溶血性曼氏桿菌及其毒力因子研究進(jìn)展

胡玉婷，楊發(fā)龍，刀筱芳

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，MH)屬于巴氏桿菌科，是一種革蘭陰性球桿菌，其作為一種條件致病菌常存在于牛、羊等反芻動物上呼吸道的鼻腔和扁桃體隱窩等部位[1]。當(dāng)動物因長途運輸、飼養(yǎng)條件及天氣環(huán)境變化而受到應(yīng)激，或因支原體和病毒等病原感染而導(dǎo)致免疫功能下降時，其會迅速增殖并下行擴散至肺部，引起嚴(yán)重的肺炎。該病原是引起牛的呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)(運輸熱)最為重要的病原之一[2]。同時，溶血性曼氏桿菌也能感染山羊及綿羊等小反芻動物和美洲野牛、大角羊、大耳羊、麋鹿、駝鹿、鹿和叉角羚等反芻野生動物。也有研究發(fā)現(xiàn)，其還能夠感染某些非反芻動物，例如騾、兔、豬、鱷魚、狗和貓等[3]。目前，溶血性曼氏桿菌在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。由于溶血性曼氏桿菌對牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大威脅，因此，國內(nèi)外學(xué)者對其致病機制，特別是對一些重要毒力因子的生物學(xué)特征以及在致病過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了一系列研究，本文對近年來的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 分類地位及命名

目前，溶血性曼氏桿菌被歸為變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteob-acteria)、巴氏桿菌目(Pasteurellales)、巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)、曼氏桿菌屬(Pasteurella)[5]。溶血性曼氏桿菌自首次分離以來，其分類和命名經(jīng)歷了多次變化。起初，Kitt[6]于1885年將其命名為多殺性雙極桿菌(Bacteriumbipolaremultocidum)。1932年,Newsom等[7]根據(jù)其在血平板表現(xiàn)弱溶血性的特點將其更名為溶血性巴氏桿菌(Pasteurellahaemolytica)。1959年，Smith[8]根據(jù)不同菌株發(fā)酵阿拉伯糖和海藻糖的能力將其分為2個生物型，即A型和T型。1960年，Biberstein等[9]根據(jù)莢膜表面抗原的不同將A型和T型的菌株分為17個血清型，其中A型包括A1、A2、A5～A9、A11～A14、A16和A17共13個血清型，而T型包括T3、T4、T10、T15血清型。隨后，Angen等[10-11]根據(jù)DNA-DNA雜交和16S rRNA測序的研究，把其中A11血清型單獨命名為葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)，而把其他A血清型命名為溶血性曼氏桿菌，所有T型菌株則命名為海藻糖巴氏桿菌(Pasteurellatrehalosi)[12]。2007年，Blackall等[13]又將其正式命名為海藻糖比伯斯坦桿菌(Bibersteiniatrehalose)。

對溶血性曼氏桿菌分類及命名的主要過程如圖1所示。

圖1 溶血性曼氏桿菌的分類及命名過程

2 血清型

在最初將溶血性曼氏桿菌歸為巴氏桿菌屬時，根據(jù)其分別發(fā)酵阿拉伯糖和海藻糖的能力將其分為2個生物類型：A型和T型[8]。Biberstein等[9]利用間接血凝試驗，根據(jù)莢膜表面抗原將A型和T型的菌株分為17個血清型，其中生物A型包括13種血清型，分別為A1、A2、A5～A9、A11～A14、A16和A17血清型，T型包括4種血清型，分別為T3、T4、T10、T15。隨后，將A型中A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17血清型命名為溶血性曼氏桿菌，A11血清型命名為葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)[10-11]。因此，目前溶血性曼氏桿菌共有12個血清型，分別為A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17血清型。

在溶血性曼氏桿菌的12種血清型中，A1、A2及A6血清型是流行最為廣泛的血清型，其次是A7、A9、A11和A12血清型[14]。雖然A1、A2和A6血清型都能感染牛、羊并定殖于上呼吸道，但表現(xiàn)為一定的宿主特異性，即感染不同宿主的血清型存在一定的差異。其中A1和A6血清型是引起牛肺炎的主要血清型。姜志剛等[15]對我國東北地區(qū)牛群感染溶血性曼氏桿菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起我國牛肺炎的溶血性曼氏桿菌血清型主要為A1和A6，分別占分離菌株的66.7%和33.3%，與國外的相關(guān)報道一致。雖然A2血清型菌株也存在于健康牛的上呼吸道，但普遍認(rèn)為A2血清型在牛上僅作為非致病性血清型，在應(yīng)激或合并感染后，A1血清型很快取代A2血清型成為主要血清型，這種轉(zhuǎn)變可能是由感染的A1血清型菌株的病畜其傳播給感染A2血清型菌株的動物來完成的[16]。

關(guān)于感染山羊及綿羊的溶血性曼氏桿菌的優(yōu)勢血清型，相關(guān)報道并不一致。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，A2血清型是感染羊的主要血清型，如：Fodor等[17]對從匈牙利山羊中分離得到的49株溶血性曼氏桿菌進(jìn)行血清型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A2血清型所占比例高達(dá)94.0%。但也有報道與上述結(jié)果并不相符，如：Abay等[18]對山羊源溶血性曼氏桿菌陽性血清樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)A1血清型為優(yōu)勢血清型，占43.5%，其次是A2和A7血清型。因此，不同血清型與感染宿主之間的相關(guān)性尚無明確的結(jié)論。特別是不同血清型對綿羊和山羊致病性并不了解，值得進(jìn)一步研究。

3 毒力因子

與大多數(shù)致病性細(xì)菌一樣，溶血性曼氏桿菌在其感染和進(jìn)一步致病的過程中，是通過依靠各種毒力因子來完成的[14]。目前，已經(jīng)對溶血性曼氏桿菌的一些重要毒力因子進(jìn)行了鑒定，其中包括對反芻動物白細(xì)胞具有特異性毒性的白細(xì)胞毒素(Leukotoxins，LKT)，能夠誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子應(yīng)答的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，能夠激發(fā)機體免疫應(yīng)答的外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMP)，與細(xì)菌定植相關(guān)的黏附素以及在細(xì)菌黏附和侵入過程中起重要作用的莢膜等，均與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。因此，深入了解溶血性曼氏桿菌中的毒力因子，有助于闡明溶血性曼氏桿菌的致病機制，并為其疫苗研制和藥物治療提供重要的理論基礎(chǔ)[1]。

3.1 白細(xì)胞毒素 白細(xì)胞毒素(Leukotoxin，LKT)屬于細(xì)菌成孔毒素(Repeats in toxin，RTX)家族的成員，是溶血性曼氏桿菌最為重要的毒力因子[5]。Tatum等[19]通過基因敲除構(gòu)建了溶血性曼氏桿菌LKT基因缺失株。發(fā)現(xiàn)與野生型溶血性曼氏桿菌相比，缺失株的LKT活性降低，甚至不會引起明顯的肺部病變[19]，說明LKT對于溶血性曼氏桿菌的致病性至關(guān)重要。

LKT作為RTX家族的成員，由4個基因簇lktC、lktA、lktB和lktD編碼組成[19]。其中，lktA作為結(jié)構(gòu)基因主要編碼LKT原蛋白(LktA)；基因lktC編碼轉(zhuǎn)酰酶，翻譯后通過脂肪酸?；揎棽换钴S的LKT原蛋白，從而將其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的LKT(LktA)。在?；^程中，脂肪酸基團(tuán)被添加到位于lktA上的賴氨酸殘基上，這是LktA去電荷、增加親水性的關(guān)鍵步驟，使LktA能夠插入宿主細(xì)胞，形成跨膜孔。最終由lktB和lktD基因產(chǎn)物將其由細(xì)菌胞漿運輸?shù)酵猸h(huán)境中[20]。

Davies等[21]對31株綿羊和牛的溶血性曼氏桿菌的lktA基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了8種lktA主要的等位基因亞型：lktA1～lktA3和lktA6～lktA10亞型。通過對比不同血清型的溶血性曼氏桿菌的lktA基因亞型，發(fā)現(xiàn)不同血清型之間lktA基因亞型不同。如：lktA2亞型僅出現(xiàn)在A2血清型之中；lktA6、lktA7和lktA9亞型分別只出現(xiàn)在A13、A16和A14血清型之中。同時發(fā)現(xiàn)，lktA基因亞型和宿主特異性相關(guān)，如：lktA1.1亞型僅出現(xiàn)在牛源溶血性曼氏桿菌分離株中，而lktA1.2和lktA1.3基因亞型主要存在于綿羊源溶血性曼氏桿菌中。此外，Davies等[22]研究發(fā)現(xiàn)，牛源溶血性曼氏桿菌分離株的lktA1.1亞型與綿羊源lktA1.2亞型和lktA1.3亞型對相同細(xì)胞類型(即對?；蚓d羊中性粒細(xì)胞)的細(xì)胞毒性存在明顯差異。

雖然LKT可以結(jié)合宿主的多種細(xì)胞,但細(xì)胞溶解需要與特定靶細(xì)胞上的特定受體發(fā)生特異性結(jié)合[20]。宿主特異性源于LKT與宿主細(xì)胞上面的β2整合素LFa-1(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1)的相互作用[2]。目前發(fā)現(xiàn)LKT作用受體主要為β2整合素的LFa-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)以及CR4(CD11c/CD18)3種[23-24]。

同時，LKT作為高度不穩(wěn)定的細(xì)胞外分泌蛋白，常常在作用于反芻動物白細(xì)胞時表現(xiàn)出劑量依賴性[4]。在低濃度時，LKT通過與β2整合素受體的相互作用可以激活白細(xì)胞，引起白細(xì)胞呼吸暴發(fā)和脫顆粒，活化的中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，肥大細(xì)胞釋放組胺，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在肺部積聚；在高濃度時，LKT通過外源性和內(nèi)源性機制誘導(dǎo)宿主白細(xì)胞凋亡，使細(xì)菌通過破壞固有免疫反應(yīng)(巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)和增強炎癥過程來逃避宿主免疫監(jiān)視；在最高濃度時，LKT誘導(dǎo)白細(xì)胞跨膜孔的形成，引起靶細(xì)胞壞死，最終導(dǎo)致肺部損傷[15]。因此，上述LKT對反芻動物白細(xì)胞的損傷作用可能使溶血性曼氏桿菌逃避宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，削弱肺的主要免疫防御機制，并進(jìn)一步引起肺部炎癥和組織損傷[14]。

3.2 脂多糖 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是溶血性曼氏桿菌另一重要的毒力因子[2]。作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，LPS的脂質(zhì)A具有內(nèi)毒素活性。LPS可以使細(xì)菌逃避宿主的免疫屏障從而在肺部進(jìn)行增殖，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子應(yīng)答，裂解中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，最終加強對肺部的損傷。LPS的毒性可通過與肺表面活性物質(zhì)中的磷脂結(jié)合而增強，從而使LPS在肺中持續(xù)存在并引發(fā)炎癥。此外，LPS引起的全身效應(yīng)包括發(fā)熱和肝臟產(chǎn)生急性期蛋白，導(dǎo)致被感染動物出現(xiàn)低血壓和敗血癥的臨床癥狀[2]。

LPS對白細(xì)胞的作用也呈劑量依賴性。低濃度時，LPS降低了中性粒細(xì)胞的吞噬能力；而高濃度時，LPS則增強中性粒細(xì)胞的吞噬能力[2]。

LPS的病理效應(yīng)是通過與LPS結(jié)合蛋白的結(jié)合完成的，進(jìn)一步的相互作用很可能是通過CD14介導(dǎo)的[2]。當(dāng)LPS被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，就會被一種稱為LPS結(jié)合蛋白(LBP)的血清蛋白所識別，并形成LBP-LPS復(fù)合物。LBP不僅可以識別LPS，還能將LPS轉(zhuǎn)移到單核細(xì)胞或者是巨噬細(xì)胞的細(xì)胞表面受體CD14(mCD14)上，通過形成LPS-CD14復(fù)合物從而激活細(xì)胞。LPS-CD14復(fù)合物能夠通過與另一膜蛋白Toll樣受體4(TLR4)相互作用來啟動細(xì)胞內(nèi)信號。TLR4是一種跨膜蛋白，它可以識別特殊的配體LPS。信號通路又能誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO和活性氧(ROS)[25]，這些炎性因子的過度表達(dá)會導(dǎo)致肺部的損傷，并最終導(dǎo)致嚴(yán)重的肺炎[26]。然而，LPS也可以在沒有LBP的情況下激活單核吞噬細(xì)胞，從而猜測：CD14依賴通路可能不是LPS與巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞相互作用的唯一途徑[2]。

綜上所述，LPS通過多種復(fù)雜的機制導(dǎo)致肺部病變。此外，溶血性曼氏桿菌的LPS能夠增強LKT對靶細(xì)胞的毒害作用。體外研究顯示，與分別受到LKT和LPS攻擊的細(xì)胞相比，同時受到LKT和LPS攻擊的牛肺泡巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素8(IL-8)[2]。

3.3 外膜蛋白 溶血性曼氏桿菌具有多種外膜蛋白。研究表明，在溶血性曼氏桿菌中，其外膜蛋白和脂蛋白在一定程度上具有宿主和血清型特異性，并且是重要的保護(hù)性抗原，針對這些抗原的抗體能夠誘導(dǎo)吞噬作用和補體介導(dǎo)的殺傷作用[27]，因此作為潛在的疫苗候選物一直被研究。此外，Iovane等[28]證明,外膜蛋白對中性粒細(xì)胞具有趨化作用，并能夠抑制其吞噬作用和細(xì)菌殺傷作用，因此有利于溶血性曼氏桿菌在肺部的定植。

在所有外膜蛋白中最主要的是外膜蛋白OmpA，其是高度保守的蛋白，該蛋白有助于細(xì)菌結(jié)合到宿主上呼吸道細(xì)胞的特異性受體上，在溶血性曼氏桿菌黏附、定植[2]和選擇特異性宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[5]。Kisiela等[29]在研究溶血性曼氏桿菌對牛上皮細(xì)胞的黏附研究中發(fā)現(xiàn)，溶血性曼氏桿菌的外膜蛋白A(OmpA)和脂蛋白1(Lpp1，也稱為PlpA)有助于溶血性曼氏桿菌對牛支氣管上皮細(xì)胞的黏附。此外，在外膜蛋白中，還有一類脂蛋白同樣重要。研究發(fā)現(xiàn)，在溶血性曼氏桿菌所有血清型中均發(fā)現(xiàn)了一種外膜脂蛋白為PlpE，在接種疫苗后PlpE能夠提供免疫性保護(hù)[30]。并且，針對A1血清型的PlpE的抗體能夠提供針對A6血清型的交叉保護(hù)，并促進(jìn)吞噬作用和補體介導(dǎo)的細(xì)菌殺滅作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，外膜脂蛋白PlpE也具有良好的免疫原性[30]。

除了上述外膜蛋白和脂蛋白，溶血性曼氏桿菌還產(chǎn)生一類外膜蛋白以獲取鐵，被稱為鐵調(diào)節(jié)的外膜蛋白(IROMPs)。IROMPs對鐵具有高度親和力，能直接從轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白中攝取鐵，同時能抑制中性粒細(xì)胞的吞噬作用，從而保證溶血性曼氏桿菌在體內(nèi)的生長繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，IROMPs能夠被恢復(fù)期的牛(綿羊)的血清所識別，表明它們能夠作為保護(hù)性抗原在體內(nèi)表達(dá)[11]。目前，至少有3種溶血性曼氏桿菌A1血清型IROMP已經(jīng)被鑒定，大小分別為71、77 kDa和100 kDa[30]。

3.4 莢膜多糖 根據(jù)莢膜多糖表面抗原的不同，溶血性曼氏桿菌分為12個血清型(A1、A2、A5～A9、A12～A14、A16和A17)[7]。莢膜多糖在許多革蘭陰性菌的致病過程中起作用，這些作用包括黏附、抵抗宿主免疫防御和掩蔽細(xì)菌逃脫免疫反應(yīng)[2]。溶血性曼氏桿菌的莢膜多糖同樣參與了溶血性曼氏桿菌的致病過程，已有研究表明，溶血性曼氏桿菌的莢膜可能與肺表面活性物質(zhì)相互作用，從而促進(jìn)機體與不同的宿主細(xì)胞的局部黏附。

3.5 菌毛和黏附素 黏附是呼吸道病原體感染并定殖于宿主的首要條件，溶血性曼氏桿菌對宿主呼吸道上皮細(xì)胞的黏附主要是由菌毛和黏附素介導(dǎo)的。

目前，通過免疫印跡等方法已經(jīng)鑒定出多種黏附素及其在宿主內(nèi)的靶細(xì)胞，其中包括上面述及的多種外膜蛋白，如：外膜蛋白A(OmpA)和脂蛋白1(Lpp1，也稱為PlpA)在溶血性曼氏桿菌對牛上皮細(xì)胞的黏附過程中發(fā)揮重要作用。此外，還發(fā)現(xiàn)外膜蛋白A(OmpA)可能有助于溶血性曼氏桿菌在羊的呼吸道定植。Mora等[31]還發(fā)現(xiàn)了1個68 kDa分子，可以作為黏附素與培養(yǎng)的氣管上皮細(xì)胞結(jié)合。

另外，溶血性曼氏桿菌的菌毛上可能存在黏附素分子，并通過結(jié)合呼吸道上皮細(xì)胞的唾液酸糖蛋白受體來介導(dǎo)黏附作用[32]。

3.6 神經(jīng)氨酸酶 在其他細(xì)菌性呼吸道病原體中，神經(jīng)氨酸酶可以使唾液糖蛋白脫水，從而使病原體逃避口咽中的防御系統(tǒng)。神經(jīng)氨酸酶在溶血性曼氏桿菌的定植中也發(fā)揮作用，神經(jīng)氨酸酶可以通過暴露潛在的細(xì)胞受體來增強生物膜的形成，并通過裂解唾液糖蛋白來逃避宿主局部的先天性免疫[2]。此外，神經(jīng)氨酸酶能夠降低呼吸道黏液的黏度，增強溶血性曼氏桿菌的黏附性，使溶血性曼氏桿菌更緊密地附著在細(xì)胞表面。

3.7 糖蛋白酶 溶血性曼氏桿菌具有多種糖蛋白酶[2]。雖然它們的生物學(xué)特征和致病過程中所發(fā)揮的作用尚不完全清楚，但已經(jīng)證明它們有利于細(xì)菌定植及肺部感染的形成。研究表明，從培養(yǎng)的溶血性曼氏桿菌的上清液中獲得的糖蛋白酶可以選擇性地水解IgG1，從而抑制調(diào)理素誘導(dǎo)的吞噬作用和細(xì)菌殺滅作用。Shewen等[33]研究證明，用重組糖蛋白酶對小牛進(jìn)行疫苗接種后，可產(chǎn)生顯著的血清抗體應(yīng)答，且能保護(hù)小牛免受溶血性曼氏桿菌血清A1型的試驗感染。

此外，溶血性曼氏桿菌所有血清型都可以產(chǎn)生一種糖蛋白酶—鋅金屬蛋白酶(Zinc metalloproteinase)[34]。Nyarko等[35]研究發(fā)現(xiàn)，鋅金屬蛋白酶能夠作用于宿主上皮細(xì)胞表面增強其黏附力。此外，其還能引起肺泡中血小板的聚集。在體外可通過與LKT共孵育而增強糖蛋白酶活性[36]。

4 展望

溶血性曼氏桿菌作為一種嚴(yán)重威脅牛、羊養(yǎng)殖的重要呼吸道病原[2]，全面掌握其分子生物學(xué)特征以及感染與免疫的機制等是開發(fā)安全、有效的疫苗和采取綜合防治措施的前提[4]。因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者針對溶血性曼氏桿菌的功能蛋白和毒力因子展開了大量的研究[5]。

毒力因子是決定細(xì)菌致病性的關(guān)鍵[13]。如本文所述，目前對溶血性曼氏桿菌的重要毒力因子已進(jìn)行了鑒定，對其分子結(jié)構(gòu)以及在溶血性曼氏桿菌感染和致病過程中所發(fā)揮的作用也進(jìn)行了大量的研究[16]。相關(guān)研究結(jié)果也有效促進(jìn)了新型疫苗的研制工作，例如基于重組LKT[26]、PlpE的亞單位疫苗，以及LKT等功能蛋白增強的滅活疫苗等[13,27]，均表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果。

盡管如此，對溶血性曼氏桿菌毒力因子及其致病機制的了解尚不全面。此外，溶血性曼氏桿菌對牛表現(xiàn)出一定的宿主特異性，但決定這種特異性的分子尚不清楚，這對于溶血性曼氏桿菌的綜合防控不利，仍需進(jìn)一步研究。