轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗后代農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的表現(xiàn)

曾許鵬，?？∑妫?，Mahmood Aamir，陳炯宇，邢永秀，李楊瑞，3

（1.廣西大學農(nóng)學院，廣西 南寧 530004；2.玉林師范學院，廣西 玉林 537000；3.中國農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究中心/廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007）

0 引言

甘蔗是世界上最主要的糖料作物，我國的食糖總產(chǎn)量中有90%以上是來自蔗糖，而中國食糖總產(chǎn)量中則有60%以上的蔗糖產(chǎn)量來自廣西［1-3］。甘蔗新品種是糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎，引進、選育甘蔗新品種、開展甘蔗基因克隆及轉(zhuǎn)基因育種是增加甘蔗種質(zhì)資源和強化種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。采用傳統(tǒng)的甘蔗雜交育種是選育甘蔗優(yōu)良品種的重要途徑，但傳統(tǒng)甘蔗雜交育種周期長，人力物力耗費量大。同時，甘蔗是多倍體單子葉植物，遺傳背景復雜，雜交育種有時會出現(xiàn)某些性狀劣質(zhì)基因連鎖現(xiàn)象。因此，僅通過常規(guī)的雜交聚合各種甘蔗優(yōu)良性狀比較困難［4］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可對作物部分性狀進行定向改良，能避免雜交育種過程出現(xiàn)的大量基因重組問題，可以在很大程度上縮短育種時間，為培育具有優(yōu)良性狀甘蔗品種和高產(chǎn)高糖育種提供了有利手段［5-6］。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUT）負責蔗糖的跨膜運輸，在韌皮部介導的源—庫蔗糖運輸和庫器官的蔗糖供給中起著關(guān)鍵作用。在甘蔗葉片韌皮部，蔗糖的裝載主要是在質(zhì)外體中進行，蔗糖在質(zhì)外體中的介導需要細胞膜的參與［7］，而SUT在植物細胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)導蔗糖向韌皮部裝載的過程中起著非常重要的作用［8-9］。SUT與甘蔗蔗糖代謝密切相關(guān)，其編碼的蛋白質(zhì)具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性［10］。但是，SoSUT5基因的功能還不清楚，通過轉(zhuǎn)基因并對其甘蔗后代的農(nóng)藝性狀及品質(zhì)進行分析研究，可能為探討其功能提供參考依據(jù)。SUT在植物生長和發(fā)育的過程中對蔗糖的運輸和積累起著非常重要的作用。Riesmeier等首次從菠菜中克隆得到了第一個SUT蛋白，并證實了植物體內(nèi)SUT的存在［11］。目前，已經(jīng)從不同的甘蔗品種中克隆出了不同的SUT基因ShSUT4［12］、SoSUT1、SoSUT2、SoSUT3和SoUT5［13］，并對基因的相關(guān)功能進行了初步研究。相關(guān)聚類分析表明，蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白分為SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5共5個亞族［14］，不同的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因行使著不同的功能，同一蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在不同的部位和不同生長階段的表達量不同，對植物作用效果也不相同［15］。相關(guān)研究表明，將水稻中的OsSUT5轉(zhuǎn)化到馬鈴薯后，轉(zhuǎn)基因植株的淀粉和產(chǎn)量都比對照高［16］。本課題組?？∑媸状螐母收嶂锌寺～@得SoSUT5基因，并通過轉(zhuǎn)SoSUT5酵母的生長特性分析及SoSUT5基因表達與甘蔗糖分相關(guān)性分析證明SoSUT5基因能編碼有功能的SoSUT5蛋白，并參與植物糖分的積累和代謝調(diào)控［10］。B8是巴西推廣應用面積較大的糖能兼用甘蔗品種，其田間表現(xiàn)為出苗率高和宿根發(fā)株率高，分蘗力強，但蔗糖分相對比ROC22等甘蔗品種低［17］。Manickavasagam等利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將Bar基因?qū)敫收嶂校@得抗Basta除草劑甘蔗植株［18］。趙文慧通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將SoSUT5基因轉(zhuǎn)入低糖甘蔗品種B8，經(jīng)抗性篩選和檢測獲得了轉(zhuǎn)SoSUT5基因各陽性單株（T0代）［19］。王露蓉分析了轉(zhuǎn)SoSUT5基因B8的第一代（T1）株系成熟期甘蔗+1葉葉面積、莖徑、株高和蔗莖中部可溶性總糖，發(fā)現(xiàn)SoSUT5基因在甘蔗中過表達可在一定程度上促進甘蔗生長，提高蔗莖中部的可溶性總糖含量［20］。本研究于2018年至2019年分別調(diào)查了轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗在T2和T3的部分農(nóng)藝性狀，測定了他們在T2、T3、T2R1、T2R2時的部分甘蔗品質(zhì)，從表型上觀察甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后甘蔗在第二代新植蔗（T2）、第三代新植蔗（T3）、第二代第一季宿根蔗（T2R1）和第二代第二季宿根蔗（T2R2）的生長、農(nóng)藝性狀、蔗莖出汁率、蔗汁重力純度、蔗糖分積累等方面的表現(xiàn)情況，為轉(zhuǎn)基因甘蔗研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為從本課題組T1代轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗B8中經(jīng)檢測篩選出性狀較好的4個轉(zhuǎn)基因甘蔗株系（L1、L2、L3和L6），對照與轉(zhuǎn)基因甘蔗為同一批次組培苗后代的非轉(zhuǎn)基因野生型（WT）甘蔗B8株系［20］。所使用的肥料為金正大公司生產(chǎn)的控釋參混復合肥（N-P2O5-K2O=22-8-12），總養(yǎng)分大于等于42%。

1.2 甘蔗材料種植

試驗于2018年3月至2019年12月在廣西大學甘蔗資源圃內(nèi)進行（N22°50′，E108°17′），地處亞熱帶季風季候，每年的降雨量主要集中在6~8月。試驗地為旱地，紅壤土，地勢平坦，肥力中等，前季作物是甘蔗。對照和各轉(zhuǎn)基因品系甘蔗分別單行種植，同行排列，行長13m，行距1.2m。選擇健康的甘蔗，砍成雙芽段，經(jīng)52℃處理4h后，再用50%多菌靈可稀釋粉劑800倍液浸種15min后下種。蔗種行雙行品字形排列，下種量為80芽/行。甘蔗兩側(cè)撒施復合肥（1200kg/hm2）及防治低下害蟲農(nóng)藥。覆5~10cm土層蓋種，蓋上厚度為0.005~0.008mm地膜后噴施“甲·滅·敵草隆”選擇性除草劑。第二代新植蔗（T2）于2018年3月15日、第三代新植蔗（T3）于2019年3月17日進行種植。試驗分別于2018年6月25日和2019年6月30日進行大培土。T2每行甘蔗于2019年1月30日砍除掉行長為6.5m的甘蔗后及時進行蔗園清理，留作宿根蔗（T2R1）栽培，余下的6.5m甘蔗作為第二代第二次宿根蔗（T2R2）栽培。第二代第一次宿根蔗（T2R1）和第二次宿根蔗（T2R2）于2019年3月20日進行開壟松兜，于4月16日與新植蔗施同量復合肥及農(nóng)藥后進行大培土。

1.3 甘蔗農(nóng)藝性狀和品質(zhì)的測定

1.3.1 新植蔗出苗數(shù)、分蘗苗數(shù)、黑穗病苗數(shù)調(diào)查

試驗分別在2018年4月28日和2019年4月30日調(diào)查甘蔗的出苗數(shù)，在2018年6月11日和2019年6月30日調(diào)查甘蔗的分蘗苗數(shù)及黑穗病發(fā)病苗數(shù)，并分別計算出苗率、分蘗率和黑穗病發(fā)生率。甘蔗黑穗病發(fā)病苗數(shù)調(diào)查后，對黑穗病株及時套袋砍除清理。出苗率=出苗出土總數(shù)/下種總芽數(shù)×100%，分蘗率=分蘗苗數(shù)/總苗數(shù)×100%，分蘗苗數(shù)=當期總苗數(shù)-主莖苗數(shù)，黑穗病發(fā)生率=黑穗病苗數(shù)/當期總苗數(shù)×100%。

1.3.2 莖徑、株高、有效莖數(shù)調(diào)查

于每年甘蔗的成熟期時隨機選取15株健康主苗作為觀測株進行莖徑和株高的調(diào)查。

1.3.3 單莖重調(diào)查和甘蔗品質(zhì)的測定

試驗分別于每年甘蔗成熟期時進行采樣，采樣時選擇無黑穗病癥狀和無蟲害的健康甘蔗植株，統(tǒng)一砍除掉+6葉所對應蔗莖節(jié)的上半部分，取下半部分進行甘蔗品質(zhì)的測定［21］。每個品系每次隨機選取6株稱重后，送廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所進行甘蔗品質(zhì)的測定。T2進行3次甘蔗的單莖重調(diào)查和品質(zhì) 測 定（2018/11/19、2018/12/25、2019/01/26），T3、T2R1和T2R2進行2次甘蔗的單莖重調(diào)查和品質(zhì)測定（2019/11/18、2019/12/11）。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Excel 2003軟件進行試驗數(shù)據(jù)的整理，運用Spss 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 T2、T3代新植蔗出苗率、分蘗率及黑穗病發(fā)病情況比較

從表1可以看出，轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗的出苗率、分蘗率和黑穗病發(fā)生率總體均值上與WT出現(xiàn)較大差異，但在T2和T3時趨勢相同。轉(zhuǎn)基因甘蔗出苗率均比非轉(zhuǎn)基因甘蔗低；分蘗率除L6比WT低之外，其余的三個轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2和L3均比WT的高；轉(zhuǎn)基因甘蔗的黑穗病發(fā)生率明顯比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高，特別是L6轉(zhuǎn)基因甘蔗品系，其黑穗病發(fā)生率是WT的2倍以上。各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系，結(jié)果能得到重演。綜上可見，甘蔗B8中轉(zhuǎn)進SoSUT5基因?qū)Ω收岢雒缏?、分蘗率及黑穗病發(fā)病率等農(nóng)藝性狀影響非常大，不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系表現(xiàn)不同。

表1 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2和T3代新植蔗出苗率、分蘗率及黑穗病發(fā)病情況

2.2 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2和T3代新植蔗的莖徑、株高、單莖重、有效莖數(shù)產(chǎn)量構(gòu)成因素

從表2中可以看出，與非轉(zhuǎn)基因甘蔗相比，4個轉(zhuǎn)基因品系甘蔗的莖徑在T2和T3時表現(xiàn)相同，總體均值明顯小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，差異顯著（P＜0.05，下同），其中L6的莖徑與非轉(zhuǎn)基因甘蔗的差異最大，相差17.22%；而L1、L2和L3分別與WT相差12.91%、12.44%和13.88%。同樣，各轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的莖徑小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，以L6的最小。轉(zhuǎn)基因甘蔗的株高均值稍低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，但差異并不顯著。轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重比非轉(zhuǎn)基因甘蔗的低，其中L1、L2、L3和L6分別比WT小30.2%、30.1%、28.7%和29.4%。不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗分別在T2、T3、T2R1和T2R2時的單莖重同樣表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因甘蔗小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗?？傮w上，轉(zhuǎn)基因甘蔗的有效莖數(shù)比非轉(zhuǎn)基因甘蔗有效莖數(shù)多，轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2和L3的有效莖數(shù)分別比非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT多34.2%、31.7%和26.2%，而L6與WT的差別不大，且T2和T3表現(xiàn)一致。綜上可見，甘蔗品種B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后會使甘蔗的莖徑變小，單莖重降低，有效莖數(shù)大多增加，但對甘蔗的株高影響不明顯。

表2 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2和T3代新植蔗成熟期的莖徑、株高、單莖重和有效莖數(shù)

2.3 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2、T3代新植蔗、T2代第一季宿根蔗及T2代第二季宿根蔗成熟期甘蔗品質(zhì)比較

甘蔗蔗汁糖分是蔗糖分最重要的決定性因素。由表3可知，總體上在成熟期時相同的轉(zhuǎn)基因甘蔗品系蔗汁糖分有所變化，各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的蔗汁糖分均低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗。T2、T3、T2R1和T2R2各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的甘蔗蔗汁糖分總體均值上要比非轉(zhuǎn)基因甘蔗的低5%以上，其中以L1的最低。

表3 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁蔗糖分

由表4可知，與甘蔗蔗汁蔗糖分類似，非轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗渣蔗糖分總體上要比各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系高。不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的蔗渣蔗糖分有所差別，但L3和L6的比L1和L2的高。

表4 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗渣蔗糖分

由表5可知，成熟期甘蔗蔗糖分總體上表現(xiàn)為各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系較非轉(zhuǎn)基因甘蔗低，但不同品系蔗糖分降低幅度有所差別。在T2時，非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高38.9%、40.0%、19.8%和13.7%；在T3時，非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高35.6%、51.0%、49.5%和43.4%；在T2代宿根蔗，非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高18.8%、24.0%、14.5%和5.2%；在T2R2時，非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別提高26.9%、27.3%、23.2%和16.0%。

表5 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗糖分

從2年的研究數(shù)據(jù)結(jié)果表6來看，各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系甘蔗的出汁率除L1在T2代第一季宿根蔗時低于WT外，其余轉(zhuǎn)基因甘蔗品系在不同年份和不同的月份時都比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高，說明甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后甘蔗能增加新植蔗的甘蔗蔗汁含量，與不同轉(zhuǎn)基因品系降低蔗莖的蒲心程度表現(xiàn)一致。

表6 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的出汁率

蔗汁重力純度測定數(shù)據(jù)結(jié)果表7顯示，不同年份和不同月份下非轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁重力純度都比各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系蔗汁重力純度高，其中與L1、L2相差較大，而與L3、L6相差較小。

表7 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁重力純度

3 討論

前人已經(jīng)從甘蔗中克隆獲得了SoSUT5基因，并證明了SoSUT5基因參與植物糖分的積累和代謝［10］。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將SoSUT5基因轉(zhuǎn)入甘蔗中，獲得了SoSUT5基因陽性甘蔗單株T0［19］；隨后又對T1代轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗的部分農(nóng)藝性狀和相關(guān)生理生化特性進行研究［20］，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SoSUT5基因在T1代甘蔗中過表達時一定程度上促進了甘蔗的生長，提高蔗莖的可溶性總糖含量。本研究在這些研究的基礎上分別觀察其T2、T3、T2R1和T2R2時甘蔗農(nóng)藝性狀、抗病性和品質(zhì)等各方面的綜合表現(xiàn)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因的后代性狀發(fā)生了一系列改變，各轉(zhuǎn)基因甘蔗的出苗率均低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，而分蘗率大多高于對照。出苗率對甘蔗收獲時的有效莖數(shù)影響很大，是甘蔗蔗莖產(chǎn)量形成的重要基礎。前人在對轉(zhuǎn)抗除草劑Bar基因甘蔗試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的出苗率均低于對照植株，部分轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的分蘗率高于對照，認為Bar基因的導入影響甘蔗的生長，主要表現(xiàn)在出苗率降低，對其他農(nóng)藝性狀影響較?。?2］。本研究所使用的轉(zhuǎn)基因甘蔗原始材料是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將攜帶有選擇標記基因Bar的pUBTC-SoSUT5表達載體整合到甘蔗B8中，很可能受甘蔗中導入Bar的影響。王繼華等認為，在甘蔗中導入外源基因容易使甘蔗農(nóng)藝性狀發(fā)生改變，甚至會使部分優(yōu)良性狀喪失，影響甘蔗的產(chǎn)量。在本研究中，轉(zhuǎn)基因甘蔗的黑穗病發(fā)病率明顯比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高，轉(zhuǎn)基因甘蔗抗病性減弱［22］。相關(guān)研究表明，植物與病原物互作的抗性反應受自身的遺傳基礎決定［23］，植物抗病與觸發(fā)特定信號轉(zhuǎn)導通路網(wǎng)相關(guān)［24］。在寄主受病原物感染時，細胞表面分子把信號傳遞至細胞內(nèi)，并觸發(fā)一系列生理生化反應，從而改變寄主體內(nèi)的代謝活動，提高對病原物的抵抗作用［25］。甘蔗遺傳背景的復雜性，其抗病性受多基因共同調(diào)控，防御機制和能力因不同甘蔗品種而異［26］。本研究中轉(zhuǎn)基因甘蔗抗病性減弱很可能是受到了基因遺傳基礎發(fā)生改變的影響所致。使用攜帶甘蔗黑穗病菌的蔗種進行種植，在甘蔗生長過程中如果主莖黑穗病發(fā)病較晚沒有長出黑鞭或不發(fā)病，對莖粗的影響很?。?7］。本研究中甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后莖徑也發(fā)生了變化，轉(zhuǎn)基因甘蔗的莖徑均小于對照，這與前人的研究結(jié)果類似［22］。

甘蔗的單莖重主要是由莖徑、株高和蔗汁含量決定的。在本研究中，轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重都小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，而轉(zhuǎn)基因甘蔗的出汁率卻均比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高?？梢?，在株高相差不大的情況下轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗，這主要受轉(zhuǎn)基因甘蔗的莖徑變小的影響。甘蔗單位面積內(nèi)的有效莖數(shù)往往取決于下種量、出苗率和分蘗率，與前期甘蔗的群體質(zhì)量有很大的關(guān)系［28］。甘蔗生長前期的農(nóng)藝性狀質(zhì)量，會直接影響甘蔗的產(chǎn)量形成。在本研究中，轉(zhuǎn)基因甘蔗的出苗率較非轉(zhuǎn)基因低，但除L6外有效莖數(shù)與分蘗率都較非轉(zhuǎn)基因甘蔗高。

在本研究中，轉(zhuǎn)基因甘蔗T2、T3、T2R1和T2R2總體生長狀況和甘蔗蔗糖分均顯著較非轉(zhuǎn)基因甘蔗表現(xiàn)差，推測SoSUT5基因可能對甘蔗的生長和糖分積累起負調(diào)控作用，如果通過基因工程手段敲除該基因，有可能促進甘蔗的生長和糖分積累。

4 結(jié)論

甘蔗品種B8導入SoSUT5基因后不同程度上抑制了甘蔗的生長和糖分積累，降低甘蔗蔗糖分、蔗汁蔗糖分、蔗渣蔗糖分和蔗汁重力純度等，使甘蔗的品質(zhì)變劣，同時還使甘蔗莖徑變小，增加黑穗病發(fā)病率，反映其對甘蔗生長和糖分積累可能起負調(diào)控作用。