核桃青果皮栲膠提取工藝優(yōu)化及其品質(zhì)評價

張時馨，劉亞娜，耿陽陽，王紀(jì)輝，胡伯凱，何佳麗，楊 霞，譚化美

（1.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005）

栲膠是從植物的皮、根、莖和果實中提取的具有鞣制作用的混合有機(jī)物，有效成分是單寧[1-3]。栲膠作為一種天然植物鞣劑，是制革工業(yè)中不可缺少的一種原材料[4-5]。目前，在皮革生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用的栲膠品種主要有毛楊梅栲膠[6]、落葉松栲膠[7]、橡椀栲膠[8]等，并已有相應(yīng)栲膠品種的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范及其質(zhì)量要求。隨著制革工業(yè)的發(fā)展，市場對栲膠的需求量逐步增加[4]，現(xiàn)有的植物栲膠提取方法工藝繁瑣、耗時長、提取率低、原料消耗大，每生產(chǎn)1 t栲膠，需消耗2.3～3.2 t橡椀[9]。因此，尋找單寧含量豐富、可生產(chǎn)栲膠的優(yōu)質(zhì)新原料迫在眉睫。

核桃Juglans regia作為我國重要的木本糧油植物，種植面積廣泛，產(chǎn)量巨大。據(jù)報道，2010年我國核桃堅果產(chǎn)量為116萬t[10]，到2016年已超過270萬t[11]，隨之產(chǎn)生的大量核桃青果皮成為農(nóng)業(yè)廢棄物堆放在田間、地頭或溝邊，造成了一定的資源浪費和環(huán)境污染，將其充分高值化利用是解決這一現(xiàn)狀的有效途徑。目前，關(guān)于核桃青果皮多酚和黃酮類物質(zhì)的抗氧化和抑菌活性[12-13]的研究報道較多，有關(guān)核桃青果皮中單寧的研究主要集中在提取方法和工藝條件優(yōu)化等方面。有研究結(jié)果表明，與鄰菲羅啉分光光度法相比，采用Zn2+絡(luò)合法測定的核桃青果皮單寧含量提高了15.18%[14-15]。王紅等[16]采用超聲波輔助提取的核桃青皮單寧含量可達(dá)10.49 mg/g。這些方法雖然提高了單寧含量，但較為繁瑣，且這些研究中未對栲膠品質(zhì)及其鞣制效果進(jìn)行分析，栲膠中除了單寧外，含有的非單寧物質(zhì)以及不溶物等極易影響栲膠品質(zhì)，從而制約了栲膠的工業(yè)化應(yīng)用。在我國栲膠的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：橡碗栲膠一等品（冷溶）的標(biāo)準(zhǔn)為不溶物含量不大于2.5%，合格品中的不溶物含量不大于3.5%，pH范圍均要求在3.3～4.0；馬占相思栲膠一等品的不溶物含量不大于4.0%，合格品中的不溶物含量不大于6.0%[17]。因此，高值化利用農(nóng)業(yè)廢棄物，開發(fā)新的栲膠原料，不斷改進(jìn)栲膠生產(chǎn)工藝，對所提取栲膠進(jìn)行品質(zhì)評價，可為栲膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新路徑。本研究中以核桃青果皮為原料制備栲膠，使用響應(yīng)面法優(yōu)化栲膠提取工藝，并對其品質(zhì)進(jìn)行分析，探討以核桃青果皮作為原料生產(chǎn)栲膠的可行性，旨在提高核桃副產(chǎn)物的綜合利用率，為栲膠產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青果皮：以核桃有50%的青果皮顏色變黃或有1/2開裂為成熟標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采收，采收地點為貴州省息烽縣西山鎮(zhèn)豬場村。

單寧標(biāo)準(zhǔn)品，純度為98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司。除高嶺土為化學(xué)純外，無水乙醇、丙酮、甲醇、磷鉬酸、鉬酸鈉、磷酸、甲酸、濃硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉、鉻皮粉等試劑均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS104TS電子天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；L5S紫外可見分光光度計，購自上海儀電分析儀器有限公司；RJ-TDL-40B離心機(jī)，購自無錫市瑞江分析儀器有限公司；HY-852皮革收縮溫度測試儀，購自東莞市恒宇儀器有限公司；TMS-Touch質(zhì)構(gòu)測定儀，購自美國FTC；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；DC-1500實驗型噴霧干燥機(jī)，購自上海達(dá)程實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮核桃青果皮在70 ℃條件下烘干至水分含量在8%以下，粉碎過80目篩，4 ℃條件下冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品單寧含量測定

準(zhǔn)確稱取單寧標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg于25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，混勻，即為1 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，2.5 mL Folin-Denis試劑和5 mL飽和Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至50 mL，充分混勻，室溫靜置30 min后，以蒸餾水為空白對照，在650 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，單寧含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用Folin-Denis比色法[16]測定單寧含量。稱取核桃青果皮粉末1.00 g，浸沒于提取液中，放入60 ℃水浴鍋中提取30 min，然后在4 000 r/min條件下離心8 min，上清液為提取液。吸取1 mL提取液測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算單寧含量（C）。

C=(c×V×n×0.001)/m。

式中：C為單寧含量；c為樣品中單寧酸含量；V為提取液總體積；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量。

1.3.3 樣品單寧提取條件篩選

1）單因素試驗 基于單寧提取方法，設(shè)定單因素試驗條件固定液固比（體積質(zhì)量比）40∶1、提取溫度60 ℃、提取時長30 min，分別以蒸餾水、60%丙酮溶液、60%甲醇溶液、60%乙醇溶液為浸提劑進(jìn)行試驗，以單寧含量為評價標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳浸提劑，再確定最佳浸提劑的體積分?jǐn)?shù)；設(shè)定固定浸提劑為40%乙醇、提取溫度60 ℃、提取時長30 min，液固比分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1，確定最佳液固比；設(shè)定固定浸提劑為40%乙醇，提取時長30 min，液固比60∶1，提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，確定最佳提取溫度；設(shè)定固定浸提劑為40%乙醇，提取溫度60 ℃，液固比60∶1，提取時長分別 為10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 min，確定最佳提取時長；設(shè)定固定浸提劑為40%乙醇，提取時長40 min，液固比60∶1，提取溫度60 ℃，分別在酸性（pH 4.0）、中性（pH 7.0）、堿性（pH 12.0）條件下提取單寧，確定最佳pH條件。

2）響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時長4個因素，以單寧含量為響應(yīng)指標(biāo)，運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件程序，根據(jù)Central Composite Design試驗設(shè)計原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，具體的因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素和水平Table 1 The factor and level of response surface design

1.3.4 樣品栲膠品質(zhì)鑒定

參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行栲膠成分的測定分析。

鞣制效應(yīng)評價[19]：將50.0 g新鮮豬皮浸沒在用甲酸和濃硫酸調(diào)節(jié)pH為4的6%NaCl溶液中，在60 r/min條件下振蕩1 h，然后將獲得的浸酸豬皮按照初始質(zhì)量（增50%）的3%分3次加入核桃青皮栲膠粉，每次間隔20 min后，繼續(xù)振蕩4 h，確保豬皮完全浸沒在溶液中，靜置過夜，次日振蕩1 h后取出皮塊，用自來水沖洗表面，取樣。參照文獻(xiàn)[20]分別測定新鮮豬皮、浸酸豬皮、鞣制豬皮的收縮溫度。采用質(zhì)構(gòu)測定儀對新鮮豬皮、浸酸豬皮、鞣制豬皮進(jìn)行彈性、硬度、剪切力的測定[21]。測定彈性和硬度時，儀器參數(shù)為檢測速度1.0 mm/s、測試后速度5.0 mm/s、形變量30%、觸發(fā)力0.5 N；測定剪切力時，儀器參數(shù)為起始力10 N、下降速度60 mm/min、上升速度120 mm/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Duncan法），使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件建立響應(yīng)面回歸方程，并對回歸方程各項的方差進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 浸提劑對單寧提取效果的影響

浸提劑種類對單寧提取效果的影響如圖1所示。由圖1可以看出，不同種類的提取劑對單寧的提取效果不同，60%乙醇溶液提取效果最佳，提取液中單寧含量為9.54 mg/g；60%丙酮溶液次之，單寧含量為9.28 mg/g。考慮到丙酮的易制毒特性，選取乙醇作為浸提劑，并進(jìn)一步研究不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對單寧的提取效果。

圖1 浸提劑種類對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.1 Effect of extractant kinds on the extraction of walnut green peel tannin

乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對單寧提取效果的影響如圖2所示。由圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，單寧含量整體呈先升后降的趨勢變化，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)由20%增加至40%，單寧含量逐漸增加，40%乙醇溶液處理下單寧含量最高（11.69 mg/g）；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%，單寧含量反而下降。因此，以40%乙醇溶液為最佳提取液。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.2 Effect of volume fraction of ethanol on extraction of walnut green peel tannin

2.1.2 液固比對單寧提取效果的影響

液固比對核桃青果皮單寧提取效果的影響如圖3所示。由圖3可以看出，隨著液固比不斷增加，單寧含量增大。當(dāng)液固比達(dá)到60∶1時，單寧含量已達(dá)到較高水平；當(dāng)液固比在(20～60)∶1時，單寧含量急劇增加；當(dāng)液固比高于60∶1時，單寧含量增加較為緩慢。其原因可能是液固比影響單寧的浸出，當(dāng)液固比較低時，不利于單寧擴(kuò)散，隨著液固比增加，單寧和提取劑充分接觸，提取率不再受影響?？紤]到節(jié)約成本，選取液固比60∶1進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 液固比對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to material on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.3 提取溫度對單寧提取效果的影響

提取溫度對核桃青果皮單寧提取效果的影響如圖4所示。由圖4可以看出，隨著提取溫度升高，單寧含量不斷增加，在提取溫度60 ℃時達(dá)到最大值11.96 mg/g。當(dāng)提取溫度繼續(xù)增加，單寧含量呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為提取溫度高于60 ℃使得單寧發(fā)生一定程度的分解，導(dǎo)致單寧含量降低。因此，以60 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.4 提取時長對單寧提取效果的影響

提取時長對核桃青果皮單寧提取效果的影響如圖5所示。由圖5可以看出，在0～40 min的提取時長范圍內(nèi)，隨著提取時長的延長，單寧含量逐漸增加，在提取時長40 min時達(dá)到最大值10.86 mg/g；在50～90 min的提取時長范圍內(nèi)，單寧含量基本呈下降趨勢；在100～180 min的提取時長范圍內(nèi)，單寧含量處于平緩狀態(tài)。因為剛開始提取時，物料細(xì)胞內(nèi)溶液與提取液中的單寧濃度差較大，擴(kuò)散較快，單位時間內(nèi)單寧釋放量較多；隨著提取時長的延長，物料細(xì)胞內(nèi)溶液與提取液中的單寧濃度差降低，擴(kuò)散速度減慢，單寧釋放量隨之減少并逐漸趨于平緩[22]。因此，以40 min為最佳提取時長。

圖5 提取時長對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction of walnut green peel tannin

2.1.5 提取液pH對單寧提取效果的影響

提取液pH對核桃青果皮單寧提取效果的影響如圖6所示。由圖6可以看出，提取液pH對單寧含量影響較大。在酸性條件（pH 4.0）下單寧含量最高，達(dá)到8.08 mg/g；中性條件（pH 7.0）下次之，為7.28 mg/g；堿性條件（pH 12.0）下最低，為6.924 mg/g。表明酸性條件更有利于單寧分子的釋放。由于核桃青果皮呈酸性（核桃青果皮與蒸餾水按質(zhì)量比1∶1的比例混合，pH約為3.88），可滿足提取液酸性條件的要求，因此后續(xù)試驗未對提取液的pH進(jìn)行調(diào)整。

圖6 提取液pH對核桃青果皮單寧提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction solution pH on the extraction effect of walnut green peel tannin

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液固比（B）、提取溫度（C）和提取時長（D）為自變量，以單寧含量為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面試驗，對核桃青果皮栲膠提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 核桃青果皮單寧提取工藝條件響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of response surface test of the extraction technology conditions of walnut green peel tannin

2.2.2 回歸模型方差分析

核桃青果皮單寧提取工藝條件響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析結(jié)果見表3，其擬合回歸方程為Y=-35.620+0.606A+0.183B+0.517C+0.402D-1.059×10-4AB+1.184×10-3AC-2.899×10-3AD+9.828×10-4BC-1.456×10-3BD+2.333×10-3CD-5.752×10-3A2-1.436×10-3B2-5.501×10-3C2-3.608×10-3D2。

由表3可知，回歸模型P值表現(xiàn)極顯著，失擬項無顯著差異，信噪比為12.02（＞4），表明試驗結(jié)果與模型擬合度良好，真實誤差較小，模型信號較強(qiáng)。且R2為0.94，表明單寧含量有94.05%的變化來自所選的自變量，該模型擬合度良好，該方法具有可行性。該回歸模型中，一次項和二次項均有顯著性因素，其中A、C、D、A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值均有極顯著影響（P＜0.01），4種因素對單寧含量的影響由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（C）、提取時長（D）、液固比（B）。

表3 核桃青果皮單寧提取工藝條件回歸模型方差分析結(jié)果?Table 3 Analysis of variance results of regression model of walnut green peel tannin extraction technology conditions

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面曲線梯度反映各因素對單寧含量的影響程度，曲線越陡表示該因素對單寧含量影響越明顯[23]。核桃青果皮單寧提取工藝條件響應(yīng)曲面分析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，A和B曲面比C和D曲面更加彎曲，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)分別與液固比和提取溫度的交互作用要比提取溫度分別與提取時長和液固比的交互作用對單寧含量影響大，與方差分析結(jié)果一致。結(jié)合方差分析，結(jié)果表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時長4個因素之間的交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖7 核桃青果皮單寧提取工藝條件的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface diagram of the extraction conditions of walnut green peel tannin

2.2.4 最佳栲膠制備工藝條件的確定及驗證

根據(jù)二次線性回歸方程的分析結(jié)果，核桃青果皮制備栲膠的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)47.51%、液固比61.88∶1、提取溫度67.39 ℃、提取時長45.93 min。在此條件下核桃青果皮提取液單寧含量可達(dá)到11.125 mg/g。在實際生產(chǎn)中，考慮到操作便易性，將核桃青果皮制備栲膠的最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、液固比62∶1，提取溫度68 ℃、提取時長46 min。采用上述條件，重復(fù)3組試驗進(jìn)行驗證，核桃青果皮提取液單寧含量為10.98 mg/g，與預(yù)測值基本一致，經(jīng)過離心、抽濾、濃縮、噴霧干燥工藝之后制得的核桃青果皮栲膠得率為26.96%。因此該模型可以較好反映最佳核桃青果皮栲膠制備工藝條件。

2.3 核桃青果皮栲膠品質(zhì)評價

核桃青果皮栲膠成分分析結(jié)果表明，其單寧含量61.75%±2.50%，水分含量5.83%±0.62%，不溶物含量4.75%±0.50%，pH為3.93±0.10，總色值28.25±2.87。以核桃青果皮為原料提取制備的栲膠中單寧含量高于落葉松栲膠[7]中優(yōu)等品的單寧含量，不溶物含量和pH達(dá)到了馬占相思栲膠和毛楊梅栲膠一等品的標(biāo)準(zhǔn)[17]，表明利用核桃青果皮生產(chǎn)栲膠具有一定的可行性。但核桃青果皮栲膠單寧含量仍低于橡椀栲膠熱溶合格品，且顏色較深，其品質(zhì)還有待進(jìn)一步提高。

為了進(jìn)一步研究核桃青果皮栲膠的鞣制效應(yīng)，采用新鮮豬皮進(jìn)行試驗，評價鞣制后皮革品質(zhì)。結(jié)果表明，鞣制后的豬皮有所增厚，顏色呈暗棕色，核桃青果皮栲膠鞣制效應(yīng)分析結(jié)果見表4。由表4可知，鞣制后的豬皮比新鮮豬皮收縮溫度提高了14.25 ℃，比浸酸豬皮收縮溫度提高了21.45 ℃。此外，鞣制豬皮的彈性、硬度和剪切力均顯著高于新鮮豬皮和浸酸豬皮（P＜0.05），彈性分別增加了71.67%和58.46%，硬度分別增加了6.17和1.41倍，剪切力分別增加了2.93和1.23倍，表明核桃青果皮栲膠具有較好的鞣制效應(yīng)。

表4 核桃青果皮栲膠鞣制效應(yīng)分析結(jié)果?Table 4 Tanning action analysis of walnut green peel tannin extract

3 結(jié)論與討論

本試驗中以核桃青果皮為原料提取栲膠，通過溶劑浸提法，以單寧含量為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時長4種影響因素中乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧含量影響最大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、液固比62∶1、提取溫度68 ℃、提取時長46 min條件下，提取液中單寧含量最大，為10.98 mg/g，與驗證結(jié)果相近，表明該試驗?zāi)Ｐ徒Y(jié)果準(zhǔn)確可靠。

與王紅等[16]用70%乙醇溶液超聲波輔助浸提50 min提取核桃青果皮單寧工藝相比，本試驗中所優(yōu)化工藝條件具有乙醇體積分?jǐn)?shù)低、提取時長短的特點，且提取液中單寧含量高于超聲波輔助提取的單寧含量。昝志惠等[24]使用超聲波輔助浸提核桃楸中栲膠，成品提取率達(dá)到63.68%，但使用了50%的丙酮溶液作為提取劑。與之相比，乙醇易蒸發(fā)，后續(xù)可回收再利用，可滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，降低生產(chǎn)成本。這與王吉平等[25]的浸提法有相似之處，均體現(xiàn)了綠色高效的特點，同時通過使用浸提法減少了超聲波輔助提取造成的栲膠成品中其他非單寧物質(zhì)對栲膠品質(zhì)的影響。

單寧是栲膠的主要成分，在植物鞣劑的應(yīng)用中，栲膠成品的單寧含量是產(chǎn)品是否達(dá)到栲膠工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)[26]。參考周辰[27]的方法，本試驗中通過離心、抽濾、濃縮和噴霧干燥工藝制備的核桃青果皮栲膠成品的單寧含量為61.75%±2.50%，不溶物含量為4.75%±0.50%，水分含量不大于10%，pH為3.93±0.10，總色值為28.25±2.87，其單寧含量可達(dá)到橡椀栲膠冷溶合格品的標(biāo)準(zhǔn)[8]。鞣制效應(yīng)是指化學(xué)試劑與動物皮發(fā)生相互作用后，可以提高膠原的耐濕熱穩(wěn)定性[18]。鞣制劑的鞣制效果對于植物鞣劑的工業(yè)化應(yīng)用具有重要影響。鞣制后皮革收縮溫度的升高會增加其柔軟度。經(jīng)核桃青果皮栲膠鞣制后豬皮的收縮溫度、彈性、硬度和剪切力均顯著高于新鮮豬皮和浸酸豬皮（P＜0.05）。王學(xué)川等[28]在使用石榴皮栲膠對綿羊皮進(jìn)行鞣制時也發(fā)現(xiàn)，收縮溫度為68.8～75.2 ℃時，復(fù)鞣革柔軟且具有較大的延伸性和回彈性。因此，核桃青果皮栲膠具有植物鞣劑的性能，可作為新的栲膠原料。使用核桃青果皮栲膠鞣制后豬皮增厚，顏色呈暗棕色，與龔英等[19]使用飛機(jī)草鞣制豬皮革的效果一致，推測核桃青果皮栲膠鞣制后豬皮的顏色與總色值相關(guān)。這限制了后續(xù)栲膠的制革應(yīng)用，給革制品脫色增加了難度，如何在保證綠色高效提取的同時得到品質(zhì)較好的栲膠尚需進(jìn)一步研究。