阿爾茲海默病患者線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)RNA變異的初步研究

袁妮娜 章瑜 丁禹 冷建杭*

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），又稱老年癡呆癥，是一種神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于老年或老年前期，85歲以上發(fā)病率最高，女性多于男性，預(yù)計(jì)至2050年世界上將有1.5億AD患者［1］。AD已成為繼心血管疾病、惡性腫瘤、中風(fēng)之后的第4位死亡原因，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究報(bào)道，β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及線粒體功能障礙皆可導(dǎo)致AD的發(fā)病，而且三者可形成復(fù)雜的惡性循環(huán)，共同加重AD的發(fā)展［2-4］。線粒體基因組是雙鏈環(huán)狀DNA分子，全長16 569-bp，共包含37個(gè)基因，編碼13種蛋白質(zhì)，22種tRNA與2種rRNA［5］。線粒體基因的排列十分緊密，除了D-loop外，相鄰的基因之間幾乎沒有任何非編碼區(qū)。由于線粒體缺乏組蛋白保護(hù)，直接暴露于氧化磷酸化的環(huán)境中，其變異率遠(yuǎn)高于核基因［6］。本研究主要通過篩查AD患者的線粒體tRNA變異情況，探討線粒體tRNA變異與AD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2020年6月在本院確診為AD的患者100例，作為觀察組。其中，男59例，女41例；年齡（75.3±4.2）歲；均符合2011年美國國立衰老研究院和阿爾茲海默病協(xié)會(huì)關(guān)于AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］和美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；排除合并嚴(yán)重的肝腎疾病、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤者。另選取同期在本院體檢的健康者50例作為對(duì)照組。其中，男35例，女15例；年齡（69.5±9.6）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 線粒體tRNA變異篩選 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，使用酚-氯仿的方法提取基因組DNA，-30 ℃保存?zhèn)溆?。以提取的全基因組DNA為模板，進(jìn)行22個(gè)線粒體tRNA基因組的擴(kuò)增，所需的引物參照本課題組前期發(fā)表的論文［9］。其中，PCR的條件為95 ℃變性5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 5 min作為延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后純化，并用Big Dye Terminator Cycle測(cè)序反應(yīng)試劑盒處理，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）3700 DNA自動(dòng)測(cè)序儀直接測(cè)序分析，所得的結(jié)果用DNA STAR軟件與人類線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)劍橋序列（GenBank No. NC_012920）進(jìn)行比對(duì)［10］，篩選變異位點(diǎn)。同時(shí)，對(duì)50例健康對(duì)照個(gè)體進(jìn)行線粒體tRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，方法同上。

1.3 種系進(jìn)化保守分析 使用人、鼠［11］、牛［12］和非洲爪蟾［13］等4個(gè)物種的線粒體DNA序列進(jìn)行種系進(jìn)化保守分析，然后在16個(gè)哺乳動(dòng)物之間進(jìn)行進(jìn)一步的分析，計(jì)算保守性指數(shù)（conservation index，CI），以CI≥75%視為有功能學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD相關(guān)的線粒體tRNA變異篩選 共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)可能的致病性突變：tRNAIleA4263G，tRNAAlaT5655C，tRNACysT5802C，tRNAGluA14693G以及tRNAThrG15927A，見圖1。但是，這些突變?cè)趯?duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)。其中，1例AD患者攜帶A4263G突變（1%），2例攜帶T5655C突變（2%），1例攜帶T5802C突變（1%），2例攜帶A14693G突變（2%），2例攜帶G15927A突變（2%）。

圖1 AD相關(guān)的線粒體tRNA變異位點(diǎn)

2.2 AD相關(guān)的線粒體tRNA變異特點(diǎn)分析 經(jīng)過線粒體tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在這些突變中有2個(gè)變異發(fā)生在線粒體tRNA接收臂上（tRNAIleA4263G和tRNAAlaT5655C），有2個(gè)變異發(fā)生在反密碼子環(huán)上（tRNACysT5802C和tRNAThrG15927A），有1個(gè)變異發(fā)生在TψC環(huán)（tRNAGluA14693G）。有3個(gè)突變破壞了原有的A-T堿基對(duì)（A4263G，T5655C和T5802C），1個(gè)突變破壞了原有的C-G堿基對(duì)（G15927A）。進(jìn)一步的種系進(jìn)化保守分析發(fā)現(xiàn)，這些突變?cè)诓煌奈锓N之間都是高度保守的，提示具有功能學(xué)意義，見表1。

表1 AD有關(guān)的線粒體tRNA變異分析

3 討論

目前，全世界約有4700萬AD患者，65歲以上的老年人群中約有1/8患有AD，相關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)數(shù)十億美元。隨著人類平均壽命的不斷提高，AD對(duì)世界構(gòu)成了巨大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。

成年人大腦的比重雖只占2%，但消耗將近20%的氧氣，為滿足如此巨大的能量需求，大腦配置了巨大的線粒體容量，因此大腦正常功能極易受到線粒體功能障礙的影響，線粒體功能損傷在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［14-16］。本研究對(duì)杭州地區(qū)的100例AD患者和50例健康對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了線粒體tRNA的全基因組突變篩查，結(jié)果提示AD患者的線粒體tRNA突變頻率高于健康對(duì)照組。在這些突變中，位于接收臂上的突變有兩個(gè)，分別為A4263G和T5655C。事實(shí)上，A4263G突變位于線粒體tRNAIle5’起始端，該位點(diǎn)的突變影響了tRNAIle的轉(zhuǎn)錄及RNase P 5’端的加工［17］。A4263G突變會(huì)顯著降低tRNAIle的穩(wěn)定性和線粒體蛋白合成，表明A4263G突變可能會(huì)引起線粒體功能損傷。此外，線粒體T5655C突變位于線粒體tRNAAla的5’末端。功能學(xué)研究表明，該突變導(dǎo)致線粒體RNase P對(duì)tRNAAla前期5’端剪切效率下降30%，ATP水平顯著下降，而ROS水平明顯上升，表明T5655C突變可能引起線粒體功能障礙［18］。

同質(zhì)性的T5802C突變則位于tRNACys基因的反密碼子環(huán)上，反密碼子環(huán)承擔(dān)著密碼子與反密碼子的相互作用以及氨基酸搬運(yùn)工作［19］。從結(jié)構(gòu)上看，線粒體T5802C變異破壞了原有高度保守的堿基對(duì)（30A-40G）。因此，有理由相信該突變會(huì)導(dǎo)致線粒體tRNA代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體蛋白合成受阻。此外，G15927A突變破壞了原有的高度保守的Watson-Crick堿基配對(duì)（28C-42G）。前期研究表明，G15927A突變導(dǎo)致線粒體tRNAThr的氨基?；较陆?9%，嚴(yán)重影響了線粒體蛋白合成，尤其是線粒體ND1和CytB的表達(dá)［20］。

A14693G突變發(fā)生在tRNAGlu基因54位點(diǎn)上，該位點(diǎn)在進(jìn)化上高度保守。與核基因編碼的tRNAs一樣，線粒體tRNA也要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾，在通常情況下tRNAGlu的54位的堿基常需要經(jīng)過修飾才能維持tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性［21］。因此，A14693G變異可能會(huì)影響tRNAGlu的空間結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性，使tRNA的代謝功能障礙，引起線粒體功能損傷［22］。

綜上所述，線粒體tRNAIleA4263G，tRNAAlaT5655C，tRNACysT5802C，tRNAGluA14693G以及tRNAThrG15927A突變會(huì)影響線粒體tRNAs的代謝，導(dǎo)致線粒體蛋白合成受阻、功能損傷，進(jìn)而參與AD的發(fā)病進(jìn)程。由于本研究的樣本量較少，后續(xù)還需擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行進(jìn)一步研究。