一株產(chǎn)胞外多糖微藻的分離鑒定及其多糖抗氧化活性的研究

吳思偉，李思雨，孫寒，劉紅全，何秀苗，黃瑩，吳嘉惠，黃柳媚，龍寒

(廣西民族大學(xué) 海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西 南寧，530006)

海洋微藻多糖具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5-6]、抑菌[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、防輻射[9]等多種生物活性。由于其天然無毒、結(jié)構(gòu)特殊、生物活性強等特點具有很高的開發(fā)價值，成為生物多糖研究的熱點。當(dāng)前海洋微藻多糖的開發(fā)利用主要局限于微藻多糖產(chǎn)量低，所以，篩選高產(chǎn)多糖的藻種是微藻多糖資源開發(fā)利用的先決條件。

本文從廣西北部灣分離篩選海洋微藻，對其進行鑒定，通過響應(yīng)面法對其產(chǎn)糖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期得到高產(chǎn)多糖的微藻藻種，從而為海洋微藻多糖的進一步開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻種：從廣西北部灣防城港紅樹林采樣，分離篩選得到的微藻，編號為GF02；

培養(yǎng)基等試劑均為國產(chǎn)分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DPPH，Biotopped；羥自由基清除能力檢測試劑盒，Solarbio；Plant Genomic DNA Kit，天根生化科技有限公司。

RTOP系列智能人工氣候培養(yǎng)箱，浙江托普儀器有限公司；BX51TRF正立熒光顯微鏡，OLYMPUS；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Epoch酶標(biāo)儀，Bio Tek Instruments; 冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；盧湘儀GL-21M離心機，上海瀘湘儀離心機儀器有限公司；T100型PCR儀，廣州市訊益生物技術(shù)有限公司。

1.2 微藻的分離純化與篩選

1.2.1 采樣

廣西防城港七彩貝丘灣紅樹林保護區(qū)，海潮退后，在沿海紅樹林低洼蓄水處采取水樣。

1.2.2 藻種分離

取200 μL采集到的水樣于BG-11固體培養(yǎng)基上劃線，置于(25±1)℃，光暗周期=12 h∶12 h，光照強度4 000 Lux的條件下培養(yǎng)。分離得到的藻株重復(fù)劃線，直至得到純化的藻種。

1.2.3 篩選

純化好的藻種接種于BG-11液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至穩(wěn)定期的藻液經(jīng)離心得到的上清液用苯酚硫酸法檢測胞外多糖含量，并選擇1株產(chǎn)糖量最高的微藻進行后續(xù)的研究，編號為GF02。

1.3 生長曲線

GF02接種于BG-11液體培養(yǎng)基后，每隔24 h測定藻液680 nm處吸光值。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，OD680為縱坐標(biāo)繪制GF02生長曲線。

1.4 GF02鑒定

取20 μL藻液置于無菌載玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察GF02的形態(tài)特征。

按照試劑盒說明書，使用植物基因組試劑盒提取GF02基因組DNA，以其為模板，使用通用引物進行PCR擴增，獲得其18S rDNA片段。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃終延伸2 min。

通用引物[10]為：1999F：WACCTGGTTGATCCTGCCAGT；1999R：GATCCTTCYGCAGGTTCACCTAC。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證后測序，序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中上進行BLAST比對，挑選同源性較近的序列用Clustal W軟件進行多序列對齊，基于MEGA 7軟件中的鄰接法，1 000次重復(fù)計算的bootstrap，構(gòu)建進化樹。

1.5 胞外多糖含量的測定及初步表征

1.5.1 胞外多糖提取

培養(yǎng)至穩(wěn)定期的微藻，取微藻懸液于8 000 r/min離心10 min，離心上清液經(jīng)60 ℃旋蒸濃縮后用分子質(zhì)量大小為3 000 Da的透析袋透析48 h，Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]∶多糖溶液=1∶5的體積比去除多糖溶液中蛋白，用4倍體積無水乙醇醇沉過夜，8 000 r/min離心10 min去上清液，白色沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得粗多糖。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水準(zhǔn)確稀釋至所需的濃度，取8個1.5 mL離心管按照表1進行加樣操作，向每個試管中加入100 μL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的苯酚溶液，搖勻后加入500 μL濃H2SO4，搖勻后置于100 ℃水浴30 min。取出待冷卻后在490 nm處檢測吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，OD490為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve graph

1.5.3 胞外多糖含量測定

GF02接種于BG-11液體培養(yǎng)基，間隔24 h取200 mL藻液提取多糖，所得胞外粗多糖用1 mL蒸餾水充分溶解，采用苯酚-硫酸法[11]，檢測上清液OD490，根據(jù)線性回歸方程計算多糖含量。

1.5.4 胞外多糖紫外光譜表征

取2 mg胞外粗多糖用適量蒸餾水溶解，以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計掃描400～200 nm的吸光值以檢測胞外粗多糖是否有污染。

1.5.5 胞外多糖紅外光譜表征

取2 mg胞外多糖加入干燥的KBr研磨混勻，用壓片機壓成薄片，在400～4 000 cm-1內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.6 單因素試驗

為研究培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響，通過調(diào)整培養(yǎng)基營養(yǎng)鹽的濃度進行單因素試驗，實驗設(shè)計如表1，接種GF02，培養(yǎng)20 d至產(chǎn)糖穩(wěn)定期，測定GF02產(chǎn)胞外多糖含量，方法同上，每個實驗做3個平行樣。

表1 單因素設(shè)計及水平Table 1 Single factor design and level

1.7 響應(yīng)面分析

在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分的最佳條件，利用Design expert 10軟件進行Box-Behnken實驗設(shè)計，實驗因素及水平如表2所示，每個實驗做3個平行樣。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計因素及水平Table 2 Design factors and levels of Box-Behnken experiment

1.8 抗氧化活性實驗

1.8.1 DPPH自由基清除能力檢測

配制多糖樣品質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、20 mg/mL，取2 mL各濃度樣品溶液加入2 mL質(zhì)量濃度為40 μg/mL DPPH溶液，搖勻黑暗條件放置30 min，517 nm 下測定吸光值,DPPH清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0，蒸餾水加DPPH吸光值；A1，樣品待測液加DPPH吸光值。

1.8.2 羥自由基清除能力檢測

配制質(zhì)量濃度為5、10、15、20、30、40 mg/mL的多糖樣品溶液，根據(jù)羥自由基清除能力檢測試劑盒說明書測定各濃度樣品的羥自由基清除能力，如公式(2)所示：

(2)

式中：B測，待測樣品吸光值；B對，對照管吸光值；B空，空白管吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有結(jié)果均重復(fù)檢測3次，使用Origin 9.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與作圖，利用Design expert 10軟件對響應(yīng)面結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GF02的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在光學(xué)顯微鏡40倍鏡下觀察到的GF02呈球狀，綠色無鞭毛，為單細(xì)胞微藻，初步鑒定可能為小球藻屬(圖2)。

圖2 GF02光學(xué)顯微鏡圖(×40)Fig.2 Optical microscope figure of GF02 (×40)

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

以GF02 DNA為模板，使用通用引物擴增18S rDNA，獲得1.7 kb大小的條帶，測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。GF02與數(shù)據(jù)庫中的小球藻屬Chlorella在同一分支上。測序結(jié)果經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)GF02與C.Sorokiniana(GQ 122327.1)之間的親緣關(guān)系最接近，序列相似度達到99.82%，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)分析可以確定GF02屬于C.Sorokiniana。

圖3 微藻GF02 18S rDNA序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of microalgae GF02 18S rDNA sequence

2.2 GF02生長曲線與胞外多糖含量測定

GF02生長曲線如圖4-a所示，接種初期微藻生長速度較緩慢，1周之后生長速率變快，到第9天達到最高值，第10天之后達到穩(wěn)定期。在穩(wěn)定期前，GF02胞外多糖含量偏低且穩(wěn)定，說明GF02在生長階段很少分泌多糖(圖4-b)，到達穩(wěn)定期后，多糖產(chǎn)量開始快速升高，說明GF02從這個階段開始分泌并積累胞外多糖。浦寅芳等[12]的研究也證明，微藻在穩(wěn)定期才開始大量積累多糖。GF02產(chǎn)糖量在培養(yǎng)20 d時達到高峰，其后糖含量開始有下降的趨勢，這與吳琪璐等[13]的結(jié)果一致，可能是由于培養(yǎng)基養(yǎng)分過分消耗，GF02開始利用胞外產(chǎn)物作為養(yǎng)分來源。

a-生長曲線；b-胞外多糖含量圖4 GF02生長曲線與胞外多糖含量Fig.4 Growth curve and exopolysaccharides content of GF02

2.3 胞外多糖的初步表征

2.3.1 胞外多糖紫外光譜

由圖5可知，GF02多糖在260、280 nm處沒有明顯的吸收峰出現(xiàn)，表明沒有核酸和蛋白質(zhì)的污染。

圖5 胞外粗多糖紫外光譜Fig.5 UV spectra of crude extracellular polysaccharides

2.3.2 胞外多糖紅外光譜

圖6為微藻GF02胞外粗多糖紅外光譜圖，在3 430 cm-1附近的強吸收峰對應(yīng)的是—OH的伸縮振動吸收峰；2 935 cm-1的吸收信號為C—H伸縮振動吸收峰；1 635 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是糖醛酸羧酸鹽的不對稱伸縮振動引起的；波數(shù)1 400 cm-1為C—H彎曲振動吸收峰；1 250 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是C—O—S的彎曲振動吸收峰；在890～900 cm-1沒有觀察到吸收峰，說明此多糖含α-型糖苷鍵，不含β-型糖苷鍵；在770 cm-1處的伸縮振動是α-D-吡喃糖的特征吸收峰；表明GF02胞外粗多糖以α-型吡喃糖為主。

圖6 胞外粗多糖紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of crude extracellular polysaccharides

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 K2HPO4對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響

隨著K2HPO4濃度的增加，胞外多糖產(chǎn)量增加，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度達到0.06 g/L時，藻液中多糖含量最高，此時多糖質(zhì)量濃度為142.513 mg/L，當(dāng)磷酸鹽濃度繼續(xù)增加，多糖產(chǎn)量降低(圖7-a)。

2.4.2 NaNO3對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響

隨著NaNO3濃度的增加，GF02產(chǎn)胞外多糖升高(圖7-b)，當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度達到2.4 g/L時，多糖產(chǎn)量達到最高值，這可能是NaNO3濃度提高導(dǎo)致藻細(xì)胞大量增殖從而提高了多糖的產(chǎn)量。氮源是微藻生長不可或缺的元素之一[11]，NaNO3濃度過低時微藻生長緩慢或停止生長，隨著氮源含量增加，微藻會加速生長，細(xì)胞密度持續(xù)升高；當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度超過2.4 g/L時，多糖含量降低，這可能是鹽濃度過高產(chǎn)生脅迫作用所致。

2.4.3 Na2CO3對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響

根據(jù)圖7-c結(jié)果，胞外多糖含量隨Na2CO3的濃度升高呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)Na2CO3質(zhì)量濃度為0.02 g/L時，多糖產(chǎn)量達最高值。說明低濃度的Na2CO3有利于GF02的生長產(chǎn)糖，而高濃度的Na2CO3則呈現(xiàn)明顯的抑制作用，與曹科偉[14]在北極小球藻的研究結(jié)果一致。

2.4.4 MgSO4對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響

MgSO4對GF02產(chǎn)胞外多糖的影響如圖7-d所示，低濃度MgSO4對GF02產(chǎn)糖影響不大，當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度達到0.09 g/L時，多糖產(chǎn)量達到最高值；此后隨MgSO4濃度升高，多糖產(chǎn)量呈下降趨勢。Mg2+有利于微藻的生長發(fā)育，能夠參與藻細(xì)胞的各種代謝過程[15]，但過量的Mg2+會與培養(yǎng)基中K+、AI3+等產(chǎn)生拮抗作用從而抑制微藻生長[16]。

a-K2HPO4；b-NaNO3；c-Na2CO3；d-MgSO4圖7 四種營養(yǎng)鹽對胞外多糖積累的影響Fig.7 Effects of four nutrients on the accumulation of extracellular polysaccharide

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.5.1 實驗方案設(shè)計與實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design expert 10軟件的Box-Behnken法設(shè)計了29組實驗，實驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計與實驗結(jié)果Table 3 Response surface design and experimental results

采用Design expert 10 對GF02胞外多糖產(chǎn)量的數(shù)據(jù)進行分析，得到各因素的回歸擬合方程Y=207.75+11.65A-2.56B-12.05C+3.95D+4.59AB+4.79AC+14.89AD+1.76BC+0.66BD+4.23CD-21.21A2-23.52B2-20.73C2-23.50D2。

從方差分析結(jié)果可以看出(表4)，校正系數(shù)R2=0.894 2，RAdj=0.788 4；模型(P<0.000 1)為極顯著，失擬項(P>0.05)差異不顯著，說明兩次回歸模型合理且模型擬合度較好，可以對GF02產(chǎn)胞外多糖的結(jié)果進行分析和預(yù)測。根據(jù)回歸方程和方差分析結(jié)果可得，A(NaNO3)、C(MgSO4)、AD(NaNO3與K2HPO4的交互項)以及各個因素的2次項對多糖產(chǎn)量的結(jié)果有顯著影響，各因素的顯著性排序為C>A>D>B。

表4 方差分析表Table 4 analysis of variance(ANOVA)

響應(yīng)面兩兩交互作用如圖8所示，響應(yīng)面圖越陡峭，等高線圖越接近橢圓，說明兩變量之間的交互作用越顯著，反之，響應(yīng)面圖越平緩，等高線圖越接近圓形，說明兩者之間的交互作用越弱[17]。因素AD響應(yīng)面圖最陡峭，其等高線圖橢圓程度最明顯，說明NaNO3(A)和K2HPO4(D)二者的交互作用對GF02產(chǎn)胞外多糖作用效果最明顯，與方差分析的結(jié)果一致。

a-K2HPO4與NaNO3等高線圖；b-Na2CO3與NaNO3等高線圖；c-MgSO4與NaNO3等高線圖；d-K2HPO4與NaNO3響應(yīng)面圖；e-Na2CO3與NaNO3響應(yīng)面圖；f-K2HPO4與Na2CO3響應(yīng)面圖圖8 各營養(yǎng)鹽交互作用對胞外多糖含量的影響Fig.8 Effect of the interaction between various nutrients on the content of extracellular polysaccharide

2.5.2 驗證實驗

Design expert 10預(yù)測出GF02產(chǎn)胞外多糖最優(yōu)參數(shù)為NaNO32.1 g/L，Na2CO30.02 g/L，MgSO40.086 g/L，K2HPO40.06 g/L，此時的多糖產(chǎn)量為209.607 mg/L。根據(jù)預(yù)測出來的條件進行3次平行的驗證實驗，最終測得的胞外多糖質(zhì)量濃度為(216.268±0.922)mg/L，與預(yù)測值相近，說明該模型可行，優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)結(jié)果可靠。

2.6 GF02多糖抗氧化活性

2.6.1 GF02胞外多糖對DPPH自由基清除效果

DPPH 被廣泛用于評價物質(zhì)的抗氧化能力。實驗結(jié)果表明，GF02胞外多糖具有清除DPPH自由基的能力(圖9)，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH清除效果越強，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，DPPH清除率達到36.53%。多糖中存在的還原性末端可以直接作用于自由基，從而達到清除的效果[17]。AMNA[18]判斷微藻多糖結(jié)構(gòu)中的硫酸基團與其對DPPH自由基的清除能力有很大影響，不含硫酸基團的多糖，對DPPH自由基的清除能力低。部分原因是硫酸基團可以削弱多糖之間的氫鍵作用，硫酸多糖以經(jīng)典的方式吸附自由基。GF02胞外多糖紅外光譜表明，其結(jié)構(gòu)中具有硫酸基團，可能與其具有DPPH的清除能力有關(guān)。

圖9 不同濃度GF02粗多糖對DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging ability of different concentrations of GF02 crude polysaccharide

2.6.2 GF02胞外多糖對羥自由基清除效果

羥自由基能作用于體內(nèi)蛋白、核酸等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的損傷，導(dǎo)致突變、致癌[19]，從而引起機體代謝紊亂產(chǎn)生疾病，羥自由基清除能力也是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。羥自由基清除結(jié)果表明，GF02胞外多糖具有明顯的羥自由基清除能力，清除率最高達到67.33%(圖10)，其清除效果與Isochrysisgalbana純化多糖相當(dāng)[20]。研究表明，多糖碳?xì)滏溕系臍湓涌梢耘c羥自由基結(jié)合，從而達到清除羥自由基的效果[21]。HROMADKOVA等[22]發(fā)現(xiàn)不含蛋白成分的多糖比富含蛋白質(zhì)的多糖顯示出更強的羥自由基清除能力。我們提取的GF02胞外多糖已去除了蛋白質(zhì)，這可能對其具有強清除羥自由基能力有一定影響。

圖10 不同濃度GF02粗多糖對羥自由基清除能力Fig.10 hydroxyl radical scavenging ability of different concentrations of GF02 crude polysaccharide

3 結(jié)論

本研究從廣西北部灣防城港紅樹林分離到1株高產(chǎn)多糖的微藻，編號為GF02，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定此株藻為ChlorellaSorokiniana；紅外光譜分析表明GF02胞外粗多糖以α-型吡喃糖為主；通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽對GF02產(chǎn)胞外多糖的最佳條件為NaNO32.1 g/L，Na2CO30.02，MgSO40.086 g/L，K2HPO40.06 g/L，在最佳條件下，GF02產(chǎn)胞外多糖質(zhì)量濃度為216.268 mg/L；體外抗氧化活性評價實驗表明，提取到的GF02胞外粗多糖具有抗氧化活性。

4 展望

從廣西北部灣防城港分離得到具有抗氧化活性多糖的微藻GF02，現(xiàn)階段我們對GF02的產(chǎn)糖條件進行了優(yōu)化，并對其胞外多糖進行初步的表征，但由于粗多糖成分復(fù)雜，在成分分析、結(jié)構(gòu)解析等方面存在很多局限性。下一階段，我們將對提取到的粗多糖進行分離純化，再對純化多糖的分子質(zhì)量、單糖成分和結(jié)構(gòu)進行表征，并對純化多糖的生物活性進行研究，以探討多糖結(jié)構(gòu)與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系。