基于灰色關(guān)聯(lián)度分析綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量

張洪坤 黃玉瑤 路麗 楊美華 吳韶輝 高貫彪

(1.亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193;3.廣州市中芝源中藥有限公司，廣東 廣州 510925；4.韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512026)

牡丹的藥用價(jià)值自先秦開(kāi)始體現(xiàn)，明確記載“牡丹”始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，之后更多古書(shū)典籍中提及牡丹的藥用，入藥部位為牡丹皮?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015版)一部載，牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[1]，主產(chǎn)于安徽、山東、山西、河南、湖南、湖北、四川、重慶、甘肅、陜西等地。牡丹皮中主含酚類(lèi)、單萜類(lèi)等多種成分[2-7]，其成分含量的高低，可直接影響藥材質(zhì)量?；疑到y(tǒng)理論[8-13]在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用主要是基于中藥樣本各指標(biāo)成分定量數(shù)據(jù)，建立灰色關(guān)聯(lián)度評(píng)價(jià)模型，計(jì)算評(píng)價(jià)單元序列與參考序列間的相對(duì)關(guān)聯(lián)度，對(duì)評(píng)價(jià)單元進(jìn)行排序，從而獲得評(píng)價(jià)結(jié)果[14-16]。因此，本研究以17個(gè)產(chǎn)地牡丹皮藥材為研究對(duì)象，按2015年版《中國(guó)藥典》方法測(cè)定樣品中浸出物和總灰分含量，采用HPLC分析法同時(shí)測(cè)定樣品中7成分含量，基于灰色關(guān)聯(lián)度分析綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1儀器 粉碎機(jī)、電子天平(百萬(wàn)分之一，Mettler Toledo)、電子天平(萬(wàn)分之一，Mettler Toledo)、電熱鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水浴鍋(上海市一恒科學(xué)儀器有限公司)，馬弗爐，DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(Agilent)。

1.2材料 沒(méi)食子酸(110831-201605，純度90.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；兒茶素(110877-201604，純度99.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；氧化芍藥苷(MUST-16021505，純度99.93%，成都曼斯特有限公司)；芍藥苷(110736-201539，純度96.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；苯甲酸(100419-200301，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；丹皮酚(110708-201407，純度99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；苯甲酰芍藥苷(MUST-16061803，純度99.28%，成都曼斯特有限公司)。甲醇為色譜純(Merck)；磷酸為色譜純(阿拉丁)；其余試劑為分析純。牡丹皮藥材于2017年先后自安徽、山東、山西、湖南、湖北、河南、甘肅、陜西、四川等牡丹皮主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地牡丹皮藥材來(lái)源信息

1.3方法

1.3.1理化指標(biāo) 按2015年版《中國(guó)藥典》四部醇溶性浸出物測(cè)定法(熱浸法)、總灰分測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3.2多成分含量測(cè)定 本研究參照本項(xiàng)目研究成果《牡丹皮不同采收期質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究》[17]、《不同產(chǎn)地牡丹皮規(guī)格等級(jí)內(nèi)涵研究》[18]一文中所述的含量測(cè)定方法，方法學(xué)考察內(nèi)容不再贅述。(1)對(duì)照品溶液制備:取對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，得質(zhì)量濃度分別為沒(méi)食子酸0.5 mg/mL、兒茶素0.5 mg/mL、氧化芍藥苷0.3 mg/mL、芍藥苷1.0 mg/mL、苯甲酸0.5 mg/mL、丹皮酚1.0 mg/mL和苯甲酰芍藥苷0.5 mg/mL的單個(gè)對(duì)照品溶液。分別精密移取上述各對(duì)照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.0 036 mg/mL、0.0 030 mg/mL、0.0 126 mg/mL、0.0 194 mg/mL、0.0 020 mg/mL、0.0 501 mg/mL、0.0 051 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液制備：取過(guò)3號(hào)篩的樣品粉末，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(3)色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm，258 nm(氧化芍藥苷)；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。在此色譜條件下，取對(duì)照品、供試品溶液適量，分別進(jìn)樣10μL測(cè)定，HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；1.沒(méi)食子酸；2.兒茶素；3.氧化芍藥苷；4.芍藥苷；5.苯甲酸；6.丹皮酚；7.苯甲酰芍藥苷。圖1 HPLC色譜圖

2 方 法

2.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、15μL，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)分析，以對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表3。

表3 7種對(duì)照品的線性關(guān)系

2.2牡丹皮樣品各指標(biāo)成分含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地牡丹皮樣品，分別按“2.1”、“2.2”、項(xiàng)下分析方法測(cè)定浸出物、總灰分、以及沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷的含量。見(jiàn)表4。

表4 牡丹皮樣品9種指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3建立評(píng)價(jià)牡丹皮藥材質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度模式 本研究參照本項(xiàng)目研究成果《牡丹皮不同采收期質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究》[17]、《不同加工方法牡丹皮中7種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)》[19]、及其他文章中所述的灰色關(guān)聯(lián)度方法，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度方法的建立。

2.3.1數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 將原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行規(guī)格化處理。見(jiàn)表5。

表5 不同產(chǎn)地牡丹皮原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理

表6 評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

表7 評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.3.3關(guān)聯(lián)度與相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)度ri(s)、ri(t)，以及17個(gè)批次牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri，并進(jìn)行質(zhì)量排序，結(jié)果見(jiàn)表8。

2.3.4牡丹皮藥材質(zhì)量評(píng)價(jià) 相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri與牡丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)成正相關(guān)，ri排序結(jié)果可作為藥材質(zhì)量高低評(píng)價(jià)的依據(jù)。由表9可見(jiàn)，17個(gè)產(chǎn)地牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.314～0.597之間，其中6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度>0.50，5個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.45～0.50之間，6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度<0.45，表明不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城絳縣(S07)、山西運(yùn)城聞喜(S06)、安徽銅陵(S01)、安徽南陵(S09)和陜西商洛(S15)的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位。湖北恩施利川(S10)、重慶墊江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五馬(S04)、亳州華佗(S02)和山東菏澤(S05)的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位。

3 討 論

本研究建立了HPLC分析法同時(shí)測(cè)定牡丹皮藥材中沒(méi)食子酸等7成分的含量測(cè)定方法，該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可用于牡丹皮質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，為牡丹皮多指標(biāo)質(zhì)量控制方法的建立提供一些理論參考。

本次研究共采集了17個(gè)產(chǎn)地的牡丹皮藥材，以其沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷、浸出物和總灰分倒數(shù)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用GRA法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)關(guān)聯(lián)度作為測(cè)度，評(píng)價(jià)各產(chǎn)地牡丹皮樣品，能夠相對(duì)客觀全面地反映牡丹皮藥材的內(nèi)在質(zhì)量，從而實(shí)現(xiàn)牡丹皮藥材的合理評(píng)價(jià)。各產(chǎn)地牡丹皮藥材相對(duì)關(guān)聯(lián)度：山西運(yùn)城聞喜>山西運(yùn)城絳縣>安徽銅陵>安徽南陵>陜西商洛>河南焦作孟州>陜西安康>四川達(dá)州>湖南邵陽(yáng)>甘肅永登>甘肅天水>湖北恩施利川>重慶墊江>亳州十九里>亳州五馬>亳州華佗>山東菏澤。

本研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城產(chǎn)地牡丹皮藥材中兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷和浸出物含量明顯高于其他產(chǎn)地，其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)關(guān)聯(lián)度最高；安徽銅陵、南陵所產(chǎn)的牡丹皮藥材質(zhì)量排序第3、第4名，說(shuō)明其藥材整體關(guān)聯(lián)度較高，同時(shí)安徽銅陵和南陵為牡丹皮的道地產(chǎn)區(qū)。

中藥牡丹皮是一個(gè)復(fù)雜的藥材，成分的多樣性致使其質(zhì)量很難控制，單一的指標(biāo)成分不能準(zhǔn)確反映中藥的藥效和質(zhì)量，使其在分析評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量時(shí)損失信息量太多。而中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的深度挖掘顯得尤為重要[20]?；疑P(guān)聯(lián)度分析法可以深度挖掘原始信息下所隱藏的關(guān)聯(lián)，整體性強(qiáng)，適合于分析成分復(fù)雜的中藥?；诨疑P(guān)聯(lián)分析法的特點(diǎn)，本研究以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，構(gòu)建一種牡丹皮藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)模型，客觀地反映了牡丹皮藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為牡丹皮藥材的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路，求購(gòu)者可以參考本文的結(jié)果根據(jù)實(shí)際需要選擇不同產(chǎn)地的牡丹皮，也為牡丹皮資源的開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。