川芎嗪聯(lián)合丹參多酚酸對(duì)家兔的抗凝血作用及其機(jī)制

黃楓銘 周啟楊 夏睿思 胡元 李琳 岳明 饒芳 方燕 儲(chǔ)利勝 潘小平*

川芎嗪為川芎活性成分，其通過(guò)拮抗鈣離子、降低血液粘稠度、抑制血小板聚集等發(fā)揮抗血栓作用［1］，臨床上應(yīng)用川芎嗪注射液治療急性腦梗死療效顯著［2］。丹參的有效水溶性成分為丹酚酸類，注射用丹參多酚酸具有通絡(luò)活血的作用，可改善缺血性腦梗死患者的臨床癥狀［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，川芎丹參配伍可以抗凝血、抑制血栓形成以及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，對(duì)于治療腦缺血、腦梗死等瘀血阻滯疾病有較好的療效［4］。丹參川芎嗪注射液的主要成分為鹽酸川芎嗪和丹參素，二者配比為50：1，通過(guò)抗血小板聚集降低血液粘稠度，發(fā)揮抗凝血作用，能夠有效預(yù)防腦血栓的發(fā)生和形成［5］，改善微循環(huán)、抗心肌缺血的作用［6］。目前，關(guān)于川芎與丹參體外抗凝血作用的最佳配比以及是否能夠抑制組織因子活性未見報(bào)道。本研究以家兔體外血液為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探索川芎、丹參的活性成分川芎嗪、丹參多酚酸體外抗凝血作用的最佳配比以及二者拮抗組織因子凝血作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性實(shí)驗(yàn)家兔8只，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 燒杯若干，試管若干，20 mL量筒，10 μL、100 μL、1000 μL移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 川芎嗪注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H22025223，廣東星昊藥業(yè)有限公司），注射用丹參多酚酸（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011，天津天士力之驕藥業(yè)有限公司），丹參川芎嗪注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H22026448，吉林四長(zhǎng)制藥有限公司），20 %氨基甲酸乙酯，生理鹽水。肺組織浸出液制備：取新鮮完整兔肺，剪成小塊后用生理鹽水沖洗表面血液，將其碾磨成糊狀，加入10倍量約50 mL生理鹽水，置于2 ℃冰箱靜置24 h后過(guò)濾，即得肺組織浸液。保存于-20 ℃冰箱冷凍室，實(shí)驗(yàn)前1 h取出融化備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）家兔頸總動(dòng)脈取血：家兔用20 %氨基甲酸乙酯麻醉后進(jìn)行氣管插管、頸動(dòng)脈插管后用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端，準(zhǔn)備燒杯，每次經(jīng)頸總動(dòng)脈取血5～6 mL。（2）川芎嗪的抗凝最適濃度選擇：取5支試管并編號(hào)，每組試管分別加入生理鹽水、川芎嗪注射液（終濃度為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL）。經(jīng)頸總動(dòng)脈取血5 mL后，分別快速向每組試管加入1 mL新鮮血液，混勻后開始計(jì)時(shí)，每隔15 s將試管傾斜一次，至傾斜試管血液不再流動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，以上操作重復(fù)4次，記錄凝血時(shí)間，確定川芎嗪抗凝最適濃度。（3） 川芎嗪與丹參多酚酸的抗凝最佳配比探究：基于以上選擇劑量，另取1只家兔進(jìn)行頸總動(dòng)脈插管，取7支試管并編號(hào)，每組試管分別加入生理鹽水、丹參川芎嗪注射液（終濃度0.102 mg/mL，其中川芎嗪終濃度0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（終濃度0.1 mg/mL），丹參多酚酸注射液（終濃度0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（終濃度0.1 mg/mL）與丹參多酚酸注射液（終濃度0.1 mg/mL）分別按1：1、1：2、1：3配比，以上操作重復(fù)4次，記錄凝血時(shí)間，確定川芎嗪與丹參多酚酸抗凝最佳配比。（4）探究川芎與丹參配伍對(duì)組織因子的影響：基于以上確定的川芎嗪與丹參多酚酸最適配比，另取1只家兔進(jìn)行頸總動(dòng)脈插管，取6支試管并編號(hào)，每組試管分別加入生理鹽水、肺組織浸出液、肺組織浸出液與丹參川芎嗪注射液（終濃度0.102 mg/mL）、肺組織浸出液與川芎嗪注射液（終濃度0.1 mg/mL）、肺組織浸出液與丹參多酚酸注射液（終濃度0.1 mg/mL）、肺組織浸出液與川芎丹參1：2最佳配比，以上操作重復(fù)4次，記錄凝血時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度川芎嗪對(duì)正常家兔血液凝固的影響 生理鹽水對(duì)照組平均凝血時(shí)間為（395.7±17.2） s。加入川芎嗪注射液（終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL）后，各組平均凝血時(shí)間分別為（543.7±20.3）s、（429.7±17.9）s、（351.0±80.6）s、（403.7±127.7）s。結(jié)果表明，與生理鹽水對(duì)照組比較，川芎嗪濃度為0.1 mg/mL時(shí)，家兔的血液凝固時(shí)間最長(zhǎng)（P＜0.01），即川芎嗪抗凝最適濃度為0.1 mg/mL。見表1。

表1 不同濃度川芎嗪對(duì)正常家兔凝血時(shí)間的影響［n=4，（±s）］

表1 不同濃度川芎嗪對(duì)正常家兔凝血時(shí)間的影響［n=4，（±s）］

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，#P＜0.01

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2.2 川芎嗪聯(lián)合丹參多酚酸對(duì)正常家兔血液凝固的影響 生理鹽水對(duì)照組平均凝血時(shí)間為（730.3±21.2）s。與生理鹽水對(duì)照組相比，丹參川芎嗪陽(yáng)性對(duì)照組中，加入丹參川芎嗪注射液（終濃度為0.102 mg/mL）后，平均凝血時(shí)間顯著延長(zhǎng)，為（856.0±24.9）s（P＜0.05）。與丹參川芎嗪陽(yáng)性對(duì)照組比較，川芎嗪組加入川芎嗪注射液（終濃度為0.1 mg/mL），平均凝血時(shí)間為（803.3±3.5）s（P＜0.05）。丹參多酚酸組加入丹參多酚酸注射液（終濃度為0.1 mg/mL），平均凝血時(shí)間為（788.7±89.5）s。加入川芎嗪注射液（終濃度為0.1 mg/mL）配伍丹參多酚酸注射液（終濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/mL）后，平均凝血時(shí)間分別為（744.3±7.1）s（P＜0.05）、（901.0±7.5）s（P＜0.05）、（801.7±9.1）s（P＜0.05）。結(jié)果表明，川芎嗪與丹參多酚酸1：2配比時(shí)，樣本凝血時(shí)間均值最大，即川芎嗪與丹參多酚酸最佳配比為1：2。見表2和圖1。

表2 川芎與丹參配伍對(duì)正常家兔血液抗凝試驗(yàn)結(jié)果［n=4，（±s）］

表2 川芎與丹參配伍對(duì)正常家兔血液抗凝試驗(yàn)結(jié)果［n=4，（±s）］

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與丹參川芎嗪對(duì)照組，▲P＜0.05

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圖1 川芎與丹參配伍對(duì)正常家兔血液抗凝試驗(yàn)結(jié)果

2.3 川芎嗪聯(lián)合丹參多酚酸抑制組織因子的促凝血作用 生理鹽水對(duì)照組平均凝血時(shí)間為（536.3±10.0）s。與生理鹽水對(duì)照組比較，組織因子對(duì)照組凝血時(shí)間顯著縮短，平均凝血時(shí)間為（120.7±4.7）s（P＜0.01）。與組織因子對(duì)照組比較，在肺組織浸出液中加入丹參川芎嗪注射液（終濃度為0.102 mg/mL），凝血時(shí)間顯著延長(zhǎng)，平均凝血時(shí)間為（178.3±6.7）s（P＜0.01），對(duì)組織因子的抑制率為47.7 %。與丹參川芎嗪陽(yáng)性對(duì)照組比較，在肺組織浸出液中分別加入川芎嗪注射液（終濃度為0.1 mg/mL）、丹參多酚酸注射液（終濃度為0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（終濃度為0.1 mg/mL）配伍丹參多酚酸注射液（終濃度為0.2 mg/mL）后，平均凝血時(shí)間分別為（139.3±2.5）s（P＜0.01）、（201.0±13.1）s、（238.3±3.5）s（P＜0.01），對(duì)組織因子的抑制率分別為15.4 %、66.5 %、97.4 %。結(jié)果表明，川芎嗪與丹參多酚酸1：2配比時(shí)，對(duì)組織因子的抑制作用最強(qiáng)，優(yōu)于丹參川芎嗪注射液，且二者聯(lián)合的抑制作用優(yōu)于川芎嗪或丹參多酚酸的單獨(dú)抑制作用。見表3和圖2-3。

表3 川芎與丹參配伍對(duì)組織因子的影響試驗(yàn)結(jié)果［（±s），n=4］

表3 川芎與丹參配伍對(duì)組織因子的影響試驗(yàn)結(jié)果［（±s），n=4］

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，△P＜0.01；與組織因子對(duì)照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與丹參川芎嗪對(duì)照組比較，▲P＜0.01

組別 試劑 新鮮血液（mL）凝血時(shí)間（s）抑制率（%）生理鹽水對(duì)照組 生理鹽水 1 536.3±10.0組織因子對(duì)照組 生理鹽水+肺組織浸出液 1 120.7±4.7△0丹參川芎嗪對(duì)照組 丹參川芎嗪0.102 mg/mL+肺組織浸出液 1 178.3±6.7#47.7川芎嗪組 川芎嗪0.1 mg/mL+肺組織浸出液 1 139.3±2.5*▲15.4丹參多酚酸組 丹參多酚酸0.1 mg/mL +肺組織浸出液 1 201.0±13.1#66.5川芎丹參1：2組 川芎丹參1：2+肺組織浸出液 1 238.3±3.5#▲97.4

圖2 川芎與丹參配伍對(duì)組織因子的凝血時(shí)間影響結(jié)果

圖3 川芎與丹參配伍對(duì)組織因子抑制作用

3 討論

川芎為藥用植物川芎干燥的根莖，具有活血祛瘀、止痛祛風(fēng)的功效［7］。血府逐瘀湯、通竅活血湯中應(yīng)用川芎以起到通絡(luò)散瘀的作用［8-9］。丹參為唇形科植物丹參的根，具有涼血消癰、鎮(zhèn)靜安神之功［10］?！短绞セ莘健藩?dú)活散中加入川芎、丹參以開郁行氣、活血化瘀。利腦心膠囊、通脈顆粒等復(fù)方中成藥的主要成分均為川芎、丹參［11］。川芎、丹參是中醫(yī)臨床常用的一組活血藥對(duì)，其活性成分分別為川芎嗪與丹參多酚酸，二者在體內(nèi)外均有較強(qiáng)的抗凝血活性。川芎嗪在體外被證實(shí)可以延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間（PT）、部分凝血活酶時(shí)間（APTT）以及凝血酶時(shí)間（TT）［12］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果川芎嗪能夠延長(zhǎng)體外凝血時(shí)間的趨勢(shì)一致。據(jù)研究報(bào)道，丹參多酚酸的主要活性成分丹酚酸B、紫草酸可顯著延長(zhǎng)APTT［13］。主要由川芎、丹參提取物等組成的降圣腦康湯，可延長(zhǎng)PT、APTT、TT［14］，提示兩者聯(lián)用具有協(xié)同抗凝血作用。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪與丹參多酚酸配比為1：2時(shí)的抗凝血效果最佳，而且兩者聯(lián)合的抗凝血效果優(yōu)于單獨(dú)作用，可能與兩者共同影響凝血酶原活性或抑制血小板聚集有關(guān)。在體內(nèi)，川芎嗪可通過(guò)降低黏附分子vWF與纖維連接蛋白的水平，進(jìn)而抑制血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，改善血流循環(huán)［15］。此外，川芎嗪與丹參多酚酸在體內(nèi)均可通過(guò)抗血小板聚集、抑制組織因子合成進(jìn)而發(fā)揮抗凝血的作用［1，11，16-17］，但在體外兩者是否能夠直接抑制組織因子的促凝血作用，未見報(bào)道。成春英等［16］研究表明，川芎嗪可在mRNA水平上抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子。丹參多酚酸的主要活性成分丹酚酸B，能夠通過(guò)降低組織因子在動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)的表達(dá)抑制血栓形成［17］。丹參川芎嗪聯(lián)合低分子肝素可下調(diào)肺栓塞大鼠組織因子水平［18］。川芎嗪與丹參多酚酸在體內(nèi)可以通過(guò)抑制組織因子表達(dá)從而發(fā)揮抗凝血作用［16-18］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步判定，川芎嗪與丹參多酚酸配伍對(duì)組織因子體外促凝血活性存在一定拮抗作用，且川芎、丹參1：2配伍的抗凝血作用優(yōu)于單獨(dú)使用。在外源性凝血途徑中，組織因子與FⅦa在Ca2+輔因子存在下結(jié)合形成FⅦa-組織因子復(fù)合物，一方面直接激活FⅩ生成FⅩa，另一方面通過(guò)激活FⅨ間接激活FⅩ，同時(shí)FⅨa通過(guò)正反饋?zhàn)饔没罨疐Ⅶ，最終活化的Ⅹa結(jié)合Ca2+與FⅤa共同形成凝血酶原酶復(fù)合物［19］。因此，川芎嗪與丹參多酚酸配伍起到增效抗凝血作用的機(jī)制，可能與抑制組織因子活性，進(jìn)而抑制FⅦa-組織因子復(fù)合物的形成有關(guān)。后續(xù)可通過(guò)測(cè)定FⅦa-組織因子復(fù)合物及其他凝血因子含量的變化以進(jìn)一步揭示其潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，川芎嗪與丹參多酚酸1：2配比的凝血時(shí)間較丹參川芎嗪對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，而且1：2配比對(duì)組織因子的抑制率達(dá)97.4 %，明顯高于丹參川芎嗪對(duì)照組（47.7 %）。說(shuō)明川芎嗪與丹參多酚酸1：2配比的體外抗凝血效果優(yōu)于臨床使用的丹參川芎嗪注射液（川芎嗪：丹參素為50：1），而且對(duì)組織因子抑制作用更強(qiáng)，可能與增加丹參多酚酸比例有關(guān)，但同時(shí)存在成本高、容易發(fā)生出血等并發(fā)癥的問題。冠心病、腦梗死等的常規(guī)治療多采用降脂、抗凝、溶栓等相應(yīng)藥物治療，并發(fā)癥的發(fā)生率較大，存在一定局限性［6，20］。本研究對(duì)于探究川芎嗪與丹參多酚酸最佳配比治療心腦血管疾病具有潛在的價(jià)值，川芎嗪與丹參多酚酸通過(guò)降低血液粘稠度、改善循環(huán)、抑制血栓形成，輔助治療心腦血管疾病，具有不良反應(yīng)少、安全性好等優(yōu)勢(shì)［21-22］。不過(guò)，川芎嗪與丹參多酚酸配伍的抗凝血機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，后續(xù)可針對(duì)凝血因子、凝血酶原酶復(fù)合物開展研究，為臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。