HPV18融合轉(zhuǎn)錄本E1/CCAT1在宮頸癌篩查中的應(yīng)用

魯偉 姚軼敏 李強(qiáng)

HPV感染與宮頸癌及癌前病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而高危型HPV病毒整合入宿主細(xì)胞是細(xì)胞轉(zhuǎn)化及癌變的關(guān)鍵［1-3］。迄今為止，共有超過250個(gè)HPV-host整合位點(diǎn)被報(bào)道［4］。隨著二代測序及生物信息學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)HPV-host整合后可產(chǎn)生大量的HPV-host融合基因，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄形成新的融合轉(zhuǎn)錄本［5，6-8］。

HPV病毒感染與宿主基因組發(fā)生整合產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本（序列）在癌癥的診斷治療中具有一定意義［5］。HPV18作為HPV高危型病毒，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Hela細(xì)胞系是一類攜帶了HPV18病毒的細(xì)胞株，通過檢測HPV18宿主基因的融合轉(zhuǎn)錄本，有可能為HPV18相關(guān)宮頸癌的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2020年3月于本院行宮頸活檢或手術(shù)治療的HPV感染患者62例。其中，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ21例，CINⅡ/Ⅲ共28例，宮頸癌（cervical carcinoma，CC）13例；年齡35～57歲，中位年齡為46歲。收集62例HPV感染患者經(jīng)陰道鏡活檢、錐切術(shù)或手術(shù)切除的部分宮頸組織，-70 ℃液氮保存，將因?qū)m頸良性病變行全子宮切除的非HPV18感染患者作為對照組。另收集同期門診或體檢進(jìn)行宮頸癌篩查的女性105例，年齡22～65歲，平均41歲。所有患者均經(jīng)上海透景生命科技股份有限公司HPV核酸分型確定為HPV18感染。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng) 人正常宮頸細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞系Hela（HPV18陽性）購自美國典藏培養(yǎng)中心，置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 HPV與人融合基因的引物合成 通過檢索Pubmed SRA數(shù)據(jù)庫，篩選出HPV18陽性的宮頸上皮細(xì)胞的RNA-SEQ數(shù)據(jù)（SRR2185953）。利用生物信息學(xué)方法（Fusion-finder）［9］從HPV18陽性的宮頸上皮細(xì)胞的RNA-seq的數(shù)據(jù)中篩選出可能存在的HPV18病毒-宿主基因融合轉(zhuǎn)錄本。采用PCR等方法對其在HeLa細(xì)胞株、臨床宮頸組織和上皮細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。共篩選出16個(gè)可能存在的HPV-host融合轉(zhuǎn)錄本，針對融合轉(zhuǎn)錄本的基因融合區(qū)域設(shè)計(jì)引物，部分轉(zhuǎn)錄本因序列過短未進(jìn)行驗(yàn)證，共設(shè)計(jì)驗(yàn)證10對引物，引物由上海生工合成，見圖1和表1。

表1 HPV18與宿主產(chǎn)生的融合轉(zhuǎn)錄本及引物信息

圖1 E1/CCAT1融合轉(zhuǎn)錄本（非編碼RNA）產(chǎn)生示意圖

1.4 Hela細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、癌組織基因相對表達(dá)量檢測 收獲培養(yǎng)細(xì)胞1～5×107，移入1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，混勻，室溫靜置5 min；取50～100 mg宮頸組織或1 mL宮頸刷取物置1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol 充分勻漿，室溫靜置5 min。采用核酸提取試劑盒（磁珠法，上海之江生物公司）提取所有標(biāo)本總RNA，具體操作步驟按試劑說明書進(jìn)行。再利用已經(jīng)設(shè)計(jì)好的針對HPV與人融合基因的引物，用TaKaRa公司PCR試劑盒在cobasZ480擴(kuò)增儀上逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，E1/CCAT1基因上游引物：5′-GGTTCATGTCTCGGCACCTT-3′，下游引物：5′-GGTGTGCATCCCAGCAGTAA-3′。C-MYC基因上游引物：5′- ATTTGAGGCAGTTTACATTATGG -3′，下游引物：5′-AAACACAAACTTGAACAGCTAC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參對照。引物反應(yīng)體系為20 μL（包括上下游特異性PCR引物各0.8 μL、TaKaRa Ex Taq HS 1.2 μL、PrimeScript RTaseMix 0.4 μL、滅菌超純水4.8 μL、One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、total RNA 2 μL）。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃5 min，95 ℃10sec，20℃/sec，進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95 ℃5sec，60℃ 20sec，20℃/sec循環(huán)40次。采用2-△△Ct法計(jì)算E1/CCAT1、C-MYC相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，多組間比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析。組織E1/CCAT1相對表達(dá)水平與C-MYC的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV18陽性的HeLa 細(xì)胞中E1/CCAT1融合轉(zhuǎn)錄本表達(dá) HeLa細(xì)胞株中可檢出4個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本，包括E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）、E1/CASC19（E1_1489084/Chrom8_128，215，465）、E1/intergenic（E1_1489084/Chrom8_128，241，488）、E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，221，962）。其中，融合轉(zhuǎn)錄本E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）的檢出豐度明顯高于其他融合轉(zhuǎn)錄本。E1/CCAT1融合轉(zhuǎn)錄本，宿主基因?yàn)镃CAT1，整合位點(diǎn)位于8號染色上的128，231，211；HPV病毒基因E1，整合位點(diǎn)位于E1上的929。以下黑色加粗部分為插入的HPV E1基因序列：TTTCAGAAAGAGCGTCAGGGTTGACAG TAGCTGTGATGCTCCAGATGGAGCTGCGGATAACAGC ATATAAGTTTCAGGGCAGTGGTTGAGGGGCTGTGGGA GGGTGGGGAGGGAAGATGGATGACTTTTCTCAACCAT CTGTATTTGATTGGAATATTGTGTGACTTGTGAAATAG AATTAAAGATATGATCTTCTTATGGTCTTCTCACAGTT TTCAAGGGATTTTAGGAGAAAACGCTTAGCCATACAG AGCTTCTGGATCAGCCATTGTTGCTTCTGCTGGGATGA AACTTCAAAGTCGATGTTGTCAGTGAATGCTCCAGAT GGATTGCAGAGAAGACCAAAGTTCATGTCTCGGCACC TTTCGCAT。

2.2 E1/CCAT1在宮頸病變組織和脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況 在62例HPV18感染患者的宮頸組織中共檢測出17例E1/CCAT1的表達(dá)，CIN1陽性表達(dá)率為23.8%（5/21），CINⅡ/Ⅲ為25.0%（7/28），宮頸癌38.5%（5/13），相對于宮頸脫落上皮細(xì)胞9.5%（10/105）的陽性表達(dá)率，顯示出較高的融合比例。三組組織標(biāo)本的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.016，P＞0.05），見表2。但是，相對表達(dá)水平隨著宮頸癌病變程度加重，呈現(xiàn)逐級升高趨勢，見圖2a。

表2 不同來源的HPV18感染標(biāo)本E1/CCAT1表達(dá)情況

2.3 E1/CCAT1與C-MYC表達(dá)的相關(guān)性分析 通過檢測上述組織標(biāo)本中C-MYC，其相對表達(dá)水平亦隨著宮頸病變程度呈現(xiàn)上升趨勢，見圖2b。通過對宮頸病變組織中E1/CCAT1和C-MYC的表達(dá)水平進(jìn)行Person相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩組之間呈正線性相關(guān)（r=0.918，P＜0.001），見圖2c。

圖2 E1/CCAT1和C-MYC的相對表達(dá)量及相關(guān)性分析

3 討論

高危型HPV感染是發(fā)生宮頸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素［10］，WHO推薦高危HPV檢測用于宮頸癌初篩，HRHPV陽性者再行陰道鏡檢查［11-12］。成年女性幾乎均會(huì)發(fā)生HPV感染，雖然95%以上的宮頸癌均可檢測到HPV病毒的癌蛋白表達(dá)，但僅有極少數(shù)高危型HPV感染最終會(huì)發(fā)展成為宮頸癌。深入探索HPV的致病機(jī)制及其與宮頸癌的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，尋找可以精確反映宮頸癌發(fā)生及預(yù)后的標(biāo)記物，開發(fā)高效、簡便的宮頸癌癌前病變診斷新技術(shù)，具有重要的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)意義。研究發(fā)現(xiàn)，HPV與宿主基因組的整合是宮頸細(xì)胞永生化過程中的“one-shot”機(jī)制［13］。HPV 感染宿主細(xì)胞后通常以游離狀態(tài)存在，首先潛伏在基底細(xì)胞層，其DNA以獨(dú)立的外源性染色體狀態(tài)游離于被感染細(xì)胞核內(nèi)，繼之HPV核酸整合至宿主細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)病毒癌基因的同時(shí)導(dǎo)致宿主細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，并逐漸發(fā)展為宮頸癌。

E1是解旋酶，也是HPV編碼的唯一酶［14］。HeLa細(xì)胞中沉默的HPV18 E1上調(diào)了參與宿主免疫反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)控的基因，表明E1在致癌作用中具有一定作用［15］。E1還可以誘導(dǎo)DNA損傷，抑制細(xì)胞生長并募集宿主細(xì)胞來增加病毒復(fù)制［16］。壓力作用下，E1以低保真度復(fù)制HPV DNA，并產(chǎn)生雙鏈斷裂，可能是致癌因素的驅(qū)動(dòng)因素［17］。研究發(fā)現(xiàn)，人類8號染色體的結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）基因座與HPV18病毒的E1_1489084基因融合產(chǎn)生的融合轉(zhuǎn)錄本E1/CCAT1，C-MYC基因是位于染色體8q34上的一個(gè)癌基因，位于CCAT1基因座下游，作為轉(zhuǎn)錄因子受CCAT1調(diào)控。CCAT1是一個(gè)2628 nt 的非編碼長鏈RNA（long noncoding RNA，lncRNA），位于染色體8q24.21，與多種生物學(xué)過程如染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活劑干擾有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是重要的致癌基因［18-19］。CCAT1位于轉(zhuǎn)錄因子C-MYC 附近，可與C-MYC相互作用進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性［20-21］。MYC是重要的原癌基因，C-MYC在細(xì)胞周期中起重要調(diào)控作用，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，其表達(dá)水平與癌細(xì)胞增殖程度有關(guān)［22］。C-MYC的異常激活具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖的作用，從而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程［23］。本研究結(jié)果顯示，E1/CCAT1的表達(dá)水平隨著宮頸病變程度的加重而呈升高趨勢，且E1/CCAT1同C-MYC的表達(dá)高度正相關(guān)，表明HPV整合會(huì)影響臨近的基因，最常受影響的基因就是MYC基因。CCAT1位于MYC基因上游可增強(qiáng)C-MYC的表達(dá)，過表達(dá)的CCAT1不僅具備其內(nèi)源分子的特性，還使得MYC基因表達(dá)上調(diào)，并明顯促進(jìn)了腫瘤生長。陳玲玲等［24］發(fā)現(xiàn)，順式過表達(dá)的CCAT1不僅具備其內(nèi)源分子的特性，還可上調(diào)MYC基因表達(dá)，明顯促進(jìn)腫瘤生長，表明CCAT1可以調(diào)控其下游相近的MYC基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生中起著一定作用。

本文在宮頸上皮細(xì)胞中共驗(yàn)證105例，陽性10例，陽性率約為9.5%。結(jié)果表明，并不是所有HPV18感染的患者都存在HPV-host整合，可能只有約10%的患者有必要再行陰道鏡檢查。陽性結(jié)果的出現(xiàn)表明，融合轉(zhuǎn)錄本在宮頸病變過程中具有一定作用，而陽性率的升高更加表明HPV18整合產(chǎn)生的融合轉(zhuǎn)錄本與宮頸病變密切相關(guān)。因?yàn)閮H有少數(shù)高危HPV感染最終發(fā)展成為宮頸癌，所以采用與宮頸細(xì)胞癌變密切相關(guān)的融合轉(zhuǎn)錄本作為宮頸癌初篩指標(biāo)可能優(yōu)于單純采用高危型HPV感染作為后繼陰道鏡檢查的指針。HPV整合宿主基因形成融合轉(zhuǎn)錄本可能成為宮頸癌篩查的新指標(biāo)，E1/CCAT1融合轉(zhuǎn)錄本具備成為反映宮頸癌病變標(biāo)志物的潛能。由于融合轉(zhuǎn)錄本檢測能夠縮小宮頸癌目標(biāo)人群范圍，還可以避免過度醫(yī)療造成的醫(yī)療資源浪費(fèi)，降低醫(yī)保資金的支出。

綜上所述，高危HPV與宿主染色體的整合是宮頸癌癌前病變向?qū)m頸癌進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，HPV整合位點(diǎn)附近宿主基因組的表達(dá)變化及整合后病毒癌基因的表達(dá)增強(qiáng)可能是宮頸癌發(fā)病的重要導(dǎo)火索。本研究所測得的融合轉(zhuǎn)錄本極有可能是通過調(diào)控CCAT1基因組的表達(dá)而發(fā)揮其在宮頸癌病變中的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。