四川黃酒麥曲發(fā)酵過程中理化特性及微生物多樣性變化研究

唐鰻秋，夏玙，覃鳳陽，吳正云，張文學(xué),2*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(四川大學(xué)錦江學(xué)院 白酒學(xué)院，四川 眉山，620860)

黃酒是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒(酒精體積分數(shù)8%～15%)，在中國已有5 000多年的歷史，其風味獨特且營養(yǎng)豐富[1]。我國黃酒產(chǎn)地多，分布廣，品類繁多，目前黃酒生產(chǎn)主要采用傳統(tǒng)工藝(人工處理)和機械工藝(使用設(shè)備)2種工藝，通常發(fā)酵25～40 d，貯存6～12個月[2]。中國黃酒講究“以麥制曲，用曲釀酒”[3]，麥曲是傳統(tǒng)黃酒釀造的重要原料之一，被譽為黃酒之“骨”。麥曲含有非常豐富的酶系，微生物是麥曲的重要組成部分，對黃酒的品質(zhì)和風味起到了非常重要的作用，主要包含各類絲狀真菌、細菌和酵母菌[4]。想要不斷提高麥曲的品質(zhì)，則需進一步研究其中的微生物，許多科研單位和黃酒釀造從業(yè)者也對其進行了大量的研究。崔夢君等[5]運用PCR-DGGE與MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法分析了黃酒熟麥曲細菌多樣性，結(jié)果顯示芽孢桿菌屬(Bacillus)與魏斯氏屬(Weissella)是優(yōu)勢細菌屬；JI等[6]利用高通量測序技術(shù)對麥曲中的絲狀真菌進行了研究，發(fā)現(xiàn)絲狀真菌在不同的麥曲和不同的發(fā)酵階段存在差異，且在各發(fā)酵階段中，曲霉屬(Aspergillus)一直為優(yōu)勢絲狀真菌屬。目前，關(guān)于黃酒麥曲的微生物群落結(jié)構(gòu)國內(nèi)已有部分相關(guān)研究報道[5-8]，但總體而言還比較淺顯片面，而且揭示麥曲發(fā)酵過程微生物群落演替規(guī)律的研究還鮮有報道。本研究以四川黃酒麥曲發(fā)酵過程曲為研究對象，采用Illumina MiSeq PE300平臺對細菌16S rDNA V3～V4區(qū)和真菌ITS區(qū)序列進行分析，旨在較為全面地解析四川黃酒麥曲發(fā)酵過程中微生物種群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化規(guī)律，探索其與理化性質(zhì)之間的相關(guān)性，為后續(xù)篩選功能微生物，優(yōu)化黃酒麥曲生產(chǎn)工藝并提高麥曲品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒麥曲，四川省某黃酒廠制曲車間；氫氧化鈉、無水乙酸鈉、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、甲醛溶液(37%～40%)(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美國Omega公司；引物，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酒麥曲制備工藝與樣品采集

制曲工藝：以小麥為原料采用固態(tài)發(fā)酵的方式，在適宜的氣溫和水分條件下，小麥經(jīng)過篩選、軋碎、拌水、踩曲、壓制成型后，堆積于曲房內(nèi)保溫培養(yǎng)并進行自然接種，期間翻曲1～2次，經(jīng)7 d左右的固態(tài)發(fā)酵而成。

樣品采集：從發(fā)酵過程初始起每天取樣1次，共計8 d、8次(依次標記為FH1～FH8)，貯藏期取樣1次(第12天，標記為FHC)，共計9個樣品。

1.3.2 理化指標分析檢測

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[9]測定樣品中水分、糖化力、液化力和酸度。采用酒母醪中標準葡萄糖液反滴定的還原糖測定法[10]。

1.3.3 DNA提取及測序

采用試劑盒提取麥曲微生物宏基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果，用NanoDrop2000檢測濃度和純度；使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rDNA基因V3～V4區(qū)域擴增，20 μL PCR體系包括：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 三磷酸脫氧核糖核苷酸(2.5 mmol/L)，0.8 μL正反向引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶(5 μmol/L)，0.2 μL BSA，10 ng DNA模板，補ddH2O至20 μL；使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′)對真菌ITS區(qū)域擴增，20 μL PCR體系包括：2 μL 10×緩沖液，2 μL三磷酸脫氧核糖核苷酸(2.5 mmol/L)，0.8 μL正反向引物(5 μmol/L)，0.2 μL rTaq聚合酶，0.2 μL 牛血清白蛋白(bovine albumin，BAS)，10 ng DNA模板，補ddH2O至20 μL；擴增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并純化回收。送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，用Illumina MiSeq PE300平臺測序。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)分析

對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制與預(yù)處理，得到有效序列[11]，用于后續(xù)分析。使用UPARSE[12]軟件將相似性>97%的序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類。用QIIME[13]計算Alpha多樣性，根據(jù)Ace、Chao1和Shannon指數(shù)對麥曲曲樣中的微生物豐富度和多樣性進行分析。通過BLAST比對，獲得細菌和真菌分別在門和屬水平下的分類情況[14]。用R語言的Vegan軟件包進行典型對應(yīng)分析(canonical correspondence analysis，CCA)并繪圖。使用Origin 2018軟件對麥曲樣品的理化性質(zhì)變化和其中優(yōu)勢微生物進行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥曲發(fā)酵過程的理化生化指標變化

麥曲發(fā)酵過程中溫度的變化情況見圖1-a。成型麥曲在曲房堆積時，鋪上稻草以及及時的關(guān)門封窗措施會起到一定的保溫作用，隨著麥曲中微生物的生理代謝活動開始頻繁，麥曲品溫迅速增加，在麥曲入房堆積的第5天，達到了最高品溫(55 ℃)。在整個發(fā)酵過程中, 麥曲品溫始終高于36 ℃。圖1-b是水分、糖化力、液化力、還原糖和酸度的變化情況。麥曲水分隨發(fā)酵進行而逐漸降低，跟大曲發(fā)酵[15]相似，隨著自然發(fā)酵溫度的增加，水分不斷汽化而減少，但成熟期麥曲的水分略有上升，這可能是由貯存環(huán)境的排濕處理和密閉性較差所導(dǎo)致的。麥曲的品溫和水分為其發(fā)酵過程中微生物的生長繁殖與生理代謝提供了條件。在發(fā)酵第2天左右，糖化力達到887 U左右，隨后下降，可能是因為該階段曲霉屬等多種利于產(chǎn)酶的絲狀真菌生長代謝緩慢，糖化酶產(chǎn)量減少；在發(fā)酵第4天后，糖化力又大幅上升，最后趨于穩(wěn)定在992 U左右。液化力在發(fā)酵第4～7天有一定波動，推測與微生物的菌群演替、生長繁殖有關(guān)，但整體呈上升趨勢，最終穩(wěn)定在0.38 U左右。還原糖含量隨著糖化酶活力變化而變化，可能是因為麥曲中大量淀粉經(jīng)α-淀粉酶及糖化酶分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖等，所以還原糖含量與糖化力有較大關(guān)聯(lián)。麥曲的酸度主要來自微生物的有機酸代謝以及對淀粉、蛋白質(zhì)等的降解[16]。發(fā)酵第3天時酸度達到峰值，這可能是由于此時微生物正在大量繁殖并產(chǎn)生了大量酸類代謝物。發(fā)酵第3天后，酸度又下降到0.55 mmol/10g左右，最后穩(wěn)定在0.57 mmol/10g左右。

a-溫度；b-水分、液化力、糖化力、還原糖含量、酸度圖1 黃酒麥曲發(fā)酵過程中理化指標的變化情況Fig.1 Changes of physicochemical indexes during the fermentation of Huangjiu wheat Qu

2.2 麥曲微生物的Alpha多樣性分析

由表1可知，發(fā)酵過程中麥曲的細菌OTU數(shù)逐漸上升；真菌OTU數(shù)呈先降后增再降的趨勢，最終整體增加。所有樣本的Coverage指數(shù)均大于0.999，說明樣本文庫中序列的覆蓋率高。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)評估物種豐富度，Shannon指數(shù)評估物種均勻度和多樣性。麥曲發(fā)酵前2 d的細菌Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)較小，隨后大幅上升，這表明麥曲在發(fā)酵初期細菌群落豐富度最低，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵作用后菌群豐富度上升。麥曲的細菌Shannon指數(shù)先升后降再上升，最終總體上升，這表明麥曲隨著發(fā)酵的結(jié)束，其細菌群落多樣性最終上升。同理可知，麥曲在發(fā)酵前期真菌群落豐富度較低，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵作用后菌群豐富度總體上升，且麥曲隨著發(fā)酵的結(jié)束，其真菌群落多樣性最終上升。

表1 黃酒麥曲發(fā)酵過程樣品的細菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Analysis of bacterial and fungal Alpha diversity ndexes of fermentation process samples of Huangjiu wheat Qu

2.3 麥曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

麥曲發(fā)酵過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。由圖2-a可知，在門水平上，黃酒麥曲在整個發(fā)酵過程中，變形菌門(Proteobacteria)(21.69%～70.65%)和厚壁菌門(Firmicutes)(28.94%～58.69%)一直為優(yōu)勢菌門。在發(fā)酵后期，變形菌門相對豐度比例相對下降，厚壁菌門相對豐度比例相對上升，且藍藻細菌(Cyanobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)逐漸增多，但最終的成品曲(FHC)中厚壁菌門(44.10%)和變形菌門(21.05%)仍為相對優(yōu)勢菌，這與崔夢君等[5]的報道一致。原因可能是變形菌門中的部分好氧菌可能在低氧、高溫的環(huán)境中難以生存，而厚壁菌門中的芽孢桿菌則可以適應(yīng)這種惡劣的環(huán)境[17]。

由圖2-b可知，在屬水平上，黃酒麥曲發(fā)酵過程樣品的細菌群落多樣性波動上升，其變化情況與上述多樣性指數(shù)一致。在發(fā)酵前期，葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、Kosakonia、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬為相對優(yōu)勢菌，尤其在發(fā)酵第5天(頂溫)時，群落物種最為豐富。在發(fā)酵后期，發(fā)酵溫度逐漸下降，細菌群落組成發(fā)生顯著改變，芽孢桿菌屬和羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)占相對優(yōu)勢，最終形成以芽孢桿菌屬(38.38%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，2.01%)、代爾夫特菌(Delftia，1.80%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium，1.73%)、葡萄球菌屬(1.67%)、氣單胞菌屬(Aeromonas，1.45%)、Sulfuricurvum(1.45%)、Cyanobium_PCC-6307(1.41%)和黃桿菌屬(Flavobacterium，1.18%)為主的細菌群落。劉蕓雅等[18]利用Illumina Miseq測序平臺對紹興黃酒麥曲的細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麥曲中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬(58.65%)，與本研究結(jié)論一致。芽孢桿菌屬的高豐度的形成可能是由于其具有一定的耐高溫、耐酸、耐堿性和復(fù)雜酶系的協(xié)同作用，在麥曲堆放過程中高達55 ℃的環(huán)境下，大部分微生物的生長繁殖受抑制，但芽孢桿菌屬仍能以芽孢的方式生存[19]，且在較高溫度下生長的菌株一般具有較高的孢子耐熱性[20]。

a-門水平；b-屬水平圖2 門水平及屬水平上黃酒麥曲發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure during the fermentation of Huangjiu wheat Qu based on phylum and genus level

麥曲發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)見圖3。由圖3-a可知，在門水平上，黃酒麥曲在整個發(fā)酵過程中，子囊菌門(Ascomycota，59.23%～99.99%)一直為絕對優(yōu)勢菌門；在發(fā)酵后期，擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉亞門(Mucoromycota)逐漸增多，僅次于子囊菌門共同成為絕對優(yōu)勢菌，這與凌夢螢[21]的研究結(jié)果一致。在屬水平上(圖3-b)，在整個發(fā)酵過程中，曲霉屬(42.72%～99.70%)一直都是絕對優(yōu)勢菌屬。在發(fā)酵起始階段，有足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供給，因此形成一個相對復(fù)雜的真菌群落結(jié)構(gòu)；自發(fā)酵開始，真菌微生物數(shù)量逐漸減少，這可能是由于細菌在繁殖過程中釋放出一些可能會抑制真菌生長的物質(zhì)(例如乙酸、乳酸等)；隨著進一步發(fā)酵，一些真菌在適應(yīng)環(huán)境后，可利用殘留的營養(yǎng)物質(zhì)或其他微生物的代謝產(chǎn)物生長，因此真菌微生物數(shù)量又逐漸增多；在發(fā)酵后期，真菌群落組成發(fā)生顯著改變，多樣性較豐富，與上述多樣性指數(shù)一致，最終形成以曲霉屬(42.73%)、Apiotrichum(28.12%)、Cutaneotrichosporon(10.52%)、釀酒酵母(Saccharomyces，6.37%)、棒束孢屬(Isaria，6.10%)、奧默柯達菌屬(Kodamaea，1.39%)為主的真菌群落。曲霉屬等多種絲狀真菌在黃酒發(fā)酵過程中可分泌多種有利于淀粉糖化以及蛋白質(zhì)分解的酶類，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等[22]。其中，糖化酶活力在第7天時最高, 達到了1 030 U(圖1-b)。

a-門水平；b-屬水平圖3 門水平及屬水平上黃酒麥曲發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Fungal community structure during the fermentation of Huangjiu wheat Qu based on phylum and genus level

2.4 細菌群落與理化因子的關(guān)聯(lián)性分析

CCA方法[23]是生物多樣性多元統(tǒng)計的常用方法之一。選擇黃酒麥曲樣品中相對豐度在前10位的細菌群落與糖化力、液化力、還原糖含量和酸度等理化因子進行CCA。如圖4所示，酸度與液化力之間夾角為鈍角，說明2個指標之間呈負相關(guān)；糖化力與液化力之間夾角為銳角，說明2個指標之間呈正相關(guān)，具有協(xié)同效應(yīng)；同理可知，還原糖與糖化力、液化力均呈正相關(guān)，與酸度呈負相關(guān)。不同樣品間的關(guān)系主要有：FH1、FH3和FH5之間相關(guān)性較大，與FH7和FHC均差異較大；FH7與FHC之間差異較大。不同物種間的關(guān)系主要有：葡萄球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、Kosakonia和腸桿菌屬等微生物呈正相關(guān)，與芽孢桿菌屬等微生物呈負相關(guān)。物種和理化因子間的主要關(guān)系有：葡萄球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、Kosakonia和腸桿菌屬與酸度呈正相關(guān)，與糖化力、液化力和還原糖含量呈負相關(guān)；芽孢桿菌屬與糖化力、液化力和還原糖含量呈正相關(guān)，與酸度呈負相關(guān)。由此說明，麥曲中微生物的種群結(jié)構(gòu)對麥曲理化指標具有顯著影響。

圖4 黃酒麥曲發(fā)酵過程中細菌群落與理化因子的CCAFig.4 The CCA between bacterial community and physicochemical factors during the fermentation of Huangjiu wheat Qu

3 結(jié)論

本研究以四川黃酒麥曲發(fā)酵過程酒曲為研究對象，通過高通量測序技術(shù)探究了四川黃酒麥曲發(fā)酵過程中的細菌多樣性和真菌多樣性，對細菌群落而言，葡萄球菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia為發(fā)酵前期的主要菌屬，在發(fā)酵第5天(頂溫)時，群落物種最為豐富，隨著發(fā)酵繼續(xù)進行，在發(fā)酵后期的發(fā)酵溫度逐漸下降，細菌群落組成發(fā)生顯著改變，最終芽孢桿菌屬成為相對優(yōu)勢菌屬；對真菌群落而言，在整個發(fā)酵過程中，曲霉屬一直都是絕對優(yōu)勢菌屬，隨著發(fā)酵的進行，曲霉屬的豐度略有下降，最終形成以曲霉屬、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon、釀酒酵母、棒束孢屬和奧默柯達菌屬為主的真菌群落。此外，對黃酒麥曲發(fā)酵過程中的理化特性變化情況進行了分析，總體而言，隨著黃酒麥曲發(fā)酵結(jié)束，其水分含量下降，而糖化力、液化力、還原糖含量和酸度均上升。由CCA可知麥曲中微生物的種群結(jié)構(gòu)與麥曲理化指標存在明顯關(guān)聯(lián)，且還原糖含量與微生物物種分布相關(guān)程度最大，芽孢桿菌屬對麥曲理化指標的影響較大。本研究探究了黃酒麥曲在不同發(fā)酵階段中細菌和真菌群落及理化特性的變化規(guī)律及相互關(guān)系，有助于構(gòu)建關(guān)于黃酒麥曲微生物多樣性的系統(tǒng)認識體系，后續(xù)可通過分析發(fā)酵過程中微生物具體代謝途徑和機理來探究其對黃酒麥曲及黃酒的風味和品質(zhì)的作用，以期為黃酒工業(yè)化發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。