基于BSA-Seq技術(shù)的甜瓜抗霜霉病InDel標記開發(fā)

凌悅銘，李寐華，楊 永，楊文莉，范 蓉，伊鴻平，張 紅，張學(xué)軍

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL., 2n= 2x= 24)是國內(nèi)外重要的園藝作物和經(jīng)濟作物，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)統(tǒng)計(http://www.fao.org/faostat/ zh/#data/QC)，2015～2019年，我國的甜瓜種植面積從35.09×104hm2增加到38.37×104hm2，占全球甜瓜種植面積的36.91 %。甜瓜具有栽培周期短、市場需求量大、經(jīng)濟效益好、土地利用率和復(fù)種指數(shù)高等優(yōu)點[1]?！厩叭搜芯窟M展】甜瓜霜霉病是一種由古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.&Curt.)Rostov.]引起的真菌性病害，主要危害甜瓜葉片，發(fā)病初期在葉片上形成水浸狀小斑點，病斑擴展后，受葉脈限制呈黃褐色角斑，病斑背面伴有灰黑色霉層產(chǎn)生，最后葉片大面積發(fā)黃甚至枯焦。該病原菌孢子可隨氣流遠距離傳播，寄主范圍非常廣泛、容易迅速對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性、流行性強、防治難[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上有17 %殺菌劑用于霜霉病的防治[3]。P.cubensis引起的作物經(jīng)濟損失在歐洲、中東和亞洲等許多地區(qū)都有報道[4]。甜瓜霜霉病流行年份可使甜瓜減產(chǎn)30 %～50 %，嚴重70 %～80 %，甚至絕產(chǎn)[5]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，下一代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)為挖掘功能標記或目標性狀連鎖標記及基因快速定位提供了一個新的有效手段。基于全基因組測序的集團分離分析法(Bulked segregant analysis, BSA)在不構(gòu)建遺傳圖譜的情況下能高效快速地挖掘目的基因。BSA- Seq技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在大田和蔬菜作物研究中，已經(jīng)成功定位出水稻耐鹽[6]、水稻稻瘟病[7]、黃瓜早花[8]、番茄果實重量[9]、大豆疫霉病[10]等基因?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于BSA- Seq技術(shù)能高效快速地挖掘目的基因，研究擬通過BSA- Seq技術(shù)定位甜瓜抗霜霉病基因，開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標記或功能標記，以期在甜瓜苗期對育種材料進行分子輔助選擇，提高篩選效率，加快育種進程，解決甜瓜霜霉病危害問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以野生高抗霜霉病資源DM-4和新疆感病自交系DM-2為親本，構(gòu)建F2抗病性分離群體，對抗、感親本和2個極端表型子代混合池進行全基因組測序分析，利用SNP(單核苷酸多態(tài)性，Single nucleotide polymorphism)頻率差異分析方法對抗霜霉病性狀標記進行QTL(數(shù)量性狀基因座，Quantitative trait locus)定位并關(guān)聯(lián)候選區(qū)間，開發(fā)與目標性狀緊密連鎖的分子標記，應(yīng)用于甜瓜抗病分子育種，也為精細定位甜瓜抗霜霉病基因及研究甜瓜抗霜霉病的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2019～2021年在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心海南三亞育苗大棚進行?？乖碊M-4(P1)，引自美國農(nóng)業(yè)部國家植物種質(zhì)資源體系，現(xiàn)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜中心保存，高抗霜霉病，綠皮帶墨綠斑、圓球型、軟肉、網(wǎng)紋稀不全、品質(zhì)差；感病自交系DM-2(P2)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供，高感霜霉病、黃皮、脆肉、網(wǎng)紋粗密、風(fēng)味好、口感佳。P1×P2雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得1 000個F2單株。從中挑選50個抗病單株和50個感病單株構(gòu)建極端抗、感基因池，用于霜霉病抗性基因定位。

古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.&Curt.)Rostov.]采自海南三亞地區(qū)早期自然發(fā)病的甜瓜葉片，單孢子分離后擴繁備用。

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜霜霉病抗性的苗期人工接種鑒定

甜瓜霜霉病抗性鑒定材料包括F2群體單株及其雙親，其中雙親P1和P2各30株，F(xiàn)2群體單株1000株，于2019年10月鑒定。鑒定前將種子于68 ℃高溫殺菌后再播入裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，基質(zhì)由椰糠、有機肥和黃沙按體積8：1：1比例混合均勻而成，基質(zhì)和營養(yǎng)缽都經(jīng)熏蒸滅菌殺毒。

接種方法采用噴霧法[11]進行接種，接種濃度為5×103/mL個孢子，接種時期在甜瓜苗期第2片真葉完全展開時，16：00以后進行噴霧接種，用微型噴霧器將配制好的孢子懸浮液均勻噴于植株葉片正反面上，直到流水為止，接種后黑暗保濕24 h(相對濕度為80%～90 %)，之后正常管理，夜間保濕，溫度控制在25～30 ℃。接種后15 d調(diào)查發(fā)病情況。參照Criswell(2008)[12]和Epinat C[13，14]的抗性分級標準，并適當(dāng)修正，將病情分為6個級別：0級：無任何癥狀；1級：病斑面積占整個葉片面積的1/10以下；2級：病斑面積占整個葉片面積的1/10～1/4；3級：病斑面積占整個葉片面積的1/4～2/4；4級：病斑面積占整個葉片面積的2/4～3/4；5級：病斑面積占整個葉片面積的3/4以上或者葉片干枯。病情指數(shù)(DI)計算方法：DI=∑(每個病級的植株數(shù)×級別數(shù))/(總植株數(shù)×最高級別數(shù))×100。抗性分級標準：高抗(HR)：0<病情指數(shù)≤10；抗病(R)：10<病情指數(shù)≤20；中抗(MR)：20<病情指數(shù)≤40；感病(S)：40<病情指數(shù)≤60；中感(MS)：60<病情指數(shù)≤80；高感(HS)：病情指數(shù)>80。

1.2.2 基因組DNA提取及測序分析

在F2群體中隨機選取50株高抗單株和50株高感單株，分別取其幼嫩葉片0.5～1.0 g于液氮中研磨成粉末狀，裝入2.0 mL的離心管。用PlantZol試劑(北京全式金)提取2個親本和F2群體單株葉片基因組DNA，并用核酸檢測儀進行檢測，統(tǒng)一稀釋至15 ng/L后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將高抗單株和高感單株幼嫩葉各50份DNA分別等量混合，構(gòu)建極端抗、感池。使用 Illumina HiSeq測序平臺，對2個親本和2個子代池分別進行全基因組重測序(委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。參考基因組為甜瓜基因組(http://cucurbitgenomics.org/organism/18)。采用GATK3.3軟件進行SNP及InDel的檢測。

1.2.3 SNP檢測及關(guān)聯(lián)分析

使用bwa軟件[15]將2個親本重測序獲得的有效測序數(shù)據(jù)reads與參考基因組比對。采用GATK3.3軟件的Unified Genotyper模塊進行多個樣本SNP的檢測，使用Variant Filtration進行過濾，過濾參數(shù)為-cluster Window Size 4，-filter Expression "QD < 4.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0 " ，-G_filter "GQ<20"。基于基因分型的結(jié)果，篩選親本中純和的SNP位點，以親本DM-2為參考親本，分析計算2個子代池在親本間標記位點的SNP的頻率(SNP-index)。其中，完全與其相同的SNP-index為0；完全與其不同的SNP-index為1。為減少測序錯誤和比對錯誤造成的影響，對計算出SNP-index后的親本多態(tài)性位點進行過濾，過濾標準如下：(1)過濾掉兩個子代中SNP-index 都小于0.3并且SNP深度都小于7的位點；(2)過濾掉一個子代SNP-index缺失的位點。計算(SNP-index)，即兩個子代SNP-index作差：(SNP- index)= SNP-index(極端性狀B)- SNP-index(極端性狀A(yù))。進行1000次置換檢驗，選取95 %和99 %置信水平作為篩選的閾值。結(jié)合抗、感池SNP-indexes的信息，針對基因組位置繪制(SNP-index)圖，分析獲得候選區(qū)間。

1.2.4 InDel標記開發(fā)及有效性檢測

采用GATK3.3軟件的Unified Genotyper模塊進行InDel的檢測，使用Variant Filtration進行過濾，過濾參數(shù)為-filter Expression "QD < 4.0 || FS > 200.0"。在上述獲得的候選區(qū)間內(nèi)篩選插入或缺失片段大于4 bp的InDel位點，根據(jù)親本的InDel信息，截取包含InDel位點上下游各100 bp的序列，并根據(jù)上下游序列設(shè)計引物，Tm為(58±3)℃，引物長度為(20±5)bp，PCR產(chǎn)物大小為200～350 bp，引物由上海生工生物科技有限責(zé)任公司合成。設(shè)計好的InDel引物在 2個親本基因組DNA中進行多態(tài)性篩選，用具有多態(tài)性擴增的InDel引物在 F2群體上進行檢測。

PCR反應(yīng)總體系為：1 μL上下游引物(10 μmol/L)、1 μL DNA模板、5 μL 2×TaqMaster Mix，ddH2O補足至10 μL。PCR反應(yīng)程序為：PCR 程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜霜霉病的苗期抗性鑒定

研究表明，2019年10月，抗源DM-4病情指數(shù)為0，近似免疫；DM-2表現(xiàn)為高感，病情指數(shù)為90.00；對 F2群體病情級別繪制頻數(shù)分布圖，群體的病情級別分布圖呈現(xiàn)正態(tài)分布。圖1

圖1 病情級別在F2群體的頻率分布Fig.1 Frequency distnbution of diseaseseverity in F2 population

2.2 測序數(shù)據(jù)

研究表明，對從F2選擇50株高抗單株和50株高感單株分別構(gòu)建高抗池和高感池，與2個親本通過Illumina HiSeq重測序，過濾后得到的堿基數(shù)目為30.276 G，測序質(zhì)量高(Q20≥97.74 %、Q30≥94.94 %)，GC含量在37.12%～37.39 %，樣本與參考基因組比對效率在92.28 %～93.4 %之間，平均覆蓋深度為11.57～21.29X，1X覆蓋度(至少有1個堿基的覆蓋)為96.37%。所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序質(zhì)量合格，GC分布正常，建庫測序成功，與甜瓜參考基因組比對效率較高，可用于后續(xù)變異檢測及目標性狀的基因定位。表1，2

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Table 1 The quality of sequencing data

表2 測序深度及覆蓋度統(tǒng)計Table 2 Sequencing depth and coverage

2.3 關(guān)聯(lián)分析

研究表明，抗、感池之間存在117×104個不同SNPs。進一步過濾SNP，得到高質(zhì)量可信SNP位點95 886個。采用SNP-index算法對這些高質(zhì)量SNP進行關(guān)聯(lián)，繪制2個子代池的( SNP-Index)的分布如圖，甜瓜9號染色體21～24 Mb、10號染色體5～6 Mb、7～11 Mb、12～13 Mb和12號染色體21～23 Mb基因組位置的區(qū)域(SNP-Index)超過0.95和0.99置信度，是抗霜霉病基因的候選區(qū)間。其中，在9號染色體上關(guān)聯(lián)到的區(qū)域(SNP-Index)值置信度達0.99，是甜瓜抗霜霉病主效QTL。圖2

注：橙色曲線代表置信度為0.95的閾值線，綠色曲線代表置信度為0.99的閾值線

2.4 與甜瓜抗霜霉病基因連鎖InDel標記的開發(fā)及篩選

研究表明，在9號染色體候選區(qū)域內(nèi)共檢測到2 882個InDel位點。以50 kb為步移區(qū)段，尋找附近堿基缺失4 bp以上的InDel位點，合成37對InDel引物。以高抗霜霉病資源DM-4和感病自交系DM-2的基因組DNA為模板，對37對引物的多態(tài)性進行PCR篩選。37對引物均能擴增出與預(yù)測大小一致的目標條帶，其中9對引物具有多態(tài)性，多態(tài)率為32.14 %。圖2，表3

注：M：Marker I；P1：以高抗霜霉病資源DM-4的DNA為模板進行PCR擴增；P2：以感病自交系DM-2的DNA為模板進行PCR擴增

名稱Name正向引物序列5’- 3’Forward primers sequence 5’ - 3’反向引物5’- 3’Reverse primers sequence 5’ - 3’是否具有多態(tài)性Polymorphism or notInDel 1AGGTAAAGCCCCAGAGAGGACCTCCCGTGAAGTTTGGAGT否InDel 2AGTGAATGTGGTCATTGTGCTCCTCCCGTGAAGTTTGGAGT是InDel 3ACACAGCACAACCCAGACAACTACGACCAACCCCCACATG是InDel 4GCACTCTCCAGCCTTGAACTGAGCAAAGGTACCGCTGTCT是InDel 5TTTTCATTCGGATTCCTTGTTGTAAGCTATGAGACCTACGCGC否InDel 6TCAAAGTGACCCCATCCAGTGTGTTTTGAGTTCAACGGGGGA否InDel 7GTGACCCACGATAGGTACACCTCAAGTTTGGGAGATTGGATCA否InDel 8AGCATTCTCCCAGTTTCCCCTGGGAACAAGAAAGTCAGGCA否InDel 9ACACAATGAACCAAGATATTTGCCATGTTTGTAAGCCACTCGACT是InDel 10ACGACACTAAATGACAGTCCGTCCAAAATGGAAACCCATGCCC否InDel 11GCAAAGTTGACCCTCTGTTCGCAGCGTTCTAGGGGTTGGTT否InDel 12TGTGAGAATGACAGCCCACACACATCTCTCAAGAGGCGGA否InDel 13CCTCGCTCTATTTGCATTCACATTTATACGCGTACTAGTTCTCTCA否InDel 14AAAGTCAGGATGGCCGAGTGTCTCTTTCATCAGCGGCGTT是InDel 15TCACAGCTCACAATCACAGGTAGGGGAAGCTGGAGAAGACA是InDel 16ACCTGCCGTCTATCGTGTTTTGAGGTCGGTCCAAACAAGT否InDel 17GCTGCCGTTTCGTTTTCAGTACGACCAAGAAACCCAGGAA否InDel 18CCGTTGATTGCGCTAACACATGCCGCACGAGTATTCACTT是InDel 19AGGAGTTTGGGTATGACACGACTTCTCCCTTTACCCGTTGCC是InDel 20TGGGGTTGCTTGTGGATAGTAGGCGAACACCTTTTGATTCA是InDel 21GGAAGAGGAAGAGGCAGAGGACGAATCATTTCCTCCTCCGA否InDel 22TGCTCTTGAGGCTAGGGCTATAGAGAGGTCCGAGCCCATC否InDel 23TCATTGGCTAGAACTTCGACCACGAAAGTGATGGCCATGGGA否InDel 24AGTGGTTGGTGGTGCATAGGGCAACACTTTGATCCCCACA否InDel 25ACCTCCAAGAAATGAATTCAGGATGAACGACGACGACCAATCT否InDel 26CTTGCAAGGGCTAATGGTGCACGAATCAAAGGTGTAGCCA否InDel 27ACAGTTTAGCTTCCATCCCTACATCGTTTAGGTCATTGTCCTCCA否

續(xù)表3 InDel引物序列信息Table 3 The information of InDel primers

2.5 InDel標記在F2分離群體中的鑒定

研究表明，利用抗病親本DM-4、感病親本DM-2以及F2群體中隨機選取的5株極端抗病和5株極端感病單株DNA作為模板，聚丙烯酰胺電泳反復(fù)試驗驗證這9對引物的多態(tài)性。引物InDel 15和InDel 20在F2群體中隨機選擇的5個極端抗病單株和5個極端感病單株之間多態(tài)性高、條帶清晰、擴增條帶重演性好。進一步利用引物InDel 15和InDel 20在F2分離群體的100個單株中進行PCR鑒定，引物InDel 15在50個極端抗病單株中，有46個單株的基因型檢測結(jié)果為抗病親本帶型，條帶大小為251 bp；在50個極端感病單株中，有49個單株基因型鑒定結(jié)果為感病親本帶型，條帶大小為349 bp。引物InDel 20在50個極端抗病單株中，49個單株的基因型檢測結(jié)果為抗病親本帶型，條帶大小為231 bp；在50個極端感病單株中，有49個單株基因型鑒定結(jié)果為感病親本帶型，條帶大小為324 bp。該兩個InDel標記條帶能區(qū)分出F2群體中極端抗、感單株，并且和親本帶型高度一致，其中引物InDel 15準確率為95 %，InDel 20準確率為98 %。圖4

注：圖2A為InDel 15引物擴增結(jié)果，其中11：抗霜霉病親本DM-4，12：感霜霉病親本DM-2，1～5：抗病單株，6～10：感病單株；圖2B為InDel 20引物擴增結(jié)果，其中2：抗霜霉病親本DM-4，1：感霜霉病親本DM-2，3～7：抗病單株，8～12：感病單株；M均為：DL2000 DNA Marker

3 討 論

世界上對甜瓜霜霉病抗性研究較早，與其他葫蘆科作物相比，已經(jīng)在甜瓜上報道了抗霜霉病材料[16]。Ivanoff[17]報道了4個高抗霜霉病的栽培品種。隨后相繼發(fā)現(xiàn)許多對霜霉病有較好抗性的甜瓜材料。研究選用的母本材料DM-4為野生高抗霜霉病資源，當(dāng)受到霜霉病病原菌侵染時，侵染點附近會產(chǎn)生胼胝質(zhì)，阻止菌絲的延伸，抑制病原菌的生長，這與文獻[18]選用的高抗品種抗病表現(xiàn)一致。

目前已有學(xué)者進行了霜霉病抗性基因染色體定位，并開發(fā)出多個與霜霉病抗性相關(guān)的分子標記。楊柳燕等[19]以高抗品種DM3和高感品種DF4為材料，獲得了與抗霜霉病基因連鎖的SRAP標記me8em11，連鎖距離為9.8 cM；賀玉花等[20]以抗病品種PI 414723為研究材料，發(fā)現(xiàn)了3個與抗霜霉病基因Pc-3連鎖的SSR標記DE1887、DE1320和DE0854，遺傳距離分別為26、26和13.69 cM。張學(xué)軍等[21]結(jié)合SSR技術(shù)和QTL分析，檢測到3個霜霉病抗性基因的QTL位點：qR1-1-1、qR2-2-1、qR1-3-1，分別位于chr-5、chr-9和chr-10染色體上。研究利用BSA- seq方法，檢測到高抗野生資源DM-4的抗霜霉病位點定位在9號染色體上，這與張學(xué)軍等[22]研究結(jié)果一致。同時，在10號染色體和12號染色體上也關(guān)聯(lián)到候選區(qū)間，該區(qū)域(SNP-Index)值置信度為0.95。

InDel分子標記是不同個體間基因組同一位點的序列發(fā)生堿基的插入或缺失現(xiàn)象，具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易等優(yōu)點[23]，在甜瓜果斑病[24]、蔓枯病[25]和白粉病[26]抗性鑒定中已有研究，但是利用InDel標記鑒定甜瓜霜霉病抗性的研究還沒有相關(guān)報道。因此，開發(fā)甜瓜InDel標記對于準確鑒定甜瓜霜霉病抗性、快速培育抗病種質(zhì)和品種具有重要意義。研究利用BSA-seq技術(shù)，在抗霜霉病候選區(qū)間內(nèi)InDel位點設(shè)計37對InDel引物，9對引物具有多態(tài)性，其中引物InDel 15和InDel 20特異性好且條帶清晰，檢測F2群體單株時，擴增產(chǎn)物帶型在抗病單株和感病單株之間的差異效果明顯、穩(wěn)定且準確率高，分別為95 %和98 %，可以用于甜瓜霜霉病抗性鑒定及分子標記輔助選擇。同時，研究開發(fā)的與抗霜霉病基因連鎖的InDel分子標記，縮小了抗霜霉病基因候選區(qū)間。今后將在此基礎(chǔ)上進一步結(jié)合F2:3家系的基因型和表型進行精細定位，克隆抗霜霉病基因并探索在抗霜霉病功能基因上直接開發(fā)分子標記，這些共分離的功能標記可直接在苗期進行霜霉病抗性鑒定。

4 結(jié) 論

將甜瓜抗霜霉病QTL定位在9號染色體21～24 Mb，10號染色體5～6 Mb、7～11 Mb、12～13 Mb和12號染色體21～23 Mb候選區(qū)間。在9號染色體上關(guān)聯(lián)到的區(qū)域(SNP-Index)值置信度達0.99，為主效QTL，并在此區(qū)域開發(fā)了InDel 15和InDel 20連鎖標記，準確率分別為95%和98%。