花椒精油對(duì)蘋(píng)果梨采后青霉病的控制及感官和質(zhì)地品質(zhì)的影響

王聰，沈浩，蒲國(guó)順，任麗, 李貞子，王軍節(jié)*

1(北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川，750021)2(北方民族大學(xué) 植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)3(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730124)

蘋(píng)果梨是我國(guó)甘肅[1]、內(nèi)蒙[2]和吉林地區(qū)[3]的特產(chǎn)水果，該果含糖豐富、質(zhì)地酥脆，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)頗具盛譽(yù)[4]。由擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum，P.expansum)侵染引起的青霉病[5]和鏈格孢(Alternariaalternata，A.alternata)侵染引起的黑斑病[1,6]是蘋(píng)果梨主要采后病害，給果實(shí)貯藏造成嚴(yán)重?fù)p失。P.expansum和A.alternata引起果實(shí)腐爛過(guò)程還常伴隨展青霉毒素和交鏈孢霉毒素的積累，帶來(lái)食品安全隱患[7]。因此，開(kāi)發(fā)蘋(píng)果梨采后病害控制策略將有利于產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

殺菌劑可以控制P.expansum[8]和A.alternata[9]引起的采后病害，但存在藥物殘留、環(huán)境污染以及誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題而受限。近些年越來(lái)越多研究表明，植物精油是替代殺菌劑控制采后病害的新型安全措施[10-12]。花椒為蕓香科花椒屬植物的成熟干燥果實(shí)，精油是其開(kāi)發(fā)利用的重要方向[13]。研究發(fā)現(xiàn)花椒精油對(duì)引起馬鈴薯干腐病的硫色鐮刀菌[14]和引起牧草和煙葉貯藏蟲(chóng)害的煙草甲[15]以及食品衛(wèi)生指示菌大腸桿菌[16]具有較好抑制效果。但有關(guān)花椒精油控制蘋(píng)果梨采后病害的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究在篩選花椒精油體外控制引起蘋(píng)果梨采后腐爛病菌A.alternata和P.expansum的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以精油控制效果更佳的P.expansum為研究對(duì)象，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)精油濃度和熏蒸時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，篩選精油體內(nèi)控制蘋(píng)果梨采后青霉病的最佳條件，并對(duì)使用后果實(shí)的感官和質(zhì)地品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，以期為花椒精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為蘋(píng)果梨采后青霉病控制提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：供試A.alternata和P.expansum分離自然發(fā)病果實(shí)，純化后于實(shí)驗(yàn)室保存待用；花椒精油采用水蒸氣蒸餾法提取備用[17]；蘋(píng)果梨果實(shí)采自甘肅省條山農(nóng)場(chǎng)，當(dāng)天運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室待用。

主要儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，廣州深華公司；BMJ-800C霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；YXQ-LS-50A高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原物的篩選與體外抑菌率測(cè)定

采用濾紙片熏蒸法，配制一定濃度花椒精油溶液(吐溫-80作為助溶劑)，稀釋成可在培養(yǎng)皿內(nèi)揮發(fā)之后含量達(dá)到50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μL/L的溶液[8]，助溶劑作為對(duì)照。將配置好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)分裝到錐形瓶中進(jìn)行滅菌，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將滅菌的PDA培養(yǎng)基用滅菌量筒量取25 mL分裝到滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中。將直徑6 cm滅菌的濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋上方中心固定，在濾紙片上滴加先前配制好的1 mL花椒精油溶液并使其均勻分布，在已經(jīng)純化且長(zhǎng)勢(shì)良好的帶菌培養(yǎng)皿的同一直徑范圍內(nèi)，用滅菌的打孔器打取生長(zhǎng)一致的菌餅(直徑為6.0 mm)，將菌餅置于培養(yǎng)基中心，蓋上含有精油濾紙的玻璃皿蓋，并立即用封口膜進(jìn)行封口處理，置于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)72 h后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[18]，每處理重復(fù)5次。通過(guò)公式(1)計(jì)算抑菌率，選取花椒精油對(duì)其抑制率高的病原菌進(jìn)行下一步試驗(yàn)[19]。

(1)

1.2.2 對(duì)蘋(píng)果梨病原菌生長(zhǎng)抑制的工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考韓艷麗等[10]的方法稍作修改。選擇成熟度和大小一致，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)機(jī)械損傷的蘋(píng)果梨果實(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精對(duì)蘋(píng)果梨果實(shí)進(jìn)行表面消毒，先用滅菌后的鐵釘在果實(shí)赤道部分等距離刺4個(gè)3 mm深的傷口，每個(gè)傷口內(nèi)注入10 μL 1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，分別對(duì)花椒精油熏蒸時(shí)間(含量為10 μL/L的精油密閉熏蒸2、4、6和8 h)和(分別用10、20、30和40 μL/L的精油熏蒸2 h)進(jìn)行單因素熏蒸處理后，打開(kāi)密閉容器通風(fēng)平衡24 h，最后放入(25±2) ℃、85%相對(duì)濕度(relative humidity，RH)條件下貯藏5 d，采用十字交差法測(cè)量果實(shí)的病斑直徑，記錄數(shù)據(jù)并分析，探討熏蒸時(shí)間和不同含量的花椒精油對(duì)P.expansum的體內(nèi)抑制效果，每次處理用果8個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Central Composite Design設(shè)計(jì)[20]優(yōu)化精油最佳處理方式。如表1所示，對(duì)熏蒸時(shí)間和精油含量?jī)梢蛩胤謩e用A和B表示，每一自變量低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Design factors and level of central composite

1.2.3 花椒精油處理對(duì)蘋(píng)果梨品質(zhì)的影響

通過(guò)工藝優(yōu)化得到花椒精油熏蒸蘋(píng)果梨最佳時(shí)間和含量的組合，然后將成熟度和大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的蘋(píng)果梨果實(shí)在最佳的含量和時(shí)間條件下進(jìn)行熏蒸，同時(shí)以助溶劑處理為對(duì)照，并將2組果實(shí)在(25±2) ℃、85%RH條件下貯藏，于處理當(dāng)天(0 d)、1、7、14和21 d分別取果實(shí)測(cè)定感官和質(zhì)地品質(zhì)[21]，每次處理用果15個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.3.1 感官分析評(píng)價(jià)

對(duì)蘋(píng)果梨感官評(píng)定過(guò)程中，每次評(píng)定由每位評(píng)定成員單獨(dú)進(jìn)行評(píng)分記錄，相互不接觸交流，不同果實(shí)樣品評(píng)定間隔期間用清水漱口。本試驗(yàn)感官評(píng)價(jià)中，每項(xiàng)滿(mǎn)分為5分，選取色澤、味覺(jué)、質(zhì)地、香氣4項(xiàng)指標(biāo)綜合得到最后的總體得分[22]。單項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)判尺度及統(tǒng)計(jì)如下：

色澤：光鮮(5分)～暗灰(1分)；味覺(jué)：脆嫩(5分)～綿軟(1分)；質(zhì)地：汁液充分(5分)～干澀(1分)；香氣：無(wú)花椒味，果實(shí)香氣濃郁(5分)～花椒味濃，果實(shí)香氣較淡(1分)。實(shí)驗(yàn)選取10位人員組成評(píng)定小組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)定結(jié)果去掉2個(gè)極值后取平均值為最終評(píng)價(jià)結(jié)果。

1.2.3.2 質(zhì)地品質(zhì)測(cè)定

先調(diào)試好質(zhì)構(gòu)儀，測(cè)定參數(shù)設(shè)定：測(cè)試速度為30 mm/min；下壓形變量為10%；觸發(fā)力為0.1 N[23]。在每個(gè)果實(shí)的陰面、陽(yáng)面以及中間對(duì)稱(chēng)4個(gè)點(diǎn)的赤道部位分別切去一小塊果實(shí)表皮，露出果肉(表面平整)，然后用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。質(zhì)構(gòu)特性以硬度、黏著性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性等指標(biāo)表示[24]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖、方差分析以及顯著性分析(P<0.05)，相關(guān)性分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒精油對(duì)P.expansum和A.alternaria體外抑菌效果

由圖1可知，不同含量花椒精油對(duì)2種病原菌生長(zhǎng)均有抑制作用，且抑制效果存在差異。精油對(duì)2種病原菌抑制率均隨著含量增大而升高，當(dāng)含量大于6.25 μL/L時(shí)，精油對(duì)2種病原菌抑制效果差異顯著，對(duì)P.expansum抑制率顯著高于A.alternata，在含量為25 μL/L時(shí)，對(duì)P.expansum抑制率是對(duì)A.alternata抑制率的2.1倍。由此表明，花椒精油對(duì)2種病原均有抑制作用，其中對(duì)P.expansum抑制效果更明顯。

圖1 不同含量花椒精油對(duì)P.expansum和A.alternata的體外生長(zhǎng)抑制率Fig.1 Inhibitory ratio of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on P.expansum and A.alternata in vitro注：不同字母表示P<0.05水平的差異顯著(下同)

2.2 控制蘋(píng)果梨青霉病的花椒精油熏蒸時(shí)間和含量的單因素試驗(yàn)

2.2.1 熏蒸時(shí)間的單因素試驗(yàn)

根據(jù)2.1結(jié)果，以P.expansum為研究對(duì)象，進(jìn)一步優(yōu)化花椒精油控制果實(shí)采后青霉病的體內(nèi)應(yīng)用條件。圖2看出，不同熏蒸時(shí)間均對(duì)P.expansum的體內(nèi)生長(zhǎng)存在抑制作用，但不同熏蒸時(shí)間之間存在差異，且損傷接種果實(shí)的病斑直徑隨熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)。當(dāng)熏蒸時(shí)間為4 h，病斑直徑達(dá)到最小值，為8.59 mm。因此，熏蒸時(shí)間優(yōu)化取值確定為2、4和6 h。

圖2 花椒精油熏蒸時(shí)間對(duì)病斑直徑的影響Fig.2 Effect of fumigation time of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter

2.2.2 熏蒸濃度的單因素試驗(yàn)

花椒精油含量對(duì)損傷接種蘋(píng)果梨青霉病控制效果不同，病斑直徑隨精油含量增加呈先減小后增加隨后又略有減小趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)精油含量為10 μL/L時(shí)，病斑的直徑最小，為11.19 mm，抑制效果最好。雖然精油含量在30 μL/L時(shí)，病斑直徑又呈減小趨勢(shì)，但處理的果實(shí)略有藥害斑點(diǎn)發(fā)生。因此，含量應(yīng)控制在30 μL/L以?xún)?nèi)為宜。故熏蒸果實(shí)精油含量的優(yōu)化確定為5、10和15 μL/L。

圖3 花椒精油含量對(duì)病斑直徑的影響Fig.3 Effect of fumigation concentration of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter

2.3 控制蘋(píng)果梨青霉病的花椒精油熏蒸條件優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

以熏蒸時(shí)間(A)和花椒精油含量(B)為自變量，以損傷接種P.expansum的果實(shí)病斑直徑為因變量(Y)，響應(yīng)面-中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。采用軟件Design-Expert 8.0.6 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合和方差分析，得到果實(shí)病斑直徑對(duì)熏蒸時(shí)間及精油含量的回歸方程為:

表2 Central composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite experimental design and results

Y=10.08-0.48A-0.68B-0.45AB+0.17A2+0.46B2

表3 試驗(yàn)方差結(jié)果分析表Table 3 Test variance results analysis table

2.3.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Central Composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到抑制青霉病斑擴(kuò)展的最佳參數(shù)為：熏蒸的時(shí)間為5.61 h，花椒精油的含量為14.24 μL/L，此條件下果實(shí)的病斑直徑預(yù)測(cè)值為9.89 mm。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，將處理?xiàng)l件修正為：熏蒸時(shí)間5.6 h，花椒精油含量14.2 μL/L，并進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)量出病斑直徑為(10.04±0.23)mm，與理論值接近，說(shuō)明模型的擬合程度較好，回歸方程對(duì)處理?xiàng)l件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)可靠，可以利用該條件對(duì)體內(nèi)P.expansum的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制，用于蘋(píng)果梨的采后處理。

2.4 花椒精油處理對(duì)蘋(píng)果梨貯藏品質(zhì)的影響

2.4.1 花椒精油處理對(duì)蘋(píng)果梨感官品質(zhì)的影響

由圖4可知，花椒精油處理蘋(píng)果梨在貯藏期間果實(shí)色澤、味覺(jué)以及質(zhì)地品質(zhì)的影響整體趨勢(shì)一致。在貯藏期間，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，處理和對(duì)照之間果實(shí)色澤、味覺(jué)和質(zhì)地品質(zhì)均未出現(xiàn)顯著差異；但貯藏前14 d的處理果實(shí)香氣得分顯著低于對(duì)照組，這是由于花椒精油本身的揮發(fā)性氣味掩蓋了果實(shí)香氣所致，但在貯藏21 d時(shí)，處理與對(duì)照之間的香氣評(píng)分(P=0.04<0.05)無(wú)顯著差異。

A-色澤；B-味覺(jué)；C-質(zhì)地；D-香氣圖4 精油處理對(duì)蘋(píng)果梨感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on sensory evaluation of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli

2.4.2 果實(shí)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)間相關(guān)性分析

通過(guò)全質(zhì)構(gòu)分析，測(cè)定對(duì)照和處理在貯藏過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)參數(shù)，并對(duì)質(zhì)構(gòu)參數(shù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示，質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn)所得到的蘋(píng)果梨的各項(xiàng)物性指標(biāo)間相關(guān)性不同。以蘋(píng)果梨的硬度指標(biāo)作為參考，分析其他指標(biāo)與其相關(guān)性，結(jié)果表明，脆度、彈性與硬度呈正相關(guān)，且達(dá)到顯著水平；膠黏性、凝聚性、黏著性與硬度呈負(fù)相關(guān)，并且都達(dá)到顯著水平。因此在本次測(cè)試中，脆度、彈性、膠黏性、凝聚性、黏著性指標(biāo)能和硬度一起反映果實(shí)的質(zhì)地變化情況。

表4 質(zhì)構(gòu)試驗(yàn)所得各項(xiàng)質(zhì)地參數(shù)間的相關(guān)性(R)矩陣表Table 4 Correlation (R) matrix table between texture parameters obtained from texture tests

2.4.3 花椒精油處理對(duì)果實(shí)硬度、脆度和彈性的影響

如圖5所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，果實(shí)硬度、脆度與彈性均呈下降趨勢(shì)；處理組與對(duì)照組之間的脆度、硬度與彈性在14 d之前均未出現(xiàn)顯著差異(圖5-A，圖5-B)；在貯藏第21天時(shí)，處理組可顯著抑制果實(shí)硬度與脆度的降低，處理組硬度和脆度分別比同期對(duì)照高25.5%和42.8%；然而，整個(gè)貯藏期間處理與對(duì)照之間的彈性值無(wú)顯著差異。因此，精油處理抑制了貯藏后期果實(shí)硬度和脆度的下降。

A-硬度；B-脆度；C-彈性圖5 花椒精油處理對(duì)蘋(píng)果梨果實(shí)硬度、脆度和彈性的影響Fig.5 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on hardness, brittleness and springiness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli

2.4.4 花椒精油處理對(duì)果實(shí)膠黏性、凝聚性和黏著性的影響

如圖6所示，果實(shí)的膠黏性、凝聚性和黏著性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；處理與對(duì)照之間的膠黏性在14 d之前均未出現(xiàn)顯著性差異，在貯藏第21天時(shí)，處理可顯著抑制果實(shí)膠黏性的升高，處理組比同期對(duì)照組低10.6%；黏著性在第14天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異，在第14、21天時(shí)處理組比同期對(duì)照組分別低48.2%和8%；而凝聚性在貯藏過(guò)程中并未出現(xiàn)顯著性差異。因此，精油處理抑制了貯藏后期果實(shí)膠黏性和黏著性的升高。

A-膠黏性；B-凝聚性；C-黏著性圖6 花椒精油處理對(duì)蘋(píng)果梨果實(shí)膠黏性、凝聚性和黏著性的影響Fig.6 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on gumminess, cohesiveness and adhesiveness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli fruit

3 討論與結(jié)論

體外抑菌研究結(jié)果表明，花椒精油對(duì)P.expansum和A.alternata均有明顯的體外抑制作用，且對(duì)P.expansum的抑制效果優(yōu)于A.alternata，與花椒精油可抑制F.sulphureum體外生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致[14]。前人研究表明，檸檬烯、芳樟醇和α-蒎烯為花椒精油的主要成分[25-27]，且檸檬烯和芳樟醇均具有抑制禾谷鐮刀菌和灰葡萄孢的體外生長(zhǎng)能力[28]，α-蒎烯可抑制禾谷鐮刀菌的體外生長(zhǎng)[14]。因此，花椒精油對(duì)P.expansum和A.alternata的體外生長(zhǎng)抑制可能與檸檬烯、芳樟醇和α-蒎烯等主要成分的抑菌作用有關(guān)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出含量14.2 μL/L的花椒精油、熏蒸5.6 h為體內(nèi)控制蘋(píng)果梨青霉病的最佳條件，與含量分?jǐn)?shù)15 μL/L的肉桂精油熏蒸櫻桃果實(shí)可顯著延緩果實(shí)腐爛和品質(zhì)下降的結(jié)果相似[7]。

花椒精油對(duì)貯藏過(guò)程中蘋(píng)果梨果實(shí)的色澤、味覺(jué)和質(zhì)地等品質(zhì)無(wú)顯著性影響，但花椒精油的刺激性氣味顯著影響了貯藏前期果實(shí)的香氣，然而，隨著花椒精油的揮發(fā)和果實(shí)香氣的釋放，貯藏后期精油未對(duì)果實(shí)香氣品質(zhì)造成顯著影響，但如何降低花椒精油對(duì)果實(shí)香氣品質(zhì)的影響仍是今后應(yīng)用的改進(jìn)方向。果實(shí)質(zhì)地是用來(lái)表示果實(shí)組織狀態(tài)以及食用時(shí)口感的內(nèi)在品質(zhì)，也是果實(shí)商品性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[29]。與早酥梨質(zhì)構(gòu)多面性評(píng)價(jià)不同[24,30]，脆度、膠黏性、黏著性和硬度均可用于表示蘋(píng)果梨質(zhì)地品質(zhì)的變化，且花椒精油可延緩貯藏后期蘋(píng)果梨果實(shí)脆度和硬度下降，抑制后期果實(shí)膠黏性和黏著性的升高。因此花椒精油可用于蘋(píng)果梨果實(shí)采后青霉病控制，研究結(jié)果可為蘋(píng)果梨的采后貯藏保鮮提供新思路。