基于初級(jí)膽汁酸合成探討乳香醋炙對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的增效機(jī)制

彭詩(shī)濤，劉振麗，王 淳，張琳琳，萬(wàn)曉瑩，宋志前*，寧張弛*

? 藥理與臨床?

基于初級(jí)膽汁酸合成探討乳香醋炙對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的增效機(jī)制

彭詩(shī)濤1，劉振麗1，王 淳1，張琳琳2，萬(wàn)曉瑩1，宋志前1*，寧張弛1*

1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700 2. 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052

從對(duì)初級(jí)膽汁酸合成的影響，探討醋炙增強(qiáng)乳香改善潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的作用機(jī)制?；?,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）法建立UC大鼠模型，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-TQ-MS）法測(cè)定大鼠血漿中6種初級(jí)膽汁酸含量；進(jìn)一步借助L-02肝細(xì)胞模型，圍繞初級(jí)膽汁酸合成場(chǎng)所肝臟，探究乳香醋炙前后及醋炙前后差異成分3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸（3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid，ADHBA）的干預(yù)作用，以ELISA法考察膽汁酸前體膽固醇變化，采用qRT-PCR法測(cè)定游離型初級(jí)膽汁酸合成酶膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，）、甾醇12α-羥化酶（sterol 12α-hydroxylase，）、甾醇-27-羥化酶（27?hydroxycholesterol，）、氧甾醇-7α-羥化酶（oxysterol-7α-hydroxylase，）、結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶膽汁?；o酶A合成酶（bile acyl-CoA synthetase，）和膽汁酸-輔酶A：氨基酸正?；D(zhuǎn)移酶（bile acid-CoA: amino acid?acyltransferase，）mRNA表達(dá)水平。乳香醋炙后，對(duì)UC模型大鼠血漿中的初級(jí)膽汁酸總量和游離型、結(jié)合型初級(jí)膽汁酸總量的回調(diào)水平更接近正常組。乳香、醋乳香、醋炙前后差異成分ADHBA均可降低膽汁酸合成前體膽固醇水平，但以醋乳香及ADHBA的調(diào)控作用更加明顯。醋乳香對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成經(jīng)典途徑中CYP7A1的抑制和CYP8B1的上調(diào)作用以及對(duì)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶BACS、BAAT的上調(diào)作用強(qiáng)于乳香組，乳香聯(lián)合ADHBA組同醋乳香組上調(diào)作用一致。乳香醋炙后對(duì)初級(jí)膽汁酸合成調(diào)控作用主要是基于其對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸經(jīng)典合成途徑中限速酶CYP7A1的抑制，回調(diào)機(jī)體在UC病理狀態(tài)下的初級(jí)膽汁酸水平，進(jìn)而增強(qiáng)乳香對(duì)UC的改善作用；ADHBA可能為乳香醋炙增效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

乳香；醋炙；初級(jí)膽汁酸；潰瘍性結(jié)腸炎；增效；膽固醇-7α-羥化酶；3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確的結(jié)腸和直腸慢性非特異性疾病。臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛及黏液膿血便[1]。近年來(lái)，UC發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)[2]，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。中醫(yī)學(xué)將UC歸屬于“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇。劉元素的《素問(wèn)玄機(jī)原病式》對(duì)其病機(jī)進(jìn)行了闡述，指出：“諸瀉痢皆屬于濕，濕熱甚于腸胃之內(nèi)，而腸胃怫郁，以致氣液不得宣通而成”。濕熱滯留于大腸，與氣血相搏結(jié)，使腸道傳導(dǎo)失司、脂絡(luò)受傷、氣凝血滯，繼而血敗肉腐化膿?！盎鲂袣狻笔侵嗅t(yī)臨床治療遵循的法則之一[3]。

乳香具有活血行氣化瘀、消腫止痛的功效，為橄欖科植物乳香樹(shù)Birdw.及同屬植物–Birdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂[4]。臨床研究證實(shí)，乳香醇制劑對(duì)UC有很好的療效，80%的患者服用后病情得到緩解[5]，其對(duì)慢性結(jié)腸炎II、III級(jí)患者有效率分別為100%和60%[5-6]。炮制是中醫(yī)臨床用藥特色。傳統(tǒng)炮制理論認(rèn)為，乳香經(jīng)過(guò)醋炙后，可以增強(qiáng)其活血行氣止痛的功效，降低刺激性[7]。本課題組前期研究顯示，乳香和醋乳香均可改善UC模型大鼠結(jié)腸病變和炎性細(xì)胞因子水平，且醋炙后作用增強(qiáng)[8]，并從醋炙前后化學(xué)成分的變化[9-12]、醋中活性成分作用[13]以及醋炙后活性成分吸收增強(qiáng)角度[14]，對(duì)增效原因進(jìn)行了研究。其中，3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸（3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid，ADHBA）在乳香醋炙后含量增加10倍以上[9]，是值得關(guān)注的主要差異成分之一。

膽汁酸與UC等腸道疾病關(guān)系密切[15]。腸道UC狀態(tài)可擾動(dòng)機(jī)體內(nèi)初級(jí)膽汁酸水平發(fā)生變化[16-17]。肝臟是膽汁酸合成的主要部位。在肝臟中，膽固醇在膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、甾醇12α-羥化酶（sterol 12α-hydroxylase，CYP8B1）、甾醇-27-羥化酶（27?hydroxycholesterol，CYP27A1）、氧甾醇-7α-羥化酶（oxysterol-7α-hydroxylase，CYP7B1）作用下生成游離型初級(jí)膽汁酸，即膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）。CA、CDCA再通過(guò)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶膽汁?；o酶A合成酶（bile acyl-CoA synthetase，BACS）和膽汁酸-輔酶A：氨基酸正?；D(zhuǎn)移酶（bile acid-CoA: amino acid?acyltransferase，BAAT）作用與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合，產(chǎn)生結(jié)合型初級(jí)膽汁酸牛磺膽酸（taurocholic acid，TCA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、?；蛆Z去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）和甘氨鵝去氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）[18]。

為探究醋炙增強(qiáng)乳香對(duì)UC改善作用的本質(zhì)，本研究基于2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）法構(gòu)建UC模型，建立初級(jí)膽汁酸含量測(cè)定方法，明確乳香醋炙前后對(duì)機(jī)體初級(jí)膽汁酸水平的影響。通過(guò)探究乳香醋炙前后對(duì)膽固醇、初級(jí)膽汁酸合成酶CYP7A1、CTP27A1、CYP7B1、CYP8B1、BACS與BAAT的作用，從初級(jí)膽汁酸合成角度揭示乳香醋炙增效的機(jī)制。

1 材料

1.1 血漿樣本

血漿樣本來(lái)自于正常、UC模型、乳香（0.45 g/kg，臨床等效劑量）、醋乳香（0.45 g/kg，臨床等效劑量）組大鼠，為本課題組前期進(jìn)行乳香醋炙前后對(duì)UC大鼠抗炎作用對(duì)比研究實(shí)驗(yàn)所收集[8]。

1.2 飲片

乳香購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為橄欖科植物乳香樹(shù)Birdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂。醋乳香為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)檢查符合《中國(guó)藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 藥品與試劑

ADHBA為實(shí)驗(yàn)室自制（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）；對(duì)照品CA（批號(hào)T16J8Q28663）、CDCA（批號(hào)Z01011LA14）、TCA（批號(hào)M26A8E42428）、GCA（批號(hào)Y08O7K22248）、TCDCA（批號(hào)DST180920-031）、GCDCA（批號(hào)Y29M9K57235）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；對(duì)照品GCA-d4（批號(hào)739723）、CA-d4（批號(hào)614149）、DCA-d4（批號(hào)614130）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；、、、、、、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)11965092）、胎牛血清（批號(hào)10099141）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膽固醇ELISA測(cè)定試劑盒（批號(hào)CEB701Ge）購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；Trizol試劑（批號(hào)ET101-01）、Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR試劑盒（批號(hào)AT341-01）、Trans Script Top Green qPCR Super Mix試劑盒（批號(hào)AT131-01）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Waters Xevo TQ-S micro質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；LWFS31310T型實(shí)驗(yàn)室水純化系統(tǒng)[頗爾富迪生物分析儀器（上海）有限公司]；VORTEX2型渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；TGL-16B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；3111型CO2培養(yǎng)箱、?80 ℃ Freezer超低溫冰箱、NANODROP 2000c型分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；CFX-96型qRT-PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 乳香醋炙前后對(duì)UC大鼠血漿中初級(jí)膽汁酸含量的影響

2.1.1 系列混合對(duì)照品溶液的制備 分別取CA、TCA、GCA、CDCA、TCDCA、GCDCA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成各對(duì)照品溶液濃度為30 mmol/L的儲(chǔ)備液。精密吸取適當(dāng)體積的各儲(chǔ)備液，混勻，制成上述各成分濃度分別為2 716.79、2 365.72、2 083.33、2 445.36、2 055.23、2 513.23 μmol/L的混合對(duì)照品溶液。通過(guò)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行倍比稀釋，得系列混合對(duì)照品溶液。此外，設(shè)定混合對(duì)照品溶液濃度的1/2、1/4、1/8為高、中、低3個(gè)濃度，進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)考察。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)混合溶液的制備 分別取GCA-d4、CA-d4、DCA-d4對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成終濃度為100 μmol/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別精密吸取各儲(chǔ)備液1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，得內(nèi)標(biāo)混合溶液。

2.1.3 血漿供試品前處理方法 精密吸取各組大鼠待測(cè)血漿50 μL，分別精密加入甲醇200 μL及內(nèi)標(biāo)混合溶液50 μL，渦旋30 s，充分混合，4 ℃、14 000 r/min離心10 min。精密吸取上清液200 μL，氮吹干燥后，精密加入甲醇50 μL，充分溶解，即得。

2.1.4 質(zhì)控系列樣品制備

（1）質(zhì)控樣品制備：精密等量吸取各組血漿供試品于離心管中，渦旋混勻，即得。

（2）提取前加入對(duì)照品的質(zhì)控樣品制備：精密吸取50 μL質(zhì)控樣品，共6份，分別精密加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液及50 μL高、中、低3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液、150 μL甲醇，渦旋10 s，4 ℃、14 000 r/min離心10 min。取200 μL上清液，氮吹干燥后，精密加入50 μL甲醇，充分溶解，即得。

（3）提取后加入對(duì)照品的質(zhì)控樣品制備：精密吸取50 μL質(zhì)控樣品，共6份，分別精密加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液及200 μL甲醇，渦旋混合10 s，4 ℃、14 000 r/min離心10 min。取200 μL上清液，氮吹干燥后，分別精密加入50 μL高、中、低3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，充分溶解，即得。

2.1.5 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～6.0 min，25%～40% B；6.0～20.0 min，40%～70% B；20.0～20.1 min，70%～100% B；20.1～23.0 min，100% B；23.0～23.1 min，100%～25% B；23.1～25.0 min，25% B；弱洗溶劑為水-乙腈（95∶5），強(qiáng)洗溶劑為異丙醇；體積流量為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為10 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.6 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧電離源（ESI）；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；離子源溫度為150 ℃；去溶劑溫度為550 ℃；去溶劑氣體體積流量為1000 L/h；碰撞氣體體積流量為0.25 mL/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行掃描。各膽汁酸成分的主要質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.7 方法學(xué)考察

（1）專屬性考察：取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下的血漿供試品前處理方法制備，采用“2.1.5”項(xiàng)下色譜方法及“2.1.6”項(xiàng)下質(zhì)譜方法進(jìn)行分析。

表1 膽汁酸成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

Table 1 Mass spectrometric parameters of bile acids

序號(hào)膽汁酸成分定量離子對(duì)(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eVtR/min內(nèi)標(biāo) 1CA407.52＞69.10403519.74CA-d4 2TCA514.42＞514.4210010.53GCA-d4 3GCA464.80＞74.0053014.36GCA-d4 4CDCA391.06＞391.0640024.59DCA-d4 5TCDCA498.34＞80.031205015.21GCA-d4 6GCDCA448.34＞73.76406020.90CA-d4

（2）線性關(guān)系、定量下限（LLOQ）和檢測(cè)下限（LLOD）考察：取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，加入活性炭，配制成活性炭質(zhì)量濃度為0.053 g/mL的血漿混懸液，渦旋1 h使其充分接觸吸附，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清，得到空白基質(zhì)溶液。精密吸取空白基質(zhì)50 μL，制備6份，依次精密加入“2.1.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液50 μL，甲醇150 μL和內(nèi)標(biāo)混合溶液50 μL，渦旋10 s，振蕩3 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min。取上清液200 μL，氮吹干燥后，精密加入甲醇50 μL，充分溶解，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（）為橫坐標(biāo)，得含基質(zhì)對(duì)照品溶液線性關(guān)系。將對(duì)照品濃度不斷稀釋，測(cè)定峰面積，以信噪比（/）＝10確定為本方法的LLOQ，以/＝3確定為本方法的LLOD。

（3）精密度和重復(fù)性考察：取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下的血漿供試品前處理方法配制低、中、高3個(gè)濃度樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察本方法的日內(nèi)、日間精密度。取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，制備6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下的血漿供試品前處理方法配制低、中、高3個(gè)濃度樣品，進(jìn)行測(cè)定，考察方法的重復(fù)性。

（4）加樣回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察：在低、中、高3個(gè)濃度下，將相同體積“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算各膽汁酸成分峰面積比值，得到回收率。

將“2.1.7（2）”項(xiàng)下的線性關(guān)系用含血漿基質(zhì)的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即血漿基質(zhì)，將“2.1.1”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即溶劑；采用回收因子（recovery factors，RF）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

RF＝血漿基質(zhì)/溶劑

（5）穩(wěn)定性考察：取“2.1.4”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法分別配制低、中、高濃度樣品，平行制備6份。分別于室溫下放置24 h、于?20 ℃保存2個(gè)月、連續(xù)“冷凍-融化”3個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行分析，測(cè)定血漿中目標(biāo)成分的實(shí)際濃度，考察樣品的短期室溫穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性。

（6）殘留考察[19]：精密吸取“2.1.7（2）”項(xiàng)下含基質(zhì)對(duì)照品溶液的最高濃度樣品進(jìn)行分析后，對(duì)空白溶劑進(jìn)行分析，測(cè)定各成分的殘留濃度（殘留），計(jì)算殘留率。

殘留率＝殘留/LLOQ

2.1.8 含量測(cè)定 取各組大鼠血漿，按照“2.1.3”項(xiàng)方法制備，測(cè)定各組大鼠血漿膽汁酸含量。

2.1.9 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若兩項(xiàng)檢驗(yàn)均符合，則進(jìn)一步采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用LSD-檢驗(yàn)。

2.2 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)膽固醇水平的影響

2.2.1 藥物制備

（1）乳香溶液和醋乳香溶液的制備：各取乳香、醋乳香粉末約0.5 g，精密稱定，分別加入95%乙醇75 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液減壓回收溶劑至干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，即得。

（2）ADHBA溶液的制備：取ADHBA約4 mg，精密稱定，以無(wú)水乙醇溶解，定容于10 mL量瓶中，搖勻，即得。

（3）乳香＋ADHBA溶液的制備：取乳香粉末約0.5 g，精密稱定，加入95%乙醇75 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液減壓回收溶劑至干，得乳香殘?jiān)?。另取ADHBA約4 mg，精密稱定，與乳香殘?jiān)旌?，用無(wú)水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中，即得。

吸取0.5 mL 10%聚山梨酯80的PBS溶液于15 mL離心管中，將離心管置于渦旋振蕩器上，開(kāi)啟振蕩器，使溶液始終保持渦旋狀態(tài)。分別吸取上述各溶液100 μL，逐滴緩慢加入離心管中，邊渦旋邊滴加，然后各加入DMEM培養(yǎng)基至10 mL混合均勻后，用針頭濾器除菌，即得。

2.2.2 L-02細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇L-02細(xì)胞，用含13%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)3～4代后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104/孔接種至96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后，加入不同質(zhì)量濃度（5、10、25、50、100、200 μg/mL）醋乳香溶液，孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（）值。

2.2.4 ELISA法檢測(cè)膽固醇水平 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×106/孔接種至6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白溶劑組、乳香組、醋乳香組、ADHBA組和乳香＋ADHBA組。用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，再分別用“2.2.1”項(xiàng)下制備的含藥物溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)膽固醇含量。

2.3 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1和CYP7B1 mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.2.4”項(xiàng)，收集細(xì)胞待測(cè)。取細(xì)胞約1×106個(gè)，加入1 mL裂解液，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Premix Dimer Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。、、、和引物序列見(jiàn)表2。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，共40個(gè)循壞，以2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)量。

表2 CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1和GAPDH引物序列

Table 2 Primers sequence of CYP7A1, CYP8B1, CYP27A1, CYP7B1 and GAPDH

引物序列 (5’-3’) CYP7A1F: GGAAAACCTCCAACGTATCATG R: GGAAAGACTTTGTCGAATTGCT CYP8B1F: GTATTTGGATACCGTTCAGTGC R: TTTGGACGTCAGCATTACAAAG CYP27A1F: AAGGCTGATCCAGAAGTACAAG R: GCCCACTTTCTTATTGGGAAC CYP7B1F: ACATACCCATTGAGCTTCTAGG R: AAAAACTTCTGACCATCCTTGC GAPDHF: TATGACAACAGCCCTCAAGAT R: AGTCCTTCCACGATACCA

2.4 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶BACS、BAAT mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.2.4”項(xiàng)，收集細(xì)胞待測(cè)。提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA、擴(kuò)增方法同“2.3”項(xiàng)。、和引物序列見(jiàn)表3。

表3 BACS、BAAT和GAPDH引物序列

Table 3 Primers sequence of BACS, BAAT and GAPDH

引物序列 (5’-3’) BACSF: TCCCGAAGCCAGCCATCCTC R: GATCCCAACGACAAGTCCCATCAC BAATF: GGTCTTTGGCTCAGGCGTTGG R: ACCGTGGCTGTGACTTGCTTTAG GAPDHF: TATGACAACAGCCCTCAAGAT R: AGTCCTTCCACGATACCA

3 結(jié)果

3.1 乳香醋炙前后對(duì)UC大鼠血漿中初級(jí)膽汁酸含量的影響

3.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

（1）專屬性：如圖1所示，目標(biāo)成分在相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)或其他內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

（2）線性關(guān)系、LLOQ和LLOD：6個(gè)初級(jí)膽汁酸成分的線性方程見(jiàn)表4，為0.999 0～0.999 6，表明其在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以滿足血漿中膽汁酸靈敏檢測(cè)的要求。

（3）精密度和重復(fù)性：6個(gè)膽汁酸成分的精密度和準(zhǔn)確度分別為1.35%～6.93%、1.32%～5.00%，均＜15%[20]，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

（4）回收率和基質(zhì)效應(yīng)：各成分在低、中、高3個(gè)濃度下的回收率均為85.61%～113.86%，RSD值均低于15%，表明回收率結(jié)果符合檢測(cè)要求[19]?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果表明，CA、TCA、GCA、CDCA、TCDCA和GCDCA的RF值分別為0.87、1.24、0.92、1.32、0.87、1.14，基質(zhì)效應(yīng)可在接收范圍內(nèi)[19]。

圖1 膽汁酸成分的MRM色譜圖

（5）穩(wěn)定性：質(zhì)控樣品各膽汁酸成分的含量變化為?14.07%～14.05%，均小于15%，表明質(zhì)控樣品短期穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性及凍融-循環(huán)穩(wěn)定性均符合標(biāo)準(zhǔn)[20]。

（6）殘留考察：TCA、TCDCA和CA-d4存在殘留，殘留率分別為18.64%、1.65%和1.45%，符合待測(cè)成分殘留小于LLOQ的20%，內(nèi)標(biāo)成分殘留小于LLOQ的5%的標(biāo)準(zhǔn)[20]。

3.1.2 UC大鼠血漿中初級(jí)膽汁酸含量測(cè)定 如表5所示，與正常組相比，模型組大鼠血漿中初級(jí)膽汁酸總量以及游離型、結(jié)合型初級(jí)膽汁酸總量均顯著升高（＜0.01），CA、GCA、CDCA和GCDCA含量顯著升高（＜0.05、0.01），而TCA和TCDCA含量顯著降低（＜0.05）。乳香、醋乳香給藥后對(duì)各膽汁酸表現(xiàn)出擾動(dòng)作用，兩者均對(duì)GCA、CDCA和GCDCA表現(xiàn)出明顯的回調(diào)作用（＜0.05、0.01），醋乳香組對(duì)于CA、CDCA和TCDCA、膽汁酸總量以及游離型、結(jié)合型初級(jí)膽汁酸總量的回調(diào)作用更趨近正常組。

表4 膽汁酸成分線性關(guān)系、LLOD及LLOQ

Table 4 Linear relationship, LLOD and LLOQ of bile acids

序號(hào)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線r線性范圍/(μmol·L?1)LLOD/(μmol·L?1)LLOQ/(μmol·L?1) 1CAy＝0.01 x－12.380.999 521.22～2 716.790.742.81 2TCAy＝0.67 x－2 052.850.999 218.48～2 365.720.060.19 3GCAy＝4.83×10?3 x－3.160.999 316.28～2 083.330.150.48 4CDCAy＝1.35 x＋349.410.999 019.10～2 445.362.438.91 5TCDCAy＝0.03 x－134.780.999 616.05～2 055.232.179.72 6GCDCAy＝0.41 x－6 653.690.999 319.64～2 513.230.180.35

表5 大鼠血漿中膽汁酸成分含量(, n = 6)

Table 5 Bile acids concentration in rat plasma samples(, n = 6)

組別質(zhì)量濃度/(μg·mL?1) CATCAGCACDCATCDCA 正常1 469.59±183.8346.20±2.5578.22±6.4017.60±1.8470.02±3.57 模型4 665.71±417.49▲20.66±1.05▲1 124.23±54.45▲▲84.08±6.49▲47.81±2.06▲ 乳香8 965.81±826.86#30.16±2.80645.39±41.79##64.46±6.93#812.23±5.15## 醋乳香1 528.72±102.91##**25.39±1.55658.54±44.92##25.15±1.85#*95.31±8.22#** 組別質(zhì)量濃度/(μg·mL?1) GCDCA初級(jí)膽汁酸總量游離型初級(jí)膽汁酸總量結(jié)合型初級(jí)膽汁酸總量 正常98.86±18.421 780.49±216.611 487.19±185.67293.30±30.94 模型547.95±42.63▲▲6 490.44±524.17▲▲4 749.79±423.98▲▲1 740.65±100.19▲▲ 乳香99.19±4.32##10 617.24±887.85##9 030.27±833.79##1 586.97±54.06 醋乳香225.34±20.65#**2 558.45±180.1##**1 553.87±104.76##**1 004.58±75.34##**

CA、CDCA為游離型初級(jí)膽汁酸 TCA、GCA、TCDCA、GCDCA為結(jié)合型初級(jí)膽汁酸 與正常組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；與乳香組比較：*＜0.05**＜0.01

CA, CDCA are free primary bile acid TCA, GCA, TCDCA, GCDCA are combined primary bile acid▲< 0.05▲▲< 0.01normal group;#< 0.05##< 0.01model group;*< 0.05**< 0.01group

3.2 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)膽固醇水平的影響

3.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 醋乳香溶液質(zhì)量濃度≥25 μg/mL時(shí)會(huì)對(duì)L-02細(xì)胞活力造成顯著影響，故確定醋乳香溶液給藥質(zhì)量濃度為10 μg/mL。為保證乳香、ADHBA和醋乳香用于對(duì)比研究給藥濃度的平行，對(duì)10 μg/mL乳香溶液和0.05 μg/mL的ADHBA溶液（10 μg/mL醋乳香當(dāng)量）[21]進(jìn)行了CCK8細(xì)胞毒性檢測(cè)，結(jié)果表明兩者對(duì)L-02細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，故確定乳香、醋乳香和ADHBA給藥質(zhì)量濃度分別為10、10、0.05 μg/mL。

3.2.2 膽固醇水平測(cè)定結(jié)果 如圖2所示，各給藥組中膽固醇含量均顯著低于空白溶劑組（＜0.01），可見(jiàn)乳香、醋乳香、ADHBA和乳香＋ADHBA均能夠有效地降低肝臟細(xì)胞膽固醇水平。醋乳香組膽固醇含量較乳香組顯著減少（＜0.05），表明與乳香比較，醋乳香降低膽固醇效果更強(qiáng)。乳香＋ADHBA組膽固醇含量較乳香組顯著減少（＜0.05），ADHBA對(duì)膽固醇的降低確有作用，提示其為醋乳香中降低膽固醇水平的關(guān)鍵成分之一。

與空白溶劑組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與乳香組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1和CYP7B1mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白溶劑組相比，乳香、ADHBA組表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01），而醋乳香、乳香＋ADHBA組表達(dá)顯著降低（＜0.05、0.01）；與乳香組相比，醋乳香、乳香＋ADHBA組表達(dá)均顯著降低（＜0.01）。mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白溶劑組相比，ADHBA組表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與乳香組相比，醋乳香、ADHBA和乳香＋ADHBA組表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01）。mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白溶劑組相比，乳香組表達(dá)顯著降低（＜0.05），ADHBA組表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與乳香組相比，ADHBA組表達(dá)顯著升高（＜0.05）。mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白溶劑組相比，乳香、醋乳香、ADHBA和乳香＋ADHBA組表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01）；與乳香組相比，醋乳香組表達(dá)顯著升高（＜0.05）。

圖3 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1和CYP7B1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

3.4 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶BACS、BAAT mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與空白溶劑組相比，乳香組、醋乳香、ADHBA、乳香+ADHBA組、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與乳香組相比，醋乳香組、乳香+ADHBA組、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）。

圖4 乳香醋炙前后及主要差異成分ADHBA對(duì)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶BACS、BAAT mRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

4 討論

盡管UC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但隨著代謝組學(xué)研究的深入，基于膽汁酸代謝角度對(duì)UC發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探索。研究表明，相比于正常小鼠，UC小鼠肝臟中游離型初級(jí)膽汁酸和甘氨結(jié)合型初級(jí)膽汁酸含量呈上升趨勢(shì)，而牛磺結(jié)合型初級(jí)膽汁酸含量呈下降趨勢(shì)[22]。臨床研究顯示，與正常人群膽汁酸含量比較，UC患者血液中游離型膽汁酸、甘氨結(jié)合型膽汁酸含量顯著升高，而?；墙Y(jié)合型膽汁酸含量顯著降低[17]。本研究結(jié)果表明，與正常大鼠相比，UC大鼠游離型初級(jí)膽汁酸CA和CDCA、甘氨結(jié)合型初級(jí)膽汁酸GCA和GCDCA含量顯著升高，而牛磺結(jié)合型初級(jí)膽汁酸TCA和TCDCA含量顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。給予乳香和醋乳香進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)乳香醋炙后，對(duì)UC大鼠血漿中的初級(jí)膽汁酸總量和游離型初級(jí)膽汁酸、結(jié)合型初級(jí)膽汁酸總量的回調(diào)水平更接近正常組。

中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體膽汁酸信號(hào)對(duì)UC表現(xiàn)出了良好的療效，如白頭翁湯可通過(guò)調(diào)控膽汁酸相關(guān)信號(hào)通路改善UC[23]；干姜與炮姜干預(yù)UC的機(jī)制可能與膽汁酸合成及調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的相關(guān)受體有關(guān)[24]；補(bǔ)骨脂可以顯著改善UC小鼠腸道病理狀態(tài)和血清細(xì)胞因子水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)CYP7A1等膽汁酸合成信號(hào)通路有關(guān)[25]。肝臟是初級(jí)膽汁酸合成的主要部位，為探討乳香醋炙前后及醋炙前后差異成分ADHBA對(duì)膽汁酸回調(diào)作用明顯差異的原因，本研究采用L-02正常人體肝細(xì)胞，對(duì)比乳香醋炙前后及醋炙前后差異成分ADHBA對(duì)膽汁酸合成原料膽固醇以及游離型初級(jí)膽汁酸合成酶、、、mRNA和結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成酶、mRNA的干預(yù)作用。ADHBA是乳香醋炙后含量顯著增加的主要差異成分，為了更好地闡明ADHBA對(duì)初級(jí)膽汁酸調(diào)控環(huán)節(jié)的作用，探究乳香醋炙增效機(jī)制，本研究設(shè)立乳香聯(lián)合ADHBA干預(yù)組，使聯(lián)合體系中ADHBA的含量同醋乳香相等，以明確乳香醋炙增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，乳香和醋乳香均具有降低膽汁酸合成原料膽固醇的作用，且醋炙后降低作用更強(qiáng)，主要差異成分ADHBA與乳香聯(lián)合ADHBA的調(diào)控水平與醋乳香相似。膽汁酸主要通過(guò)2種途徑在肝臟中合成，經(jīng)典途徑由CYP7A1催化膽固醇發(fā)生7α-羥基化作用，隨后甾核進(jìn)一步轉(zhuǎn)化并由CYP8B1催化側(cè)鏈發(fā)生氧化裂解，該途徑產(chǎn)生的膽汁酸成分約占總膽汁酸的75%[18]；替代途徑由CYP27A1催化膽固醇27-羥基化，該反應(yīng)經(jīng)由CYP7B1進(jìn)一步催化羥基化。經(jīng)典途徑中的CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶，CYP8B1消耗或抑制可導(dǎo)致替代途徑合成更多膽汁酸[26]。本研究結(jié)果顯示，乳香及ADHBA對(duì)于mRNA表達(dá)顯示出明顯的促進(jìn)作用，而對(duì)膽固醇表現(xiàn)出明顯的降低作用，表明乳香及ADHBA可能主要通過(guò)促進(jìn)CYP7A1的表達(dá)而加速了膽固醇的消耗，并表現(xiàn)為游離型初級(jí)膽汁酸的增多。乳香醋炙后對(duì)初級(jí)膽汁酸合成回調(diào)作用與抑制經(jīng)典途徑限速酶以及上調(diào)mRNA表達(dá)有關(guān)，乳香聯(lián)合ADHBA組與醋乳香的調(diào)控作用一致。即使醋乳香對(duì)膽汁酸合成原料膽固醇水平下調(diào)的作用明顯，但是研究表明，其對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成的過(guò)程并沒(méi)有提升，表明乳香醋炙后對(duì)于機(jī)體的脂質(zhì)代謝也有一定的貢獻(xiàn)，但是其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。在肝細(xì)胞中，游離型初級(jí)膽汁酸通過(guò)BAAT和BACS的作用與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合形成結(jié)合型初級(jí)膽汁酸[18]，雖然乳香醋炙后對(duì)二者的上調(diào)作用更強(qiáng)，但是由于醋乳香對(duì)游離型初級(jí)膽汁酸合成經(jīng)典途徑限速酶CYP7A1的抑制，導(dǎo)致游離型初級(jí)膽汁酸的含量大大降低，使后續(xù)結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成的底物減少，因此，醋乳香干預(yù)后，機(jī)體結(jié)合型初級(jí)膽汁酸的總量大大降低。由此可見(jiàn)，游離型初級(jí)膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1對(duì)乳香醋炙前后在初級(jí)膽汁酸調(diào)控環(huán)節(jié)中起到了決定性作用，一方面它決定了游離型初級(jí)膽汁酸合成環(huán)節(jié)，另一方面，該過(guò)程的產(chǎn)物是結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成的底物，同時(shí)決定了結(jié)合型初級(jí)膽汁酸的合成。此外，在初級(jí)膽汁酸合成的各個(gè)環(huán)節(jié)中，乳香聯(lián)合ADHBA組表現(xiàn)出與醋乳香相近的作用趨勢(shì)，提示乳香醋炙前后主要差異成分ADHBA可能是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵成分之一。ADHBA在乳香醋炙后含量顯著增加，且在細(xì)胞層面表現(xiàn)出良好的抗炎活性[9]，但基于動(dòng)物水平ADHBA改善UC的相關(guān)研究，仍有待深入探討。

本研究從初級(jí)膽汁酸合成角度初步闡釋了乳香醋炙對(duì)UC增效的作用機(jī)制。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-TQ-MS）技術(shù)，探究了乳香醋炙前后對(duì)UC大鼠血漿膽汁酸的擾動(dòng)差異。進(jìn)一步從膽固醇、游離型初級(jí)膽汁酸合成和結(jié)合型初級(jí)膽汁酸合成3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，初步闡釋了乳香醋炙增效機(jī)理。UC不僅與初級(jí)膽汁酸關(guān)系密切，而且也受到次級(jí)膽汁酸的影響。次級(jí)膽汁酸是初級(jí)膽汁酸進(jìn)入腸道后，在腸道菌群作用下經(jīng)過(guò)脫羥基、絡(luò)合反應(yīng)等生成的膽汁酸。在人類研究和動(dòng)物模型中，次級(jí)膽汁酸與腸道疾病和肝臟疾病也有密切的聯(lián)系[27-28]，關(guān)于乳香醋炙前后如何介導(dǎo)次級(jí)膽汁酸調(diào)節(jié)UC的作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on efficiency enhancing mechanism of vinegar processedon ulcerative colitis via primary bile acids synthesis

PENG Shi-tao1, LIU Zhen-li1, WANG Chun1, ZHANG Lin-lin2, WAN Xiao-ying1,SONG Zhi-qian1, NING Zhang-chi1

1. Institute of Basic Theory, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Traditional Chinese Patent Medicine, Hangzhou 310052, China

To investigate the efficiency enhancing mechanism for ulcerative colitis (UC) of vinegar processed Ruxiang () from the aspect of primary bile acids synthesis.UPLC-TQ-MS was used to determine the contents of six primary bile acids in plasma of UC rats induced by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS). At the cellular level, L-02 cell line was applied to compare the effects of, vinegar processedand the different components of 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid (ADHBA) on synthesis of primary bile acids. The content of bile acid synthesis precursor cholesterol was measured by ELISA. mRNA expressions of cholesterol 7α-hydroxylase (), sterol 12α-hydroxylase (), 27?hydroxycholesterol (), oxysterol-7α-hydroxylase (), bile acyl-CoA synthetase () and bile acid-CoA: amino acid?acyltransferase () were determined by qRT-PCR.Level of total amount of primary bile acids and free and conjugated primary bile acids in the plasma of UC rats fed with vinegar processedwas closer to that of normal rats., vinegar processedand ADHBA could reduce cholesterol level, but the effect of vinegar processedand ADHBA were more obvious. The inhibition of vinegar processedon the classical pathway of free primary bile acid synthesis CYP7A1, the up-regulation of CYP8B1, BACS and BAAT were higher than those of.combined with ADHBA exhibited the same effect with vinegar processed.The inhibition of rate-limiting enzyme CYP7A1 in the classical synthesis pathway plays a significant role on regulation of primary bile acid synthesis by vinegar processed, which resulted in the reduction of primary bile acid level in pathological state of UC. ADHBA is proved to be one of the material foundations of processing efficiency.

; vinegar processed; primary bile acids; ulcerative colitis; efficiency enhancing; CYP7A1; ADHBA

R285.5

A

0253 - 2670(2022)01 - 0107 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.014

2021-07-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873009）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82003950）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才（創(chuàng)新類）基金資助項(xiàng)目（ZZ14-YQ-035）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所中央級(jí)科研院所自主選題（YZ-202023，YZ-202045）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CI2021A04201）

彭詩(shī)濤（1993—），女，在讀博士生，研究方向?yàn)橹兴幣谥圃硌芯?。Tel: 18810820973 E-mail: pst082073@163.com

寧張弛，女，博士，助理研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。Tel: (010)64089020 E-mail: yizhangyichi1573@sina.com

宋志前，男，副主任技師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和炮制原理研究。

[責(zé)任編輯 李亞楠]