薏苡仁多菌發(fā)酵液的菌種優(yōu)選及其抑制黑色素生成的作用研究

毛新亮，張卉，陳文杰，陳艷武，任紅紅，余桂媛，黃亞東，項(xiàng)琪，李曉敏*

1.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528451；

2.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528451

3.廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心有限公司，廣州 510000；

薏苡仁（Semen coicis）又稱薏米，是干燥成熟的薏苡種子，有“禾本科植物之王”稱譽(yù)。薏苡仁營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量約12%～17%，包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白等［1］，油脂約6%，包括棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸等［2］，碳水化合物達(dá)60%～70%。此外，還含有豐富的薏苡仁酯、薏苡仁素、薏苡仁多糖A/B/C、甾醇類、多酚及三萜化合物等活性物質(zhì)［3-5］。作為一種藥食兼用型資源，薏苡仁既是一種傳統(tǒng)食物，又可作為傳統(tǒng)中藥材應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。現(xiàn)代藥理研究表明，薏苡仁具有廣泛的抗炎、抗氧化、解毒、除濕、鎮(zhèn)痛、抗癌和抗腫瘤作用［6-7］。

乳酸菌發(fā)酵是指以乳酸菌為發(fā)酵菌株，以具有活性成分的植物原料為發(fā)酵基質(zhì)，在雙向發(fā)酵過程中，發(fā)酵基質(zhì)為乳酸菌生長提供所需營養(yǎng)，而乳酸菌對發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行分解與再合成，從而產(chǎn)生新的功效成分，提高發(fā)酵產(chǎn)物活性［8-9］。谷物營養(yǎng)物質(zhì)豐富，尤其是蛋白質(zhì)和碳水化合物含量高，可為乳酸菌的生長提供充足且天然的養(yǎng)分資源。乳酸菌發(fā)酵谷物不僅有利于發(fā)酵液中功能性物質(zhì)的增加和生物活性的增強(qiáng)，也有利于消除谷物抗?fàn)I養(yǎng)因子的阻礙作用，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化與釋放［10-11］。大部分乳酸菌作為益生菌被普遍用于發(fā)酵領(lǐng)域，其中乳酸乳球菌憑借其自身的代謝特點(diǎn)被用作基因工程工具，在生物工程領(lǐng)域極具開發(fā)優(yōu)勢［12］。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌則基于兩者間的互利共生關(guān)系成為乳酸制品生產(chǎn)過程中廣泛使用的發(fā)酵劑組合［13-14］。目前，國內(nèi)薏苡仁產(chǎn)品開發(fā)相對不足，特別是高附加值的產(chǎn)品基本掌握在外資企業(yè)手中。本研究以藥食同源的薏苡仁為發(fā)酵基質(zhì)，采用乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌進(jìn)行單菌和復(fù)合多菌發(fā)酵，分析比較不同乳酸菌發(fā)酵對薏苡仁發(fā)酵液主要成分和體外活性變化的影響，并以斑馬魚為模型探討發(fā)酵液對黑色素生成的抑制作用。此工藝創(chuàng)新獲得的產(chǎn)品有望開發(fā)為新的具美白肌膚性能的功能性原料，對創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)發(fā)展模式，促進(jìn)薏苡產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級，增加企業(yè)效益，推動(dòng)薏苡仁高值產(chǎn)品走出國門具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料薏苡仁來源于山東棗莊滕州市大塢鎮(zhèn)；嗜熱鏈球菌菌粉和保加利亞乳桿菌菌粉均購自山東中科嘉億生物工程有限公司；乳酸乳球菌來自廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心；AB系斑馬魚來自廣州魯比生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與儀器MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；α-淀粉酶、糖化酶、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、左旋多巴、曲酸、羥基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司；蘑菇酪氨酸購自Sigma公司；Spark多功能酶標(biāo)儀TECAN、LC-2040C高效液相色譜儀購自日本島津公司；HH600電熱恒溫水浴槽購自上海道墟茂祥儀器設(shè)備廠；LRH-150型生化培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Z-A-D5五層單排獨(dú)立養(yǎng)殖單元購自上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SZ680連續(xù)變倍體式顯微鏡購自重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 薏苡仁發(fā)酵液制備薏苡仁粉與水按質(zhì)量比1∶10復(fù)合并加入0.2%的無水氯化鈣后糊化1 h，降溫至75～80℃加入α-淀粉酶（酶用量為20 U·g-1薏苡仁粉）液化2 h，降溫至60℃后調(diào)節(jié)液化液pH至4.0～4.2，加入糖化酶（酶用量為300 U·g-1薏苡仁粉）于60℃恒溫條件下糖化2 h，調(diào)節(jié)糖化液pH至6.0，117℃高溫高壓滅菌20 min，冷卻至室溫完成薏苡仁發(fā)酵基質(zhì)的制備。

乳酸乳球菌發(fā)酵液（記為L.l）制備：發(fā)酵基質(zhì)中加入1.0%在MRS培養(yǎng)基中活化至OD600=1.0的乳酸乳球菌菌液，37℃恒溫發(fā)酵48 h。

嗜熱鏈球菌發(fā)酵液（記為S.t）制備：發(fā)酵基質(zhì)中加入0.13%嗜熱鏈球菌菌粉后于37℃恒溫發(fā)酵48 h。

保加利亞乳桿菌發(fā)酵液（記為L.b）制備：發(fā)酵基質(zhì)中加入0.13%保加利亞乳桿菌菌粉并于37℃恒溫發(fā)酵48 h。

復(fù)合乳酸菌發(fā)酵液（記為L.l+S.t+L.b）制備：發(fā)酵基質(zhì)中同時(shí)加入0.13%嗜熱鏈球菌菌粉、0.13%保加利亞乳桿菌菌粉和1.0%在MRS培養(yǎng)基中活化至OD600=1.0的乳酸乳球菌菌液，37℃恒溫發(fā)酵48 h。

1.2.2 總還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法［15］測定發(fā)酵液中總還原糖含量：取100倍稀釋后發(fā)酵液1 mL，加入0.75 mL DNS試劑，沸水浴5 min，取出冷卻后定容至7 mL，520 nm處測吸光度值。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制質(zhì)量濃度—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線得出式（1）。

1.2.3 總酸含量測定總酸按照Avdeef等［16］的方法測定。取5 mL發(fā)酵液并用超純水定容至25 mL，用0.1 mol·L-1的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液將pH定至8.2，總酸含量計(jì)算方法如公式（2）。

其中X為總酸含量（g·L-1）；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mol·L-1）；V1為滴定樣液時(shí)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL）；V2為空白所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL）；K為換算系數(shù)（以乳酸為主，0.090）；F為樣液的稀釋倍數(shù)；m為樣液的質(zhì)量（g）。

1.2.4 乳酸含量測定有機(jī)酸的檢測參考鄭梅等［17］的操作方法。采用高效液相色譜儀（LC-2040C）搭 配CAPCELL PAK ADME C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流動(dòng)相A為0.1 mol·L-1磷酸氫二銨溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0），流動(dòng)相B為甲醇，紫外檢測波長為214 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5μL。標(biāo)準(zhǔn)品為L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.5 總酚含量測定總酚含量的測定參考Folin-Ciocalteu法［18-19］并修改如下：取發(fā)酵液0.5 mL，以水為空白對照，加入2.5 mL福林酚試劑搖勻，靜置5 min后加入2 mL 7.5%Na2CO3溶液，室溫下放置60 min，在765 nm處測吸光度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制質(zhì)量濃度—吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出式（3）。

1.2.6 總游離氨基酸含量測定總游離氨基酸含量測定參考彭真汾等［20］和劉長姣等［21］的方法并作如下修改：取5倍稀釋后發(fā)酵液1 mL，加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液混勻，沸水浴15 min，冷卻后加水定容至7 mL并靜置10 min，在570 min處測吸光值。以L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制質(zhì)量濃度—吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出式（4）。

1.2.7 蛋白含量測定采用G250法測定發(fā)酵液中總蛋白含量：取發(fā)酵液40μL于96孔板中，加入200μL G250反應(yīng)液混勻靜置5 min，在595 nm處測定吸光值。以牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)液繪制質(zhì)量濃度—吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出式（5）。

1.2.8 總活菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法［22］。取發(fā)酵0、8、24、32和48 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵樣品，用0.9%的氯化鈉溶液按10倍梯度稀釋并涂布，選擇菌落數(shù)適宜的平板計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算總菌數(shù)。

1.2.9 菌群結(jié)構(gòu)分析在發(fā)酵0、8、24、32和48 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取發(fā)酵樣凍存，委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行擴(kuò)增子擴(kuò)增及測序。以F338（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和R806（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)［23-24］。PCR產(chǎn)物在Illumina Miseq平臺(tái)上進(jìn)行測序分析。

1.2.1 0羥自由基清除率測定羥自由基清除率測定參考趙淑銳等［25］和李倩茹等［26］的方法并作如下修改：取發(fā)酵液50μL并依次加入9 mmol·L-1FeSO4、9 mmol·L-1乙醇-水楊酸溶液和8 mmol·L-1H2O2各100μL，用超純水定容至1 500μL，37℃水浴15 min，在510 nm處測定吸光值，羥自由基清除率計(jì)算方法如公式（6）。

其中I（%）為DPPH自由基清除率；AX為樣品組吸光值；AX0為對照組吸光值，以超純水代替H2O2；A0為空白組，以超純水代替樣品。

1.2.1 1酪氨酸酶活性抑制率測定酪氨酸酶活性測定方法參考文獻(xiàn)［27-28］并修改如下：取1 mL發(fā)酵液加入0.5 mL酪氨酸酶溶液混勻，37℃水浴10 min，加入1 mg·mL-1左旋多巴2 mL，混勻靜置5 min，在475 nm處測定吸光值。酪氨酸酶活性抑制率計(jì)算方法如公式（7）。

其中I（%）為酪氨酸酶活抑制率；AX為樣品組吸光值，AX0為樣品對照組吸光值，以pH 6.8磷酸緩沖液代替酪氨酸酶溶液；A為空白組吸光值，以pH 6.8磷酸緩沖液代替發(fā)酵液；A0為空白對照組吸光值，以pH 6.8磷酸緩沖液代替發(fā)酵液和酪氨酸酶溶液。

1.2.1 2斑馬魚模型評價(jià)黑色素生成抑制將性成熟雌雄斑馬魚1∶1配對，自然交配產(chǎn)卵，挑選受精后6～8 hpf（hours post-fertilization）健康A(chǔ)B系斑馬魚胚胎隨機(jī)置于96孔細(xì)胞板，1枚·孔-1，30枚·組-1，每孔加入200μL溶液。發(fā)酵液濃度設(shè)為0.5%、1.0%、2.0% 3組，設(shè)陽性對照組為1.0 mg·mL-1熊果苷和空白對照組。置于曲線控制生化培養(yǎng)箱孵育，孵育至72 hpf時(shí)，體式顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎的黑色素沉積情況。孵育至72 hpf時(shí)加入裂解溶液并超聲裂解處理，離心取沉淀并震動(dòng)使離心管中黑色素充分溶解，取100μL置于96孔板中，用酶標(biāo)儀于405 nm波長處測定吸光值。黑色素生成抑制率計(jì)算方法如公式（8）。而離心后的上清置于96孔板中，同時(shí)加入左旋多巴溶液，37℃孵育1 h后在酶標(biāo)儀475 nm波長處測定吸光值。酪氨酸酶活抑制率計(jì)算方法如式（7）。

1.2.1 3數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間兩兩比較采用LSD法，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏苡仁發(fā)酵液主成分變化

不同乳酸菌發(fā)酵薏苡仁前后主要成分變化如表1所示。與發(fā)酵前（N）相比，3種單一乳酸菌及其復(fù)合三菌發(fā)酵液的pH、總蛋白含量、總酸含量、乳酸含量均發(fā)生顯著變化。經(jīng)發(fā)酵后，4組乳酸菌發(fā)酵液的pH均顯著降低，其中L.b組和復(fù)合三菌發(fā)酵液的pH降幅最大，分別由5.82±0.02降至3.25±0.03和3.21±0.01。單一乳酸菌和復(fù)合三菌發(fā)酵液的總蛋白含量均顯著減少，由59.7±0.20 mg·mL-1降至31.63～37.29 mg·mL-1，但各組間無明顯差異。4組發(fā)酵液的總酸和乳酸含量均較發(fā)酵前顯著增加，其中復(fù)合三菌發(fā)酵液總酸和乳酸含量增幅最大，總酸含量由2.84±0.19 mg·mL-1增至30.15±0.76 mg·mL-1，乳酸含量則由0 mg·mL-1增加至6.38±0.14 mg·mL-1；L.b，S.t和L.l發(fā)酵液的總酸和乳酸含量增幅較小。而單一乳酸菌和復(fù)合三菌發(fā)酵對薏苡仁發(fā)酵液的總游離氨基酸含量、還原糖含量和總酚含量均無顯著影響。

表1 不同乳酸菌薏苡仁發(fā)酵液的主成分變化Table 1 Changes of main substances in native and fermented coix seed fermented by different lactic acid bacteria

2.2 不同乳酸菌薏苡仁發(fā)酵液的體外活性

薏苡仁發(fā)酵液對羥自由基清除影響如圖1A所示。實(shí)驗(yàn)條件下，陽性對照組抗壞血酸（0.5 mg·mL-1）對羥自由基的清除率為102.59%±2.45%，發(fā)酵前（N）的薏苡仁基質(zhì)對羥自由基的清除率為29.17%±0.74%。經(jīng)發(fā)酵后，不同乳酸菌薏苡仁發(fā)酵液對羥自由基清除率分別為51.08%±0.64%（L.l組）、49.72%±1.76%（S.t組）、48.98%±0.99%（L.b組）和49.99%±0.61%（L.l+S.t+L.b組），與發(fā)酵前相比均顯著提高（P＜0.05），表明乳酸菌發(fā)酵對薏苡仁發(fā)酵液的抗氧化能力具有增強(qiáng)作用，但不同乳酸菌的薏苡仁發(fā)酵液組間無明顯差異。

圖1 薏苡仁發(fā)酵前后對羥自由基清除率和酪氨酸酶活性抑制的影響Fig.1 Inhibitory effects of native and fermented coix seed on hydroxyl radical scavenging and tyrosinase activity

薏苡仁發(fā)酵液對酪氨酸酶活性抑制的影響如圖1B所示。在實(shí)驗(yàn)條件下，陽性對照組曲酸（0.125 mg·mL-1）對 酪 氨 酸 酶 活 性 抑 制 率 為85.35%±1.35%，對比發(fā)酵前（N）在P＜0.05上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)發(fā)酵后，不同乳酸菌薏苡仁發(fā)酵液對酪氨酸酶活性抑制率分別為43.85%±0.03%（L.l）、52.84%±1.34%（S.t）、64.46%±2.37%（L.b）和87.26±2.37%（L.l+S.t+L.b），與發(fā)酵前相比均顯著提高，其中L.l+S.t+L.b組與陽性對照組效果相當(dāng)，并顯著高于L.l、S.t和L.b組，表明復(fù)合乳酸菌的薏苡仁發(fā)酵液在酪氨酸酶活性抑制方面具有較強(qiáng)的作用。

2.3 薏苡仁發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)分析

通過對比不同乳酸菌對薏苡仁發(fā)酵液的主成分變化和體外活性影響，結(jié)果表明相對單一乳酸菌發(fā)酵而言，3種乳酸菌復(fù)合發(fā)酵更具有優(yōu)勢。復(fù)合菌發(fā)酵過程中，總生物量和菌群結(jié)構(gòu)變化如圖2A所示：總生物量在0～8 h階段呈指數(shù)增長，發(fā)酵液pH在此階段降幅也最大，pH由5.82±0.02降至3.21±0.01；在8～24 h階段，總生物量呈緩慢增加趨勢，發(fā)酵液pH在此階段降幅相應(yīng)減緩；在24～48 h階段，隨著發(fā)酵液總體酸性接近乳酸菌生長下限，菌落生長受阻，總生物量趨于穩(wěn)定，總菌落數(shù)達(dá)8.54［lg（CFU·mL-1）］。

復(fù)合菌發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變化如圖2B所示：發(fā)酵初始（F0樣品），嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌相對豐度相當(dāng)，乳酸乳球菌較前兩者偏低，相對豐度不足20%；發(fā)酵8 h后（F8樣品），乳酸乳球菌占比增加，相對豐度達(dá)40%左右，保加利亞乳桿菌相對豐度降低，約25%；隨著發(fā)酵的推進(jìn)，保加利亞乳桿菌逐漸占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢，在F48樣品中相對豐度達(dá)60%左右，乳酸乳球菌與嗜熱鏈球菌兩者相對豐度則呈降低趨勢，這可能與發(fā)酵后期階段發(fā)酵液總體酸性較強(qiáng)，導(dǎo)致乳酸乳球菌與嗜熱鏈球菌生長受阻，而保加利亞乳桿菌為好酸型菌，因此更偏好酸性環(huán)境有關(guān)［29］。

圖2 發(fā)酵過程總活菌數(shù)量和菌群相對豐度變化Fig.2 Changes in total number of viable bacteria and relative abundance of flora during fermentation

2.4 薏苡仁發(fā)酵液對黑色素生成的抑制作用

薏苡仁發(fā)酵液對斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)的影響如圖3A所示，與空白對照組相比，陽性對照組中1.0 mg·mL-1熊果苷處理后斑馬魚體表黑色素分布減少；不同濃度的發(fā)酵液處理后，斑馬魚體表黑色素分布隨著發(fā)酵液使用濃度的增加而減少。

圖3 薏苡仁發(fā)酵液抑制黑色素生成Fig.3 Inhibition of melanin production by coix seed fermented coix seed

發(fā)酵液對72 hpf時(shí)魚胚黑色素生成的影響如圖3B所示：在實(shí)驗(yàn)條件下，陽性對照組1.0 mg·mL-1熊果苷對魚胚黑色素生成抑制率為25.80%±3.22%，與空白對照相比在P＜0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵液對魚胚黑色素的抑制率隨著使用濃度的增加而升高。當(dāng)發(fā)酵液使用濃度為2.0%時(shí)，對魚胚黑色素的抑制率達(dá)到59.45%±2.00%，顯著高于空白對照組和陽性對照熊果苷。

發(fā)酵液對72 hpf時(shí)魚胚酪氨酸酶活性的影響如圖3C所示。在實(shí)驗(yàn)條件下，1.0 mg·mL-1陽性對照組熊果苷對魚胚酪氨酸酶活性抑制率為29.97%±3.30%，與空白對照相比在P＜0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組中，使用不同濃度的發(fā)酵液魚胚酪氨酸酶活性抑制率均顯著高于空白對照組。在2.0%使用濃度下，發(fā)酵液對魚胚酪氨酸酶活性抑制率為35.38±5.68%，顯著高于空白對照組和陽性對照熊果苷。

3 討論

薏苡仁因其含有豐富的營養(yǎng)及活性成分，成為保健品市場最暢銷的產(chǎn)品之一，為此，國際上也越來越重視薏苡仁的研究與開發(fā)。目前薏苡仁的研究多集中在藥物開發(fā)和初加工產(chǎn)品方面，如薏米粉及制品、薏米飲料、薏米調(diào)味品等［30］。薏苡仁中的碳水化合物90%以上為支鏈淀粉，不利于乳酸菌的直接吸收利用［30］。因此，本實(shí)驗(yàn)在薏苡仁發(fā)酵基質(zhì)的制備過程中通過糊化和糖化處理有效的將淀粉轉(zhuǎn)化為小分子糖，可大幅提高乳酸菌的利用。

通過比較分析發(fā)酵液理化成分變化，發(fā)現(xiàn)L.b組和復(fù)合三菌發(fā)酵液的酸度值降幅最大，總酸和有機(jī)酸生成量也顯著高于L.l組和S.t組單菌發(fā)酵液，表明前兩組乳酸菌在薏苡仁發(fā)酵體系中的發(fā)酵空間優(yōu)于后兩組。體外活性方面，各組發(fā)酵液的抗氧化能力和酪氨酸酶活抑制率均較發(fā)酵前有明顯提高，盡管各組發(fā)酵液在抗氧化能力方面無顯著區(qū)別，但在酪氨酸酶活抑制率方面復(fù)合三菌發(fā)酵液顯著高于3種單菌發(fā)酵液。不同菌組發(fā)酵液的總酸和有機(jī)酸含量與其鈍化酪氨酸酶活效果表現(xiàn)出較高一致性。先前有研究報(bào)道，籽瓜瓤中的維生素C、蘋果酸、檸檬酸及其復(fù)合有機(jī)酸和粗多糖均有鈍化酪氨酸酶的能力，且隨濃度增加而提高［31-32］。體外功效評價(jià)結(jié)果表明，2.0%復(fù)合三菌發(fā)酵液可顯著減少斑馬魚體表黑色素的沉積，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可通過抑制黑色素上游合成途徑中的關(guān)鍵酶酪氨酸酶活性進(jìn)而使黑色素合成受到抑制。由此推測，本實(shí)驗(yàn)所得薏苡仁發(fā)酵液抑制酪氨酸酶活的主要活性成分可能為有機(jī)酸物質(zhì)，此外薏苡仁中特有的薏苡仁多糖A/B/C及薏苡仁素、甾醇類、多酚及三萜化合物對酪氨酸酶活的抑制作用也值得進(jìn)一步關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)對優(yōu)選的復(fù)合多菌發(fā)酵過程中生物量和優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。其中，總生物量在發(fā)酵前期呈指數(shù)增加，發(fā)酵液酸度也大幅增強(qiáng)，高通量測序結(jié)果表明乳酸乳球菌在此階段的相對豐度明顯提高，同嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌。隨著發(fā)酵進(jìn)入中后期，發(fā)酵液酸度進(jìn)一步增強(qiáng)，保加利亞乳桿菌逐漸取代乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而成為優(yōu)勢菌。有報(bào)道指出，在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌并存時(shí)，保加利亞乳桿菌因具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，可為嗜熱鏈球菌提供生長所需的甲硫氨酸、組氨酸和脯氨酸等多種氨基酸和多肽；而嗜熱鏈球菌則具有產(chǎn)酸較快的特點(diǎn)，其代謝產(chǎn)物包括甲酸、丙酮酸、葉酸等多種有機(jī)酸，可促進(jìn)保加利亞乳桿菌對嘌呤和氨基酸的合成［14，29］。兩者間的共生關(guān)系決定了復(fù)合發(fā)酵初期以嗜熱鏈球菌生長為主，后期則以保加利亞乳桿菌生長為主［30］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。乳酸乳球菌因發(fā)酵環(huán)境溫度高于其最適生長溫度以及發(fā)酵液酸度值遞增，其生長逐漸受阻而表現(xiàn)出前期生長快后期增長緩慢的趨勢。

綜上所述，乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌三菌復(fù)合發(fā)酵所得薏苡仁發(fā)酵液具有較好的清除羥自由基和抑制酪氨酸酶活性的能力，并可通過鈍化酪氨酸酶活性達(dá)到抑制斑馬魚體表黑色素生成的作用。研究結(jié)果可為研發(fā)乳酸菌發(fā)酵薏苡仁功能性高值化新產(chǎn)品及其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。