基于cytb基因分析建昌馬和安寧果下馬的遺傳多樣性和起源進(jìn)化

劉 敏，黃衛(wèi)平，金素鈺，黃 林，饒開晴，鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省涼山州畜牧科學(xué)研究所，四川 西昌 615042)

馬(Equuscaballus)作為最早被馴化的動(dòng)物之一，在古代農(nóng)業(yè)、軍事和交通運(yùn)輸?shù)确矫嬗胁豢苫蛉钡淖饔?，而目前主要用于馬術(shù)運(yùn)動(dòng)、觀賞等方面.建昌馬原產(chǎn)于中國四川省涼山州，體型較小，是西南小型山地馬的代表品種，有學(xué)者認(rèn)為其是古羌人南下安寧河一帶時(shí)帶來的青海馬，曾用于日常生活和軍事.同樣分布在四川省涼山州的安寧果下馬是20世紀(jì)80年代在安寧河谷附近發(fā)現(xiàn)的體高在100 cm以下的馬品種[1].關(guān)于安寧果下馬的起源存在著兩種觀點(diǎn)：一是認(rèn)為安寧果下馬是古代果下馬在相對封閉的環(huán)境中的孑遺小群，二是認(rèn)為它是當(dāng)?shù)氐慕úR受到環(huán)境影響而矮化的結(jié)果，但迄今未有定論.

在開展家畜的遺傳育種改良工作中，家畜的起源進(jìn)化研究非常重要，其中線粒體DNA(mtDNA)和Y染色體遺傳標(biāo)記分別是分析哺乳動(dòng)物母系起源和父系起源的重要分子標(biāo)記.在哺乳動(dòng)物中，mtDNA是雌性動(dòng)物傳遞給下一代的遺傳物質(zhì)，它主要包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)由13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因組成，其中細(xì)胞色素b(cytb)基因的結(jié)構(gòu)與功能最清楚.cytb基因序列相對保守，進(jìn)化速率適中，在一定進(jìn)化尺度內(nèi)不受飽和效應(yīng)的影響，在核苷酸組成上有偏好性，具有種間的差異，適合分析種間或種內(nèi)的差異，因此被作為分子遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于物種的起源進(jìn)化研究[2]和種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析[3].目前的研究均表明家馬mtDNA具有豐富的遺傳多樣性并顯示多母系起源[4-5]，而家馬的父系遺傳多樣性低[6-7].從相關(guān)文獻(xiàn)分析來看，家馬的mtDNA D-loop區(qū)和cytb基因都具有豐富的遺傳多樣性，在考古學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)的結(jié)合下，Cai等[8]分析了來自河南、山東、內(nèi)蒙古等7個(gè)遺址的古代馬樣本的mtDNA的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)中國古代馬在中國現(xiàn)代馬的7個(gè)單倍群中均有分布，且母系遺傳具有高度的多樣性，此外還發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代的蒙古馬與中國古代馬親緣關(guān)系近.

為更加清晰地闡述建昌馬的系統(tǒng)進(jìn)化，Ling等[9]、周凡莉等[10]和劉敏等[11]分別對建昌馬的mtDNA D-loop區(qū)和Y染色體遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)相對于建昌馬的mtDNA D-loop高變區(qū)豐富的遺傳多樣性并有多個(gè)母系起源，其Y染色體遺傳多樣性低且父系起源少；此外，楊樂等[12]對4匹安寧果下馬的mtDNA D-loop區(qū)序列初步分析，發(fā)現(xiàn)安寧果下馬的D-loop區(qū)也具有豐富的多態(tài)性，但并未對其進(jìn)行進(jìn)化分析.本研究以建昌馬和安寧果下馬的cytb基因作為研究切入點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)品種cytb基因的全序列并直接測序，為闡明建昌馬和安寧果下馬的分子遺傳特征、系統(tǒng)進(jìn)化等提供資料.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品的采集

本研究的試驗(yàn)動(dòng)物建昌馬(n=40；21公，19母)和安寧果下馬(n=4；2公，2母)飼養(yǎng)于四川省涼山州西昌市近郊，均為成年健康馬匹，個(gè)體間無親緣關(guān)系.

通過頸靜脈采血于含EDTA的一次性抗凝管中，置于冰盒內(nèi)盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分裝后于-80 ℃保存.

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：Eppendorf Minispin plus微型離心機(jī)，Bio-Rad C1000梯度PCR儀，Bio-Rad VersaDoc 1000凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad POWER/PAC 3000電泳儀，Biochrom WPA Biowave核酸蛋白檢測儀.

主要試劑：QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit，Golden Star T6 Super PCR Mix，Solarbio GoldView Ⅰ型核酸染色劑，天根DL-2000 Marker.

1.3 馬基因組DNA的提取

采用QIAGEN公司的DNeasy Blood& Tissue Kit從建昌馬和安寧果下馬的抗凝全血中提取基因組DNA，用核酸蛋白檢測儀檢測DNA的純度和濃度，置于-20 ℃冰箱保存.

1.4 PCR引物的設(shè)計(jì)和合成

本研究參考安麗萍[13]設(shè)計(jì)的引物：F: 5′-TGGAATCTAACCACGACCAA-3′，R: 5′-TAGGGGAAGAAATCAAGGAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約1370 bp，包括cytb基因全序列.引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.5 馬cytb基因的PCR擴(kuò)增和測序

以建昌馬和安寧果下馬基因組DNA為模板擴(kuò)增cytb基因全序列，PCR擴(kuò)增體系為25 μL：2 μL基因組DNA，上、下游引物各1 μL，21 μL Golden Star T6 Super PCR Mix；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存.

PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將單一、清晰的目的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過DNAMAN 5.2.2軟件對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到完整的cytb基因序列，用MEGA 7.0.26軟件統(tǒng)計(jì)分析cytb基因序列的堿基組成，利用DnaSP 5.10.01軟件統(tǒng)計(jì)cytb基因的變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸變異數(shù)(K)和Tajima’s D值.將獲得的單倍型用MEGA 7.0.26軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.引用NCBI中的21個(gè)馬品種的cytb基因序列(表1)通過MEGA軟件以Kimura雙參數(shù)法計(jì)算各品種間的遺傳距離并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，用NETWORK 10.1.0.0軟件對上述21個(gè)及本試驗(yàn)的2個(gè)馬品種的cytb基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)單倍型聚類分析.

表1 21個(gè)品種馬的cytb基因參考序列信息

2 結(jié)果

2.1 建昌馬和安寧果下馬cytb基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測兩個(gè)馬品種的cytb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，圖中的特異性條帶大小在1 000 bp和2 000 bp之間，條帶清晰，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，可用于后續(xù)的直接測序.

圖1 馬cytb基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 建昌馬和安寧果下馬cytb基因遺傳多樣性分析

對40匹建昌馬和4匹安寧果下馬的44個(gè)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到的cytb序列大小均為1 140 bp，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失.共檢測到20種單倍型，每種單倍型堿基組成相差甚微(表2)，平均核苷酸組成的比例從大到小依次排列為C(32.2%)>A(28.1%)>T(U)(26.5%)>G(13.2%)，C+G的比例為45.4%.在密碼子的第一位～第三位含量最高的分別為：A(29.0%)、T(42%)、C(44.4%).

表2 馬cytb基因20個(gè)單倍型平均核苷酸組成(%)

通過DnaSP 5.10.01軟件分析44匹試驗(yàn)馬的cytb基因序列，檢測到45個(gè)變異位點(diǎn)(表3)，約占全序列的3.95%，其中28個(gè)為簡約信息位點(diǎn)，17個(gè)為單一變異位點(diǎn).45個(gè)變異位點(diǎn)中7個(gè)位點(diǎn)為顛換，其它均為轉(zhuǎn)換.有5個(gè)變異位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸的變化(表4)，其它均為同義突變.

表3 兩個(gè)馬品種的cytb基因單倍型變異位點(diǎn)

表4 Ctyb的氨基酸變化

23個(gè)馬品種的單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸變異數(shù)(K)和Tajima’s D值的比較見表5.本研究中建昌馬和安寧果下馬中共存在20個(gè)單倍型，其中7個(gè)為共享單倍型(H1、H6、H7、H8、H9、H11和H12)，13個(gè)為單一單倍型(僅1匹馬)，H1是最主要的單倍型(13匹馬).40匹建昌馬分布在H1-H19的19個(gè)單倍型中，4匹安寧果下馬分別分布在單倍型H1、H6、H12和H20中，安寧果下馬存在一個(gè)特有的單倍型H20.通過計(jì)算得到建昌馬和安寧果下馬的Tajima’s D值分別為-1.59086和-0.15360，差異均不顯著，屬于中性突變.

表5 23個(gè)馬品種cytb基因的遺傳多樣性

2.3 建昌馬和安寧果下馬的遺傳進(jìn)化分析

將確定的建昌馬和安寧果下馬20種單倍型采用Kimura-2模型，以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，顯示為兩大支和7小支，單倍型最多的是包含7個(gè)單倍型的A支系，最少的是H8單獨(dú)形成的C支系.安寧果下馬的單倍型分布于A、F和G支系中，其特有的單倍型H20分布于A支系.

圖2 建昌馬和安寧果下馬20個(gè)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 20 haplotypes in Jianchang horse and Anning pony

基于Kimura雙參數(shù)法計(jì)算23個(gè)馬品種之間的平均遺傳距離(表6)，數(shù)值在0.0023～0.0069之間，寧強(qiáng)馬與柴達(dá)木馬的遺傳距離最小(0.0023)，純血馬與普氏野馬的遺傳距離最大(0.0069).建昌馬和安寧果下馬與柴達(dá)木馬遺傳距離均最小(分別為0.0036、0.0029)，二者與普氏野馬的遺傳距離均最大(分別為0.0062、0.0055).建昌馬與安寧果下馬的遺傳距離為0.0043.

表6 23個(gè)品種馬cytb基因的遺傳距離

基于品種間遺傳距離構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3).23個(gè)馬品種分成了7大支，建昌馬與利川馬、蒙古馬、安寧果下馬、藏馬、焉耆馬和關(guān)中馬聚為一大支.

圖3 基于23個(gè)馬品種遺傳距離構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

對23個(gè)品種馬的416條cytb序列分析發(fā)現(xiàn)共存在100個(gè)單倍型，其中Hap1單倍型占優(yōu)勢(20.19%)，其次是Hap2(12.74%)、Hap3(7.69%)和Hap15(6.97%)，且這幾個(gè)單倍型都存在建昌馬的個(gè)體；Hap71-Hap78共8個(gè)單倍型是建昌馬特有的單倍型.安寧果下馬特有的單倍型H20與3匹巴里坤馬、1匹貴州馬、3匹哈薩克馬、3匹威爾士小馬、1匹蒙古馬和1匹純血馬共同形成單倍型Hap4.通過NETWORK 10.1.0.0軟件對23個(gè)馬品種的cytb基因序列構(gòu)建Median Joining網(wǎng)絡(luò)聚類圖(圖4)，其中Hap1是主要單倍型.單倍型分布以Hap1為中心，以星狀向外擴(kuò)散使家馬分布在7個(gè)不同的單倍群里(A-G)，提示不同的單倍群對家馬的起源有貢獻(xiàn)，進(jìn)一步證明家馬有多個(gè)母系起源.

圖4 23個(gè)品種cytb基因的網(wǎng)絡(luò)聚類圖

3 討論

3.1 建昌馬和安寧果下馬cytb基因多態(tài)性

mtDNA是哺乳動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，具有進(jìn)化速度快、無組織特異性、遵循母系遺傳、在種間和種內(nèi)都有豐富的遺傳多樣性的特點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)，與mtDNA D-loop區(qū)的變異速度快相比，cytb基因的變異速度適中，可作為研究物種間遺傳進(jìn)化[14]的合適標(biāo)記.

遺傳多樣性是群體內(nèi)不同個(gè)體的變異總和，是生物多樣性的重要組成部分，而單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量一個(gè)群體變異程度的重要指標(biāo)，也能反映出群體對環(huán)境的適應(yīng)能力.本研究在44匹馬的cytb基因中發(fā)現(xiàn)45個(gè)變異位點(diǎn)，無插入缺失，大部分為轉(zhuǎn)換，A+T含量高于C+G，具有一定的偏倚性，符合cytb基因進(jìn)化的特點(diǎn).在40匹建昌馬和4匹安寧果下馬中分別鑒定出19個(gè)和4個(gè)單倍型，其中7個(gè)為共享單倍型.在西南馬系統(tǒng)中，建昌馬的單倍型多樣性(0.894)和核苷酸多樣性(0.00499)處于一個(gè)較高的水平，說明建昌馬具有較大的群體多態(tài)性，而相對于巴里坤馬、蒙古馬、大通馬和哈薩克馬略低，提示中國家馬北方品種cytb基因多樣性高于南方品種.總體而言，從單倍型多樣性和核苷酸多樣性來看，建昌馬和安寧果下馬都具有豐富的遺傳多樣性.

3.2 建昌馬和安寧果下馬母系遺傳進(jìn)化分析

對關(guān)中馬、貴州馬、哈薩克馬和矮馬等品種cytb基因[15-16]分析發(fā)現(xiàn)，它們都是多母系起源，與mtDNA D-loop區(qū)[17-18]的分析結(jié)果一致.本研究以兩個(gè)品種cytb基因界定的20個(gè)單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可將20個(gè)單倍型分布在7個(gè)支系中，其中A支系存在7種單倍型共19條序列，約占總樣品數(shù)的43.18%，安寧果下馬特有的單倍型H20也在A支系中.通過分析建昌馬和安寧果下馬與其他21個(gè)品種的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，建昌馬與青海馬類群(柴達(dá)木馬、玉樹馬)和西南馬類群(寧強(qiáng)馬和安寧果下馬)的遺傳距離較小.與大通馬的遺傳距離較近可能是由于大通馬在西南山地馬的改良工作中有重要作用有關(guān)；建昌馬與柴達(dá)木馬的遺傳距離最小(0.0036)，提示建昌馬和柴達(dá)木馬親緣關(guān)系近，在體型上柴達(dá)木馬和建昌馬都是體型較小的馬品種，同屬于山地馬種，推測建昌馬在進(jìn)化過程中受到青海馬的影響，或許有共同的母系起源，這可能與西南馬來源于青海馬有關(guān)[19].建昌馬與安寧果下馬的遺傳距離為0.0043，處于一個(gè)較近的親緣關(guān)系范圍，這與周凡莉等[10]對建昌馬的mtDNA D-loop區(qū)研究結(jié)果相似；不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)建昌馬與關(guān)中馬的遺傳距離相對較大，而周凡莉等[10]在建昌馬mtDNA D-loop區(qū)的結(jié)果表明建昌馬與關(guān)中馬遺傳距離最小，這或許與分析時(shí)選擇的關(guān)中馬mtDNA D-loop參考序列的數(shù)量有關(guān).

23個(gè)馬品種cytb序列的網(wǎng)絡(luò)聚類圖顯示，100個(gè)單倍型分別以Hap1、Hap2、Hap3、Hap15和Hap18為中心發(fā)散形成不同的單倍群，建昌馬分布在A-G共7個(gè)單倍群中，與單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果一致，提示建昌馬有多個(gè)母系起源，其中B單倍群只包含建昌馬的兩個(gè)單倍型，也是建昌馬特有的單倍型，而安寧果下馬只分布在A、F和G三個(gè)單倍群中，這可能與試驗(yàn)的樣品數(shù)少有關(guān).A單倍群在整個(gè)分布中占主要部分，是家馬廣泛存在的類型，除B單倍群外，其余單倍群都由不同品種的馬構(gòu)成，提示不同品種的馬之間存在基因交流.本研究出現(xiàn)1匹建昌馬的cytb序列與NCBI中1匹普氏野馬(DQ223534)的序列完全相同，此外，在河曲馬、利川馬、焉耆馬和蒙古馬中也有相同發(fā)現(xiàn)，這使建昌馬和上述馬與普氏野馬共同分布在A單倍群中；除個(gè)別參考序列少的品種，其他品種均擁有Hap1單倍型，推測Hap1可能是家馬古老的單倍型.綜上，建昌馬和安寧果下馬均具有多個(gè)母系起源，二者可能有較近的親緣關(guān)系.

4 結(jié)論

建昌馬和安寧果下馬mtDNAcytb基因具有豐富的遺傳多樣性，且建昌馬有多個(gè)母系起源.通過不同品種間遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)建昌馬與柴達(dá)木馬的親緣關(guān)系最近，與安寧果下馬的親緣關(guān)系較近；從母系角度分析，推測建昌馬與柴達(dá)木馬有共同的母系起源.