牙髓干細(xì)胞來源凋亡小體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化及炎癥反應(yīng)

宮晟凱，楊曉姍，竇庚，李子涵，劉思穎，王瑋，劉世宇

1.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安（710032）；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院組織工程中心，陜西 西安（710032）；3.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西 西安（710032）

近年來，口腔組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在炎癥調(diào)節(jié)及組織再生中得到了廣泛的應(yīng)用［1-2］，其中，牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）因具有高增殖活性、多項(xiàng)分化潛能［3］以及免疫調(diào)節(jié)能力［1］，成為細(xì)胞移植治療的重要細(xì)胞來源。細(xì)胞移植入宿主體內(nèi)可通過分化和釋放活性因子發(fā)揮治療作用。然而，細(xì)胞移植治療的機(jī)制，尤其是細(xì)胞移植后在宿主組織中的高比例、迅速的凋亡［4-6］和其產(chǎn)生療效之間的“矛盾現(xiàn)象”尚未闡明。細(xì)胞凋亡過程中可釋放一種特殊的細(xì)胞外囊泡即凋亡小體（apoptotic bodies，ABs），前期研究發(fā)現(xiàn)ABs不僅是細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的廢物，還可調(diào)控機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)［7］、代謝穩(wěn)態(tài)［8］、以及組織再生過程中的血管化［6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察DPSCs在凋亡過程中釋放的ABs對(duì)巨噬細(xì)胞極化和炎性因子釋放的影響，并利用小鼠皮膚創(chuàng)傷模型和葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎模型，探討ABs對(duì)炎癥調(diào)節(jié)和組織再生的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)人DPSCs的使用以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均已得到了第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)以及第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1 DPSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

采用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，并將得到的人牙髓干細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清（Gibco，美國）、2 mM L-谷氨酰胺（Invitrogen，美國）和1%青霉素-鏈霉素（Invitrogen，美國）的α-MEM（Gibco，美國）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第3代或第4代細(xì)胞。

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DPSCs表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，包括PE標(biāo)記的CD90（eBioscience，美國）、CD105（BioLegend，美國）、CD45（BioLegend，美國）和FITC標(biāo)記的CD73（BioLegend，美國）、HLA-DR（eBioscience，美國）。用CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）進(jìn)行檢測(cè)。另外，對(duì)DPSCs進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)、成脂分化能力檢測(cè)（油紅O染色）以及成骨分化檢測(cè)（茜素紅S染色）。

1.2 DPSCs來源的ABs的分離提取及鑒定

DPSCs增殖到80%～90%時(shí)，加入0.1μM凋亡誘導(dǎo)劑星孢菌素（Cell Signaling Technology，美國）作用12 h。收集上清液，800 g離心10 min，去除沉淀，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，16 000 g離心30 min收集沉淀即為ABs。通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和動(dòng)態(tài)光散射分析（dynamic light scattering，DLS）觀察ABs的形態(tài)及粒徑分布。使用凋亡檢測(cè)試劑盒（七海生物，中國）檢測(cè)ABs表面Annexin V陽性率，使用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）進(jìn)行分析量化。

1.3 骨髓來源巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及分組

取C57BL/6小鼠股骨、脛骨，用預(yù)冷PBS沖洗骨髓腔獲得骨髓單細(xì)胞懸液。添加巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF，Peprotech，美國）（20 ng/mL），接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。體外實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、LPS組以及LPS+ABs組，分別對(duì)巨噬細(xì)胞施加溶劑對(duì)照處理、LPS處理、LPS+ABs共處理。

1.4 小鼠皮膚創(chuàng)傷模型的建立及分組

C57BL/6小鼠創(chuàng)面大小為直徑1 cm的圓形。將小鼠分為3組，分別為PBS組、DPSCs組以及ABs組，分別于0 d和3 d通過尾靜脈注射DPSCs單細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/mL），或DPSCs來源的ABs（200 μg/只），每只小鼠注射總量為100μL，PBS組注射等體積的PBS緩沖液。

1.5 葡萄糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立及分組

將雌性C57BL/6小鼠連續(xù)10 d通過飲水給予2.5%（w/v）的DSS（MPBiomedicals，美國）。將小鼠分為PBS組、DPSCs組以及ABs組，分別于3 d、5 d和7 d對(duì)小鼠尾靜脈注射DPSCs單細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/mL）或DPSCs來源的ABs（200μg/只），每只小鼠注射總量為100μL，PBS組注射等體積的PBS緩沖液。

1.6 Western blot檢測(cè)凋亡通路蛋白Caspase-3裂解片段的表達(dá)

使用Bio-Rad電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃過夜孵育一抗工作液（1∶800）（Caspase-3，9662，Cell Signaling Technology；Cleaved Caspase-3，9661s，Cell Signaling Technology；GAPDH，30201ES20，YEASEN）。TBST洗膜3次，室溫孵育二抗1 h。TBST洗膜3次后，加入顯影液，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)曝光成像（Tanon4600，中國）。

1.7 免疫熒光染色觀察ABs內(nèi)吞與巨噬細(xì)胞M2型極化

收集細(xì)胞爬片/組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，4%多聚甲醛溶液4℃固定過夜。置于0.1%Triton X-100溶液室溫通透細(xì)胞/組織15 min，山羊血清封閉30 min（37℃），過夜孵育一抗工作液（1：400）（F4/80，ab6640，Abcam；CD206，ab125028，Abcam）。PBS洗3次，37℃孵育熒光二抗1 h，PBS洗3次，Hoechst（Sigma-Aldrich，美國）染核10 min，PBS洗3次，80%甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡成像，拍照。

1.8 ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清及皮膚組織勻漿中細(xì)胞因子水平

細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品制備：收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，4 000 rpm離心10 min去除沉淀。皮膚組織勻漿制備：取適量皮膚組織，用預(yù)冷PBS清洗后剪碎，將組織塊轉(zhuǎn)移入勻漿機(jī)（IKA，美國）進(jìn)行充分研磨，得到的勻漿液用超聲破碎儀進(jìn)一步破碎。按照ELISA試劑盒（欣博盛，中國）說明書操作步驟操作，并以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)吸光度值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、TGF-β）的濃度。

1.9 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）與組織學(xué)病理評(píng)分

DAI評(píng)分為體重下降分?jǐn)?shù)、糞便性狀分?jǐn)?shù)和便血分?jǐn)?shù)的總和，總分為12分，分值越大代表疾病越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取結(jié)腸組織，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并進(jìn)行H&E染色，按照炎癥浸潤(rùn)和上皮損傷程度進(jìn)行組織學(xué)病理評(píng)分（histological activity index）。具體評(píng)分如下：炎癥浸潤(rùn)嚴(yán)重程度＝0分（無），1分（輕度），2分（中度），3分（重度）；炎癥浸潤(rùn)程度＝0分（無），1分（黏膜），2分（黏膜及黏膜下層）3分（透過黏膜）；隱窩損傷＝0分（無），1分（杯狀細(xì)胞少量損失），2分（杯狀細(xì)胞大量損失），3分（杯狀細(xì)胞的大量損失，隱窩少量損失），4分（杯狀細(xì)胞完全損失，隱窩大量損失）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。Graph-Pad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以Tukey進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 DPSCs及其來源的ABs的分離鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)純化后的DPSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD90（99.8%）、CD73（99.5%）和CD105（95.8%），而不表達(dá)HAL-DR和CD45（圖1a）。另外，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DPSCs的克隆形成能力和多向分化能力。培養(yǎng)14 d后，可以觀察到藍(lán)紫色細(xì)胞克隆（圖1b）。DPSCs成脂誘導(dǎo)后進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下可觀察到紅色脂滴（圖1c），經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的茜素紅染色顯示明顯的礦化結(jié)節(jié)（圖1d）。以上結(jié)果說明分離培養(yǎng)的DPSCs表面標(biāo)志物符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征，并具有成脂和成骨分化潛能。

DPSCs來源的ABs的掃描電鏡結(jié)果顯示ABs形貌成球狀（圖1e），粒徑分布范圍在300～900 nm區(qū)間內(nèi)，平均直徑為（634.3±42.4）nm（圖1f）。另外，凋亡分子Annexin V陽性表達(dá)率在70%以上（圖1g）。Western blot結(jié)果顯示ABs中凋亡通路重要分子Caspase-3的裂解片段（Cleaved Caspase-3）表達(dá)明顯高于DPSCs（圖1h）。以上結(jié)果表明，誘導(dǎo)并分離提取DPSCs來源的ABs成功。

Figure 1 Isolation and identification of dental pulp stem cells and dental pulp stem cells-derived apoptotic bodies圖1 牙髓干細(xì)胞及其來源的凋亡小體的分離鑒定

2.2 DPSCs來源的ABs對(duì)炎性巨噬細(xì)胞的影響

通過LPS（1μg/mL）刺激巨噬細(xì)胞建立炎性巨噬細(xì)胞模型，將PKH26預(yù)標(biāo)記的ABs加入炎性巨噬細(xì)胞中共培養(yǎng)3 h，可以觀察到ABs顯著的內(nèi)吞現(xiàn)象（圖2a），表明ABs能夠被炎性巨噬細(xì)胞吞噬。為了進(jìn)一步證明ABs對(duì)炎性巨噬細(xì)胞的影響，將ABs（25μg/mL）加入炎性巨噬細(xì)胞中共培養(yǎng)24 h后檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型分布。熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入LPS后炎性巨噬細(xì)胞中抗炎表型CD206陽性分群顯著減少（P＝0.005）；ABs作用后，顯著增加了巨噬細(xì)胞中抗炎表型的比例（P＜0.001）（圖2b）。LPS組TNF-α和IL-6的水平較高，TGF-β的水平較低；與LPS組相比，LPS+ABs組TNFα、IL-6水平顯著降低（P＜0.001，P＝0.005），TGFβ水平顯著升高（P＜0.001）（圖2c）。

Figure 2 Influence of apoptotic bodies on the phenotype of inflammatory macrophages圖2 凋亡小體對(duì)炎性巨噬細(xì)胞表型的影響

2.3 DPSCs來源的ABs促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合

為了探討DPSCs釋放的ABs對(duì)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，首先建立了小鼠背部皮膚創(chuàng)傷模型，并于0 d和3 d分別通過尾靜脈注射DPSCs或DPSCs來源的ABs，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程如圖3a所示。

皮膚創(chuàng)面愈合的大體照片顯示，與PBS組相比，DPSCs和ABs注射組小鼠創(chuàng)面愈合的速度明顯加快（圖3b）。Image J對(duì)愈合率的分析結(jié)果顯示，第7天和第12天時(shí)，DPSCs組和ABs組愈合情況相比于PBS組均有顯著性差異（圖3c：第7天DPSCs組P＝0.011，ABs組P＝0.014；第12天DPSCs組P＝0.026，ABs組P＝0.041）。另外，實(shí)驗(yàn)全程各組小鼠體重均無顯著差異（圖3d）。ELISA結(jié)果顯示，與PBS組相比，DPSCs組和ABs組TNF-α（DPSCs組P＝0.002，ABs組P＝0.002）和IL-6（DPSCs組P＜0.001，ABs組P＝0.002）顯著降低，TGF-β則明顯升高（DPSCs組P＜0.001，ABs組P＝0.002）（圖3e）。局部皮膚組織切片熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DPSCs組和ABs組的CD206陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（DPSCs組P＝0.005，ABs組P＝0.001）（圖3f）。以上結(jié)果說明了DPSCs來源的ABs植入體內(nèi)后可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞表型促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。

Figure 3 Effect of apoptotic bodies derived from dental pulp stem cells on skin wound healing in mice圖3 牙髓干細(xì)胞來源凋亡小體對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響

2.4 DPSCs來源的ABs對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用

進(jìn)一步選擇了另一種炎癥相關(guān)疾病模型即DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，觀察DPSCs來源的ABs是否對(duì)結(jié)腸炎發(fā)揮炎癥調(diào)控作用。在誘導(dǎo)模型建立的第3 d、第5 d和第7 d分別通過尾靜脈注射DPSCs或DPSCs來源的ABs，10 d后取材，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程圖如圖4a所示。

各組小鼠體重統(tǒng)計(jì)顯示，PBS組小鼠體重下降最多，而DPSCs組和ABs組小鼠體重則顯著高于PBS組（圖4b；DPSCs組P＝0.010，ABs組P＝0.020）。疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）結(jié)果顯示，與PBS組相比，DPSCs和ABs注射組小鼠DAI顯著降低，代表疾病癥狀明顯減輕（圖4c，DPSCs組P＜0.001，ABs組P＝0.002）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取結(jié)腸組織，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并進(jìn)行H&E染色。結(jié)果顯示，PBS組小鼠結(jié)腸隱窩破壞，同時(shí)出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)和結(jié)腸上皮明顯損傷（圖4d）。DPSCs和ABs注射組的結(jié)腸組織病理評(píng)分則顯著下降，與PBS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4d；P＜0.001）。結(jié)腸長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，DPSCs和ABs注射組的結(jié)腸長(zhǎng)度明顯大于PBS組（圖4e；DPSCs組P＜0.001，ABs組P＝0.002）。結(jié)腸組織熒光染色顯示，與PBS組相比，DPSCs組和ABs組的CD206陽性細(xì)胞數(shù)量顯著升高（圖4f；DPSCs組P＜0.001，ABs組P＝0.002）。

Figure 4 The protective effect of apoptotic bodies derived from dental pulp stem cells on DSS-induced colitis mice圖4 牙髓干細(xì)胞來源凋亡小體對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用

3討論

MSCs移植是實(shí)現(xiàn)炎癥有效調(diào)節(jié)和組織再生的重要手段，目前已有多種基于MSCs的細(xì)胞治療方式在進(jìn)行大動(dòng)物有效性研究及臨床試驗(yàn)。然而，MSCs移植實(shí)現(xiàn)廣泛臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)是明確其療效發(fā)揮的機(jī)制。以往研究認(rèn)為植入宿主的MSCs能夠完成多向分化及多種因子的釋放，而隨后的研究認(rèn)為移植的大多數(shù)細(xì)胞并不會(huì)在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡的釋放是細(xì)胞間相互作用的重要媒介［9］，并且在細(xì)胞移植產(chǎn)生的療效中發(fā)揮重要作用［10］。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞釋放到胞外、具有膜結(jié)構(gòu)、并包含多種信號(hào)分子的囊泡，主要包括外泌體、微泡、ABs等，其大小、內(nèi)容物和生物學(xué)功能均具有一定差異［11］。本實(shí)驗(yàn)基于前期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞移植后廣泛凋亡的現(xiàn)象［4-5］，并基于前期課題組發(fā)現(xiàn)的ABs的新生物學(xué)功能［7-8］，證明了DPSCs在凋亡過程中釋放的ABs具有調(diào)節(jié)炎癥和促進(jìn)組織再生的功能，拓展了細(xì)胞外囊泡新功能研究，并提出了牙源性干細(xì)胞移植治療的新機(jī)制。

人體內(nèi)每天有大量的細(xì)胞發(fā)生凋亡，為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，需要有迅速而有效的清除凋亡細(xì)胞以及凋亡相關(guān)細(xì)胞外囊泡的機(jī)制，其中巨噬細(xì)胞是發(fā)揮此作用的關(guān)鍵細(xì)胞［12］。細(xì)胞凋亡不僅在發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，也可在組織損傷過程中釋放關(guān)鍵信號(hào)，誘導(dǎo)組織再生，提示凋亡現(xiàn)象和再生過程具有密切聯(lián)系［13］。本實(shí)驗(yàn)分離鑒定了DPSCs來源的ABs，發(fā)現(xiàn)其基本特征與其他類型細(xì)胞釋放的ABs類似，并且在體外能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，提示其可能對(duì)巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。巨噬細(xì)胞的極化受多種微環(huán)境調(diào)控，在組織再生及炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［14］。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠皮膚創(chuàng)面愈合模型和結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)DPSCs來源的ABs能夠在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯著增加CD206陽性細(xì)胞數(shù)量，提示其能夠促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。巨噬細(xì)胞極化與多種組織再生密切相關(guān)，因此調(diào)控巨噬細(xì)胞極化可促進(jìn)多種組織再生，成為促進(jìn)組織再生的重要手段。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ABs可通過促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化調(diào)控機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)和代謝穩(wěn)態(tài)［8］。因此，筆者推測(cè)在其他炎性微環(huán)境中，ABs同樣可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化并促進(jìn)組織再生。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPSCs來源的ABs通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮抗炎效果，提示牙源性干細(xì)胞的ABs移植可作為調(diào)控巨噬極化的新策略。細(xì)胞外囊泡功能的發(fā)揮可依賴于多種機(jī)制，包括其內(nèi)部的信號(hào)分子的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)以及其表面的受體分子［15］，還可能依賴于其內(nèi)部分子在胞外的釋放。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DPSCs來源ABs可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，然而其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。