抗菌藥殘留有效消除。臭氧沖洗消毒降低了食品中多西環(huán)素、氟苯尼考、喹氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的藥殘風險，為食品安全提供了有效保障。

養(yǎng)殖場的水質(zhì)細菌污染嚴重，需要持續(xù)關注。定期進行高壓沖洗，也能對水線達到一定的清理效果，但是細菌含量仍然很高，還需要對水線進行消毒。而臭氧沖洗消毒不僅能夠從實驗室角度實現(xiàn)良好的滅菌效果，而且在養(yǎng)殖場實際應用過程中殺菌效果好，且能夠有效清除水線中的抗菌藥殘留，操作簡單、方便，可以考慮作為養(yǎng)殖場水線清洗消毒的常規(guī)方法。