不同配方培養(yǎng)基對(duì)桑黃菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)的影響

陸春霞，劉開莉，肖瀟，董桂清，韋偉，唐永飛，林強(qiáng)軒，梁貴秋*，周曉玲

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市 530007）

桑黃（Phellinus baumiiPilat.）是名貴的藥用真菌，《神農(nóng)百草經(jīng)》《神農(nóng)本草經(jīng)》以及《本草綱目》對(duì)桑黃可治血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉等均有詳細(xì)的記載［1］?，F(xiàn)代生物學(xué)研究表明，桑黃在抗腫瘤、保肝、降血糖、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、治療關(guān)節(jié)炎等［2-7］方面具有顯著的效果，并成為國(guó)際公認(rèn)的在生物抗癌方面最好的藥用真菌之一［8］，具有非常廣闊的開發(fā)前景。野生桑黃主要寄生于楊樹、樺樹、柳樹、桑樹、櫟樹、松樹等樹種。桑樹桑黃的多糖、黃酮和三萜類含量均高于其他樹種，因此桑樹桑黃的經(jīng)濟(jì)價(jià)值非常高［9-11］。國(guó)內(nèi)的野生桑黃資源主要分布在黑龍江、吉林、陜西、浙江、安徽、云南、四川等地，但資源又非常稀缺，難以滿足市場(chǎng)的大量需求。因此，科研工作者開展了一系列桑黃人工種植的研究。韓國(guó)和日本是最早研究桑黃栽培的國(guó)家。中國(guó)起步較晚，李國(guó)俊等［12］于1998年才成功培養(yǎng)出桑黃菌絲體。針對(duì)桑黃資源日益緊張的趨勢(shì)，同時(shí)結(jié)合廣西的桑枝資源優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)主要從區(qū)外引進(jìn)的桑黃資源進(jìn)行人工栽培選育，篩選桑黃生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，測(cè)定不同配方培養(yǎng)基對(duì)桑黃農(nóng)藝性狀和藥用活性成分的影響，以期通過優(yōu)化配方以提高桑黃的藥用價(jià)值，同時(shí)為桑黃今后規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的桑黃菌株來源于吉林省通化市神芝健生物科技有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基配方

1.2.1母種培養(yǎng)基配方 改良的PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯（去皮）+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4作為桑黃菌絲活化培養(yǎng)基，CK1為20%馬鈴薯+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1% KH2PO4+0.075%MgSO4。母種培養(yǎng)基配方為A1～A6，其中A1為2%蔗糖+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4，A2為2%麥芽糖+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4，A3為2%可溶性淀粉+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4，A4為2%玉米粉+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4，A5為2%糊精+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1% KH2PO4+0.075%MgSO4，A6為2%麥麩+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4。

1.2.2原種培養(yǎng)基配方 CK2配方為70%麩皮+22%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏。原種培養(yǎng)基配方為B1～B4，其中B1為10%桑枝屑+70%麩皮+12%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，B2為15%桑枝屑+60%麩皮+17%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，B3為20%桑枝屑+50%麩皮+22%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，B4為25%桑枝屑+40%麩皮+27%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏。以上培養(yǎng)基含水率均為65%，所培養(yǎng)的原種不再擴(kuò)繁為生產(chǎn)種，將直接用于出菇袋料的接種。

1.2.3出菇袋料配方 CK3配方為60%雜木屑+35%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏。出菇袋料配方為C1～C4，其中C1為35%桑枝屑+40%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，C2為45%桑枝屑+30%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，C3為55%桑枝屑+20%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，C4為65%桑枝屑+10%雜木屑+20%麩皮+玉米粉2%+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏。以上出菇袋料含水率均為65%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化培養(yǎng) 將冰箱中保存的桑黃母種挑取出粗壯的菌絲塊接種到裝有活化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)10～15 d，待菌絲長(zhǎng)滿后備用。

1.3.2母種培養(yǎng)基篩選 以蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、糊精、麥麩（質(zhì)量百分比均為2%）等不同的碳、氮原料分別加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中作為不同的母種培養(yǎng)基處理，以PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，以菌絲日平均增長(zhǎng)速率和菌絲形態(tài)特征及長(zhǎng)勢(shì)作為衡量指標(biāo)，篩選出最佳的母種培養(yǎng)基配方。將已活化的菌種按直徑為5 mm的小菌塊分別接種于不同母種培養(yǎng)基中，然后置于28 ℃培養(yǎng)箱里避光培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每24 h觀察并測(cè)量菌絲生長(zhǎng)情況。菌絲生長(zhǎng)的速度（mm/d）＝（菌落的直徑－菌種塊直徑）/菌落生長(zhǎng)的時(shí)間［13］，結(jié)果取平均值。

1.3.3原種培養(yǎng)基配方篩選 以活化好的桑黃試管菌種分別接種到添加了桑枝屑、麩皮、棉籽殼等不同配比輔料的原種培養(yǎng)基中，以菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌絲日平均增長(zhǎng)速率、菌絲形態(tài)特征及長(zhǎng)勢(shì)作為衡量指標(biāo)，篩選出最佳的原種培養(yǎng)基配方。選用規(guī)格為13 cm×19 cm×0.05 cm的聚丙烯菌種袋進(jìn)行裝袋，在0.11 Pa 121 ℃條件下進(jìn)行高壓滅菌后接種，每個(gè)處理接種15袋，于溫度為28 ℃的室溫中進(jìn)行避光培養(yǎng)，觀察記錄桑黃菌絲的生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4出菇袋料配方篩選 選用同一培養(yǎng)基培養(yǎng)好的桑黃原種分別接種到不同的栽培料中，以菌絲生長(zhǎng)情況、子實(shí)體生長(zhǎng)質(zhì)量、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率以及活性成分含量為衡量指標(biāo)，篩選出最佳的袋料配方。選用規(guī)格為17.00 cm×33.00 cm×0.05 cm的聚丙烯菌種袋，每袋干料重為500 g，裝袋后在0.11 Pa 121 ℃條件下進(jìn)行高壓滅菌后接種，每個(gè)處理接種20 袋，于28 ℃室溫中進(jìn)行避光培養(yǎng)，觀察記錄桑黃菌絲的生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)重復(fù)3 次。待菌絲長(zhǎng)滿菌袋后，菌絲呈深黃色或有瘤狀突起物時(shí)進(jìn)行出菇期管理，培養(yǎng)條件為溫度28～30 ℃，濕度為85%～98%，光源為散射光，適當(dāng)通風(fēng)，觀察子實(shí)體生長(zhǎng)情況并對(duì)子實(shí)體的活性成分進(jìn)行分析。

1.4 活性成分測(cè)定方法和儀器

1.4.1活性成分測(cè)定方法 粗多糖采用硫酸—苯酚法和蒽酮法測(cè)定［14］；總生物堿參考文獻(xiàn)［15］測(cè)定；總?cè)撇捎孟闾m素－冰醋酸－高氯酸方法測(cè)定［16］。

1.4.2儀器 主要儀器設(shè)備有ZRG-800A-L 冷光源人工氣候箱（上海丙林電子科技有限公司生產(chǎn)）、MA35M-1CN230V1烘箱（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、722型可見分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、賽多利斯BSA224S-CW 分析天平（濟(jì)南歐萊寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、XDW-4OBD 萬能粉碎機(jī)（濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司生產(chǎn)）、JBZL-08智能氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司生產(chǎn)）、KQ-300E 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）、SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、H1750R臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)）、LDZX-75KBS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、ZJ-96A 酶標(biāo)儀（鄭州智捷生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.4.3試劑 主要試劑有濃硫酸、苯酚、95%無水乙醇、葡萄糖、蕓香苷、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、三氯化鐵、七水硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、一水沒食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁等，純度均為分析純。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)桑黃母種菌絲生長(zhǎng)的影響

從表1 可看出，6 種不同碳氮培養(yǎng)基中均培養(yǎng)出黃色的桑黃菌絲，如圖1 所示，以試驗(yàn)A1、A4、A5配方與對(duì)照相比所培養(yǎng)出來的菌絲綜合長(zhǎng)勢(shì)較好，其中配方A4以玉米粉作為培養(yǎng)基中的碳源時(shí)，以菌絲日平均生長(zhǎng)速率為微量指標(biāo)，與其他配方均存在極顯著差異，日平均增長(zhǎng)速率達(dá)5.50 mm/d，所培養(yǎng)出的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲呈黃色，絨毛緊密，呈毛氈狀（圖2）。配方A3以可溶性淀粉作為氮源，所培養(yǎng)的桑黃菌絲分布較稀疏，菌絲細(xì)弱，長(zhǎng)勢(shì)最差。桑黃菌絲是一種弱勢(shì)菌種，菌絲生長(zhǎng)較為緩慢，培養(yǎng)基中需要配以合理的碳氮源比例，配方A4添加了一定比例的玉米粉，說明該配方含有促進(jìn)桑黃菌絲生長(zhǎng)因子所需適宜的碳源和氮源，因此培養(yǎng)出來菌絲粗壯且長(zhǎng)勢(shì)較好。

表1 不同母種培養(yǎng)基對(duì)桑黃菌絲的影響

圖1 試管母種

圖2 A4配方培養(yǎng)的桑黃菌絲

2.2 不同原種培養(yǎng)基配方對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

從表2可知，不同的原種培養(yǎng)基配方對(duì)桑黃菌絲的生長(zhǎng)有一定的影響，添加了桑枝屑的配方B1～B4與未添加桑枝屑的對(duì)照相比，菌絲萌發(fā)時(shí)間相差不大，日平均增長(zhǎng)速率和滿袋時(shí)間隨著桑枝屑添加量呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加桑枝屑后菌絲的長(zhǎng)勢(shì)均優(yōu)于對(duì)照，當(dāng)桑枝屑添加到一定的量，菌絲長(zhǎng)勢(shì)比較濃密且粗壯。說明桑黃原種培養(yǎng)基配方中添加一定比例的桑枝屑，桑枝屑中豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和多種活性物質(zhì)有利于轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)桑黃的生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)桑黃菌絲的生長(zhǎng)與內(nèi)含物的積累。

表2 不同原種培養(yǎng)基配方對(duì)桑黃生長(zhǎng)的影響

從表2 和圖3 可知，配方B3（20%桑枝屑+50%麩皮+22%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏）所培養(yǎng)的桑黃原種的生長(zhǎng)情況最佳，其菌絲萌發(fā)時(shí)間為4 d，菌絲日平均增長(zhǎng)速率為4.20 mm/d，菌絲長(zhǎng)滿袋時(shí)間為21 d，菌絲呈淡黃色、濃密且粗壯。

圖3 B3配方栽培的桑黃原種

2.3 不同出菇袋料配方對(duì)桑黃子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率及活性成分的影響

2.3.1不同出菇袋料配方對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響 從表3可知，不同配方的出菇袋料對(duì)桑黃菌絲的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)特征有一定的影響，添加了桑枝的配方C1～C4與沒添加桑枝的對(duì)照相比，菌絲萌發(fā)的時(shí)間相差不大，但是生長(zhǎng)速率和菌絲滿袋的時(shí)間隨著桑枝添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)；菌絲特征表現(xiàn)隨著桑枝的添加量的增加也優(yōu)于對(duì)照，菌絲比較粗壯而濃密，整體長(zhǎng)勢(shì)均優(yōu)于對(duì)照，但隨著桑枝量的增加，菌絲的長(zhǎng)速有所減緩，長(zhǎng)勢(shì)也呈下降趨勢(shì)。

從表3和圖4可知，試驗(yàn)配方C2（45%桑枝屑+30%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏）所培養(yǎng)的桑黃菌絲的生長(zhǎng)情況最好，菌絲萌發(fā)時(shí)間為3 d，菌絲日平均增長(zhǎng)速率為4.6 mm/d，菌絲滿袋時(shí)間為52 d，菌絲表現(xiàn)為白色、濃密而粗壯（圖4）。

圖4 C2配方栽培的桑黃菌袋

表3 不同出菇袋料配方對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響

續(xù)表3

2.3.2不同出菇袋料配方對(duì)桑黃子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率的影響 從表4可知，不同配方的出菇袋料對(duì)桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)以及生物轉(zhuǎn)化率有一定的影響。添加了桑枝的配方C1～C4與沒添加桑枝的對(duì)照比較結(jié)果表明，隨著添加桑枝含量比例的提高，桑黃原基形成的時(shí)間和子實(shí)體成熟時(shí)間均有所縮短，子實(shí)體的平均產(chǎn)量和平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率以及成活率均是先提高后再有所降低，說明添加桑枝的量可以促進(jìn)原基的形成并縮短子實(shí)體成熟的時(shí)間，并有助于提高子實(shí)體產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率，但兩者隨著桑枝添加的量達(dá)到一定的比例時(shí)均有所下降。

表4 不同配方對(duì)桑黃生物轉(zhuǎn)化率的影響

從表4 和圖5 可以看出，試驗(yàn)配方C2（45%桑枝屑+30%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏）所培養(yǎng)出的桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)質(zhì)量和平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最好。具體表現(xiàn)為，原基形成時(shí)間最短，為15 d；子實(shí)體成熟時(shí)間最短，為57 d；子實(shí)體平均產(chǎn)量最高，為125.0 g/袋；平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最高，為25%；成活率達(dá)98%。

圖5 C2配方栽培的桑黃子實(shí)體

2.3.3不同出菇袋料配方對(duì)桑黃子實(shí)體活性成分的影響 從表5可以看出，添加了桑枝屑的試驗(yàn)配方C1～C4培養(yǎng)出的桑黃子實(shí)體的活性成分均高于對(duì)照，其中試驗(yàn)配方C4（55%桑枝屑+20%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏）培養(yǎng)出的桑黃子實(shí)體的活性成分最高，粗多糖含量為1.85 g/100 g，總?cè)坪?.75 g/100 g，總生物堿含量為34.1 g/100 g。說明桑枝中含有豐富的活性成分，通過在出菇袋料中添加桑枝屑有助于增加子實(shí)體中活性成分的含量，并且活性成分含量隨著桑枝屑添加量的增加而增加，當(dāng)桑枝量添加比例達(dá)到60%時(shí)，相對(duì)于不添加桑枝屑的對(duì)照而言，粗多糖含量提高了70%，總?cè)坪刻岣吡?27%，總生物堿提高了60%。但綜合菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)質(zhì)量以及生物轉(zhuǎn)化率而言，選試驗(yàn)配方C2（45%桑枝屑+30%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏）為桑黃最佳出菇袋料配方，與對(duì)照相比，桑黃子實(shí)體粗多糖含量提高了43%，總?cè)坪刻岣吡?7%，總生物堿含量提高了44%。

表5 不同出菇袋料配方對(duì)桑黃活性成分的影響

3 討論與結(jié)論

目前已有的報(bào)道對(duì)桑黃培養(yǎng)基質(zhì)的研究比較多，但桑黃自身生理生態(tài)的特殊性以及外部栽培條件要求較高的制約，給桑黃人工栽培帶來了一定的難度，大多數(shù)的報(bào)道在輔料成分和輔料配比方面的研究也不盡相同。本試驗(yàn)主要是通過引進(jìn)吉林的桑黃菌種進(jìn)行栽培試驗(yàn)，在廣西的栽培氣候條件下人為創(chuàng)造出適合桑黃生長(zhǎng)的條件，以進(jìn)一步探索出桑黃整個(gè)生長(zhǎng)過程中需要的最佳培養(yǎng)基配比，篩選得出了最適的母種培養(yǎng)基配方為2%玉米粉+2%瓊脂+3%葡萄糖+0.1%KH2PO4+0.075%MgSO4，此配方培養(yǎng)出的桑黃菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好也最粗壯，菌絲呈黃色，絨毛緊密，呈毛氈狀。最適的原種培養(yǎng)基配方為20%桑枝屑+50%麩皮+22%棉籽殼+5%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，此配方培養(yǎng)出的桑黃菌絲萌發(fā)時(shí)間較短，為4 d；菌絲日平均增長(zhǎng)速率較快，為4.2 mm/d；菌絲長(zhǎng)滿袋時(shí)間為21 d，菌絲相對(duì)于其他配方表現(xiàn)較好，呈淡黃色，濃密且粗壯。最適的出菇袋料配方為45%桑枝屑+30%雜木屑+20%麩皮+2%玉米粉+1%蔗糖+1%石灰+1%石膏，此配方培養(yǎng)出的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，萌發(fā)時(shí)間較短，為3 d；菌絲日平均增長(zhǎng)速率為4.6 mm/d，菌絲滿袋時(shí)間為52 d，菌絲呈白色，濃密而粗壯；并且培養(yǎng)出的桑黃子實(shí)體的質(zhì)量最好，平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最高，表現(xiàn)為原基形成時(shí)間最短，為15 d；子實(shí)體成熟時(shí)間最短，為57 d；子實(shí)體平均產(chǎn)量最高，為125 g/袋；平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最高，為25%；成活率達(dá)98%。通過此出菇袋料配方收獲的子實(shí)體在活性成分方面與對(duì)照相比，其桑黃子實(shí)體粗多糖含量提高了43%，總?cè)坪刻岣吡?7%，總生物堿提高了44%。

天然生長(zhǎng)的桑黃應(yīng)是寄生在桑樹上，其藥用保健價(jià)值也是最高的，桑黃的活性成分主要包括多糖類、黃酮類、酚類、生物堿、萜類、甾體、香豆素類等，因此如何利用桑樹中的有效成分來提高桑黃的活性成分也是近年的研究熱點(diǎn)。但在桑黃人工栽培配方的研究上，大多報(bào)道都是集中在桑枝和其他輔料的不同配比研究上，關(guān)于培養(yǎng)基配方與子實(shí)體質(zhì)量、生物轉(zhuǎn)化率以及活性成分的研究則鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)在原種培養(yǎng)基和出菇袋料中通過以桑枝不同的添加量為配比，研究栽培配方中的原料比例，確定優(yōu)化的栽培技術(shù)關(guān)鍵，以期在短時(shí)期中獲得較高產(chǎn)量和產(chǎn)能的桑黃子實(shí)體，對(duì)進(jìn)一步完善桑黃人工栽培技術(shù)體系有促進(jìn)作用。