天南星炮制前后主要化學(xué)成分含量變化研究

祁春艷，王 晶，武 旭，張 橋，宋藝君，趙重博*，吳建華*

天南星炮制前后主要化學(xué)成分含量變化研究

祁春艷1, 2，王 晶1，武 旭1, 2，張 橋1, 2，宋藝君1, 2，趙重博1, 2*，吳建華1, 2*

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046 2. 陜西省中藥中藥炮制技術(shù)傳承基地，陜西 咸陽 712046

建立天南星化學(xué)成分的含量測定方法，比較炮制前后的含量變化，研究炮制過程中含量變化的規(guī)律。分別采用掃描電子顯微鏡、UV、HPLC、BCA蛋白濃度測定試劑盒對天南星炮制前后的草酸鈣針晶的形態(tài)，草酸鈣、總黃酮、總皂苷、總生物堿、多糖類以及蛋白質(zhì)、尿苷、腺苷、胸腺嘧啶核苷、鳥苷、次黃嘌呤、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、肌苷的含量進行研究。加入白礬炮制的樣品草酸鈣針晶結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；加少量白礬浸泡樣品草酸鈣針晶含量最高，單純加大量白礬煎煮最低；總黃酮的含量生天南星最高，長時間浸泡含量最低；總皂苷的含量生天南星最高，單純加大量白礬煎煮最低；總生物堿的含量生天南星最高，水煎煮樣品含量最低；多糖的含量單純生姜煎煮最高，水煎煮樣品最低；總蛋白的含量生天南星最高，《中國藥典》制天南星最低。尿苷、腺苷、尿苷、夏佛塔苷等化學(xué)成分在炮制過程中均發(fā)生不同程度的變化。天南星中的化學(xué)成分在炮制過程中均發(fā)生不同程度的變化，其中加入白礬處理對成分影響最大，加入輔料的順序以及水煎煮處理均可使天南星化學(xué)成分含量發(fā)生變化，為制天南星炮制機制研究提供借鑒。

天南星；炮制；HPLC；紫外-分光光度法；草酸鈣；草酸；黃酮；皂苷；生物堿；多糖；蛋白質(zhì)；尿苷；腺苷；胸腺嘧啶核苷；鳥苷；次黃嘌呤；夏佛塔苷；異夏佛塔苷；肌苷；白礬；生姜

天南星（AR）是天南星科天南星屬植物天南星(Wall.) Schott.、異葉天南星Bl.或東北天南星Maxim.的干燥塊莖[1]。具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫之功[1]。化學(xué)成分主要有黃酮類[2-3]、皂苷類[4-5]、生物堿類[6-9]、多糖類[10-11]、凝集素類[12-15]、氨基酸[16]等。藥理學(xué)研究證明天南星具有抗腫瘤[17-23]、抗驚厥[24-27]、抗炎[28-30]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[31-33]、祛痰[31,34]的作用。研究報道，天南星中生物堿能抑制草地貪夜蛾Sf21細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡[35]；總黃酮及其主要成分夏佛塔苷具有抗缺血、保護神經(jīng)細胞、鎮(zhèn)痛作用[36]；皂苷類成分對胃黏膜有刺激性，可以反射性地增加氣管、支氣管的分泌液，起到祛痰的作用[37]；總多糖具有抑制腫瘤活性作用[22,38]。天南星臨床多用于燥濕化痰，現(xiàn)代臨床對過敏性哮喘在傳統(tǒng)中醫(yī)認識中多歸于“哮病”，屬于“痰飲病”。通過對中國知網(wǎng)（CNKI）和Web of Science數(shù)據(jù)庫查閱相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)“痰”與“過敏性哮喘”存在緊密的聯(lián)系。所以本研究以過敏性哮喘作為痰證疾病，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在多個數(shù)據(jù)庫聯(lián)合來檢索與過敏性哮喘相關(guān)靶蛋白的基礎(chǔ)上，進一步通過分子計算網(wǎng)絡(luò)特征分析得到天南星主要的活性成分。

歷代醫(yī)家著作認為生天南星有毒，衛(wèi)生部也把天南星列入28種毒性中藥之一[39]，由于存在毒性，如果是口服給藥，則必須由有經(jīng)驗的人進行炮制（制天南星或者膽南星）。天南星的炮制始見于唐代，應(yīng)用最多的炮制輔料為生姜、白礬、甘草和皂角、膽汁等[40]。傳統(tǒng)研究認為生姜歸肺經(jīng)化痰止嘔；白礬歸肺經(jīng)燥濕化痰解毒；甘草入肺經(jīng)清熱解毒、祛痰緩和藥性；皂角歸肺經(jīng)祛痰開竅，可達到去毒和增強歸肺經(jīng)化痰的目的[41]?，F(xiàn)代研究則認為在天南星的炮制過程中，白礬主要起到降低毒性的作用，而生姜能緩解天南星的中毒癥狀[42]，第1版《中國藥典》沿用至今的天南星炮制方法均以生姜和白礬為輔料：取天南星藥材，大小分開，用水浸泡，每日換水2～3次，起白沫時，換水后加白礬，泡1日后，再進行換水，至切開口嘗微有麻舌感時取出。另取生姜切片煎湯，加白礬與天南星共煮透，取出晾干，切薄片，干燥。但是《中國藥典》炮制方法文字性描述導(dǎo)致飲片廠生產(chǎn)操作性較差，品質(zhì)不均一，且長時間浸泡和煎煮容易導(dǎo)致有效成分含量損失。目前，制天南星炮制的科學(xué)內(nèi)涵更多揭示減毒方面，對化學(xué)成分的影響研究報道較少。本研究將《中國藥典》中制天南星的炮制方法進行分解，通過測定各個步驟化學(xué)成分的含量，旨在建立天南星中6類化學(xué)成分的含量測定方法，比較炮制前后的含量變化，研究炮制過程中含量變化的規(guī)律。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030 Plus高效液相色譜儀，日本島津公司，配置LC-2030LC-2030 UV檢測器；Waters 2695型高效液相色譜儀配置Waters2996 UV型檢測器；Mettler Toledo十萬分之一電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；XM-P102H型超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；L5型紫外-可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；UPL-10L型超純水機，四川卓越水處理有限公司；GENESPEED 416型離心機，Gene公司；TESCAN VEGE3掃描電子顯微鏡（SEM），泰斯肯貿(mào)易有限公司。

1.2 試藥

對照品草酸（批號Z15S9Y70497）、芹菜素（批號T04S8F43072）、齊墩果酸（批號HA0820KA14）、葫蘆巴堿（批號Z19A11H121866）、葡萄糖（批號GZDD-0523）、尿苷（批號PS010290）、腺苷（批號PS001227）、胸腺嘧啶核苷（批號PS020196）、鳥苷（批號PS010291）、次黃嘌呤（批號PS020061）、夏佛塔苷（批號PS010457）、異夏佛塔苷（批號Z16A10B93543）、肌苷（批號PS010437），質(zhì)量分數(shù)均≥98.0%，均購自成都普思生物科技股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸、石油醚、濃鹽酸、乙醇、三乙胺、正丁醇、甲醇、香草醛、高氯酸、濃硫酸、檸檬酸鈉、溴麝香草酚藍、氯仿、苯酚，均為分析純，購于科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，購于科密歐化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒，批號BL521A，南京建城生物科技有限公司。天南星藥材購于河北安國藥材市場，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)顏永剛教授鑒定，為天南星科天南星屬植物天南星(Wall.) Schot的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取天南星藥材，按《中國藥典》2020年版制天南星炮制方法進行加工處理（圖1）：將生天南星藥材洗凈，分別制備3批生天南星飲片（樣1）；樣1用水浸泡，每日換水2～3次直至起白沫，得樣2；樣2加白礬溶液（2%，浸泡液）泡1日后換浸泡液，直至內(nèi)無干心，切開口嘗微有麻舌感，即得樣3；樣3加生姜和白礬［取生姜（12.5%）切片煎湯，加白礬（10.5%）即得］共煮至透心，得樣4（即生姜白礬共制天南星）；樣2加生姜（12.5%）煎湯煮至透心（樣5，生姜制天南星，無白礬）；樣2加白礬（12.5%）溶液反復(fù)浸泡，直至無麻舌感（樣6，白礬浸制天南星，無生姜，白礬一步加入）；樣2加白礬（12.5%）溶液共煮至透心（樣7，白礬煮制天南星，無生姜，白礬一步加入）；樣2加水煮至透心（樣8，水煮制天南星，無白礬和生姜）；各樣品充分干燥，保存。

2.2 天南星炮制前后草酸鈣針晶形態(tài)變化研究

取天南星不同樣品加水泡透，加入適量的石油醚，研磨，直至石油醚清澈，收集石油醚，離心，分離沉淀與上清液，沉淀加甲醇渦旋，即得，SEM下觀察。

圖1 《中國藥典》2020年版制天南星炮制方法環(huán)節(jié)分解

天南星及其炮制品電鏡掃描晶體結(jié)構(gòu)見圖2，樣1、2草酸鈣針晶兩端尖銳，樣5、8草酸鈣針晶出現(xiàn)部分斷裂，樣3、6、7草酸鈣針晶尖銳度有所降低，樣4草酸鈣針晶兩端圓鈍程度最高，說明白礬處理對天南星中草酸鈣針晶的形態(tài)影響較大，其次加熱處理也有一定的影響。

2.3 草酸鈣含量測定

根據(jù)草酸鈣不溶于水及有機溶劑的性質(zhì)，先將可溶性的草酸鹽除去，再通過酸處理使草酸鈣轉(zhuǎn)化為草酸（CaC2O4＋2HCl＝CaCl2＋H2C2O4），生成1 mol/L草酸需要1 mol/L草酸鈣，以此通過HPLC法測定草酸的含量并換算成樣品中所含的草酸鈣的含量[43-44]。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.5% KH2PO4- H3PO4水溶液（pH 2）（流動相溶液的配置：精密稱取KH2PO45 g，置于1000 mL量瓶中，加H3PO4調(diào)節(jié)pH 2后定容，經(jīng)過0.45 μm混合纖維樹脂膜后超聲脫氣）；體積流量0.7 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫28 ℃；進樣量10 μL，理論塔板數(shù)以草酸含量計算，不得低于2000。

圖2 天南星生品及炮制后草酸鈣針晶的形態(tài)

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取草酸對照品適量，置于100 mL量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，制備質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL的草酸對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取各生天南星樣品粉末（過4號篩）0.2 g，置于離心管中，加入3 mL蒸餾水混勻超聲震蕩10 min，然后置70 ℃水浴加熱并攪拌10 min，4000 r/min離心5 min，殘渣加熱純水洗滌3次，每次2 mL，混勻離心，取藥材殘渣，加0.4 mL鹽酸溶液（體積比1∶1），3.0 mL純水混勻，置于80 ℃水浴，邊攪拌邊加熱10 min，4000 r/min離心5 min，分離沉淀與上清液，沉淀加0.1 mol/L鹽酸溶液同上法處理2次，每次2 mL，離心，合并3次上清液，置10 mL量瓶中，純水定容至刻度，即得供試品溶液[43]。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取草酸對照品溶液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.03、0.15、0.45、0.60、0.75 mg/mL的工作曲線溶液，10 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積，以草酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準曲線并計算回歸方程，結(jié)果草酸的回歸方程為＝745 892－626 346，＝0.999 5，結(jié)果表明草酸在0.03～0.75 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）6份，每份0.2 g，按“2.3.3”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，測定草酸峰面積積分值，計算得草酸質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.26%。

2.3.6 精密度試驗 取同一份草酸對照品溶液（質(zhì)量濃度0.45 mg/mL），連續(xù)進樣6次，測定草酸峰面積積分值，計算其RSD值為1.33%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）0.2 g，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，所得的供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h進樣，測定草酸峰面積，計算其RSD值為1.31%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收試驗 精密稱取已測定草酸含量的樣1粉末6份，每份0.1 g，加適量草酸對照品溶液（0.45 mg/mL），按照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，計算草酸平均加樣回收率及其RSD值分別為101.73%和1.71%。

2.3.9 樣品含量測定 精密稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約0.2 g，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，每個樣品進樣10 μL，按照“2.3.1”項下色譜條件測定草酸峰面積，根據(jù)標(biāo)準曲線計算草酸含量并轉(zhuǎn)換成草酸鈣針晶含量，結(jié)果見表1。

2.4 總黃酮含量測定[1]

2.4.1 對照品溶液的制備 取適量芹菜素對照品，加入60%乙醇，使得芹菜素對照品溶液的質(zhì)量濃度為14 μg/mL，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定天南星樣品粉末（過4號篩）0.6 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 60%乙醇，密塞后稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷后稱定質(zhì)量，以60%乙醇對減失的質(zhì)量進行補足，搖勻后濾過，即得供試品溶液。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密量取制備好的芹菜素對照品溶液1、2、3、4、5 mL，將其分別置于10 mL量瓶中，每個量瓶都加入60%乙醇至5 mL，再加入1%三乙胺溶液，至刻度線并且搖勻。在波長400 nm處測定吸光度（），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制其標(biāo)準曲線，進行線性回歸，得芹菜素回歸方程為＝0.186 8－0.009 2，＝0.999 7，結(jié)果表明芹菜素在1.023 6～5.022 5 μg/mL線性關(guān)系良好。

表1 天南星及其炮制品中各大類指標(biāo)成分含量測定結(jié)果(n = 3)

Table 1 Content determination results of major index components in raw AR and its processed products(n = 3)

樣品草酸鈣/(mg?g?1)總黃酮/(mg?g?1)總皂苷/(mg?g?1)總生物堿/(mg?g?1)多糖/(mg?g?1)蛋白質(zhì)/(μg?g?1)OD值 樣12.1460.8100.4940.74918.654.5210.283 樣22.0980.4430.4030.47114.404.1280.262 樣32.9130.3880.3120.33311.102.7000.342 樣41.7950.4630.2670.30320.351.7350.367 樣51.8220.5790.4130.12823.353.9500.287 樣61.8610.2250.2540.1469.652.6640.295 樣71.1310.3380.2230.1647.151.9500.289 樣81.9990.3350.2590.0854.202.0920.362

2.4.4 樣品含量測定 精密稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）0.6 g，分別按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.4.3”項下方法處理，測定值，計算總黃酮含量，結(jié)果見表1。

2.5 總皂苷含量測定

2.5.1 對照品溶液制備 取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含有齊墩果酸32 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱定天南星樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密稱取續(xù)濾液10 mL，蒸干。殘渣加15 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次10 mL，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL的量瓶中[45]。

2.5.3 線性關(guān)系考察 精密吸取齊墩果酸對照品溶液1、2、3、4、5 mL，分別置于具塞試管中，低溫揮去溶劑，加入1%香草醛高氯酸試液0.5 mL，充分混勻后置60 ℃恒溫水浴上加熱15 min，立即用冷水冷卻2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，搖勻；以相應(yīng)試劑作空白，在520 nm處測定值，以齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準曲線并計算其回歸方程[45]，齊墩果酸的回歸方程為＝0.190 8＋0.054，＝0.999 1，結(jié)果表明齊墩果酸在32～160 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，6份，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.5.3”項下方法操作并測定其值，計算得總皂苷質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.61%。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取1 mL對照品溶液（質(zhì)量濃度32 μg/mL），按“2.5.3”項下方法處理，測其值，重復(fù)6次，計算其值的RSD值為1.55%。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，所得的供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h按“2.5.3”項下方法進行測定，測得其值，計算其值的RSD值為1.27%。

2.5.7 加樣回收試驗 精密稱取已測定總皂苷含量的樣1粉末6份，每份0.5 g，加適量齊墩果酸對照品，按照“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下方法測定其值，計算得齊墩果酸的平均加樣回收率及其RSD值分別為101.54%和1.78%。

2.5.8 樣品含量測定 精密稱取各天南星飲片粉末（過4號篩）1.0 g，分別按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.5.3”項下方法處理，測定值，計算總皂苷含量，結(jié)果見表1。

2.6 總生物堿含量測定

2.6.1 對照品溶液制備 精密稱取葫蘆巴堿對照品適量，加甲醇配制成含葫蘆巴堿32 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.6.2 供試品溶液制備 稱取樣1粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，揮干溶劑，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[45-46]。

2.6.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5 mL置于分液漏斗中，加入pH 5.6的檸檬酸鈉緩沖溶液14 mL，溴麝香草酚藍試劑4 mL，氯仿15 mL萃取3次，合并萃取液，干燥濾紙濾過水分后，在415 nm處測定值。以葫蘆巴堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準曲線并計算回歸方程[44-45]。結(jié)果胡蘆巴堿的回歸方程為＝0.017 2＋0.054 8，＝0.999 1，結(jié)果表明胡蘆巴堿在0.239 5～3.745 3 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，6份，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.3”項下方法操作并測定其值，計算得總生物堿質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.49%。

2.6.5 精密度試驗 精密吸取1 mL對照品溶液（質(zhì)量濃度32 μg/mL），對照品溶液的處理按“2.6.3”項下的方法，測其值，重復(fù)6次，計算其值的RSD值為1.32%。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，所得的樣品溶液在0、2、4、6、8、12 h按“2.6.3”項下方法測定其值，計算其值的RSD值為1.21%。

2.6.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知總生物堿含量的樣1粉末6份，每份0.5 g，加適量葫蘆巴堿對照品，照“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.3”項下方法進行測定，測得其值，計算得胡蘆巴堿的平均加樣回收率及其RSD值分別為101.51%和1.66%。

2.6.8 樣品含量測定 精密稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約1 g，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.6.3”項下方法分別處理，測定值，計算含量，結(jié)果見表1。

2.7 多糖的含量測定

2.7.1 對照品溶液的制備 取適量的葡萄糖對照品（105 ℃干燥至恒定質(zhì)量），置250 mL量瓶中，加水溶解并定容，使葡萄糖對照品溶液質(zhì)量濃度為0.075 mg/mL。

2.7.2 供試品溶液的制備 稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，加100 mL蒸餾水，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，冷卻，稱定質(zhì)量，加蒸餾水補足減失的質(zhì)量，離心，取2 mL上清液，加10 mL乙醇，振搖后靜止12 h，離心，取沉淀加水溶解移入50 mL量瓶中加水定容，即得供試品溶液[47-48]。

2.7.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于具塞試管中，加超純水至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，加濃硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫。在488 nm處測定值，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準曲線并計算回歸方程[47-48]。結(jié)果葡萄糖的回歸方程為＝0.072 0＋0.046 6，＝0.999 5，結(jié)果表明葡萄糖在0.852 8～6.838 9 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.7.4 重復(fù)性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，6份，按“2.7.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.7.2”項下方法處理各供試品溶液，測得其值，計算得總多糖質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1.92%。

2.7.5 精密度試驗 精密吸取1 mL對照品溶液（質(zhì)量濃度0.075 mg/mL），對照品溶液的處理按“2.7.3”項下方法，重復(fù)6次測其值，計算其值的RSD值為1.57%。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定樣1粉末（過4號篩）1.0 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，所得的供試品溶液在0、2、4、6、8、12 h按“2.7.3”項下方法進行測定，測得其值，計算其值的RSD值為1.39%。

2.7.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知多糖含量的樣1粉末6份，每份0.5 g，加適量葡萄糖對照品，照“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.3”項下方法進行測定，測得其值，計算得葡萄糖的平均加樣回收率及RSD值分別為102.96%和2.20%。

2.7.8 含量測定 精密稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，按“2.7.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.7.3”項下方法分別處理，測定值，計算含量，結(jié)果見表1。

2.8 BCA濃度試劑盒測定蛋白質(zhì)的含量

按照試劑盒說明書測定。

2.8.1 BCA工作液的配制 將試劑A與試劑B按照體積比50∶1的比例混合，配成BCA工作液，具體信息見表2。試劑A：1% BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，混合調(diào)pH 11.25，試劑B：4%硫酸銅。

表2 BCA工作液

Table 2 Configuration of BCA working fluid

產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱 BL521A-1試劑A BL521A-2試劑B BL521A-3牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準溶液 BL521A-4PBS

2.8.2 蛋白標(biāo)準品配制 室溫完全溶解蛋白標(biāo)準品（BSA），取5 mg/mL BSA標(biāo)準液20 μL，用PBS稀釋至100 μL，使其最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

2.8.3 供試品溶液的制備 取各天南星樣品5 g，用50 mL水泡透，勻漿機勻漿3次，每次30 s，4 ℃冷凍離心機離心20 min（1200 r/min），定容至50 mL量瓶中。

2.8.4 BSA標(biāo)準測定溶液的配制 按照說明書配制質(zhì)量濃度為1、5 mg/mL的BAS溶液。

2.8.5 線性關(guān)系考察 按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明書操作，將10 μL待測樣品加入到微孔板中，并用PBS補足到20 μL，向微孔板中加入200 μL工作液，混勻，37 ℃放置30 min，在562 nm波長處測定值，并記錄讀數(shù)；以值為橫坐標(biāo)（），BAS質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準曲線，計算樣品中BAS的質(zhì)量濃度，結(jié)果BAS的回歸方程為＝0.280 0＋0.042 4，＝0.999 6，結(jié)果表明BSA在1.735 7～4.521 4 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.8.6 含量測定 精密稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，測定值，計算含量，結(jié)果見表1。

2.9 總評歸一值（overall desirability value，OD值）計算

為了直觀地考察工藝環(huán)節(jié)對各大類成分含量的總體影響，對6個化學(xué)成分的含量進行歸一化處理，利用Hassan法對各效應(yīng)值進行歸一化，黃酮、皂苷、生物堿、多糖含量越高越好，因此，歸一值d＝(y－min)/(max－min)；刺激性成分針晶和蛋白含量越低越好，因此，歸一值d＝(max－y)/(max－min)；再對歸一值d求算術(shù)平均值，即為OD值，OD＝(1＋2＋……＋d)/[44]，結(jié)果見表1。OD值分別為0.283、0.262、0.342、0.367、0.287、0.295、0.289、0.362。從減毒存效效果來看，炮制品中以《中國藥典》中炮制方法制得樣品綜合評判最佳，從有效成分保留程度看單純生姜處理效果最佳，從降低毒性刺激性成分看單純白礬處理最佳。

2.10 8種單一指標(biāo)成分的含量測定[49]

2.10.1 對照品溶液的制備 精密稱取鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸腺嘧啶核苷、鳥苷、腺嘌呤、夏佛塔苷、異夏佛塔苷適量，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，使得各對照品的質(zhì)量濃度均為0.4 mg/mL，即為混合對照品溶液。

2.10.2 供試品溶液的制備 稱取各天南星樣品粉末（過4號篩）約3 g，置于50 mL具塞錐形瓶內(nèi)，加入20 mL 60%乙醇，超聲提取45 min，冷卻至室溫并補足減失的質(zhì)量，濾過，即得。

2.10.3 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序：0～6 min，100%乙腈；6～25 min，100%～90%乙腈；25～45 min，90%～85%乙腈；45～65 min，85%～65%乙腈；65～75 min，65%乙腈；體積流量0.8 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按夏佛塔苷計算不得低于2000。

2.10.4 線性關(guān)系考察 操作方法同“2.3.4”項?；旌蠈φ掌啡芤合♂屩临|(zhì)量濃度分別為0.02、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL。結(jié)果得到尿苷的回歸方程為＝312 108－162 839，＝0.999 5，結(jié)果表明尿苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；腺苷的回歸方程為＝59 763＋108 373，＝0.999 2，結(jié)果表明腺苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；胸腺嘧啶核苷的回歸方程為＝488 726－8 600.7，＝0.999 6，結(jié)果表明胸腺嘧啶核苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；鳥苷的回歸方程為＝209 600＋172 153，＝0.999 8，結(jié)果表明鳥苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；次黃嘌呤的回歸方程為＝154 174＋771 16，＝0.999 5，結(jié)果表明次黃嘌呤在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；夏佛塔苷的回歸方程為＝343 422＋5 264，＝0.999 5，結(jié)果表明夏佛塔苷在0.02～0.4 mg/mL線性關(guān)系良好；異夏佛塔苷的回歸方程為＝326 095－12 557，＝0.999 8，結(jié)果表明異夏佛塔苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好；肌苷的回歸方程為＝115 703＋71 877，＝0.999 1，結(jié)果表明肌苷在0.02～0.40 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.10.5 方法學(xué)考察[49]方法學(xué)考察同“2.3.5”項。除重復(fù)性試驗外，其余均通過對實驗測得的峰面積進行計算。得出尿苷、腺苷、胸腺嘧啶核苷、鳥苷、次黃嘌呤、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、肌苷精密度試驗的RSD分別為0.28%、0.62%、0.16%、0.21%、0.32%、0.27%、0.31%、0.63%，表明實驗所用儀器的精密度良好；重復(fù)性試驗（以質(zhì)量分數(shù)進行計算）的RSD分別為0.96%、1.29%、1.04%、1.30%、0.98%、1.21%、0.62%、0.78%，表明所建立各方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗的RSD分別為1.32%、1.62%、1.40%、1.34%、1.17%、0.93%、1.49%、1.85%，表明制備的天南星供試品溶液在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗中平均加樣回收率分別為103.96%、102.75%、104.12%、102.11%、102.03%、102.75%、102.94%、102.90%，RSD分別為0.35%、0.46%、1.28%、1.51%、1.07%、0.51%、0.83%、0.41%。

2.10.6 含量測定 測定方法同“2.3.6”項。結(jié)果見表3。

2.11 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.11.1 天南星中活性成分的篩選 以天南星為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺TCMSP（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php）和HomePage-BATMAN數(shù)據(jù)庫檢索天南星的化學(xué)成分。篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的作為活性成分篩選條件[50]，篩選出符合條件的7個活性成分。在HomePage- BATMAN和Pubchem數(shù)據(jù)庫中檢索得到天南星靶點9個，結(jié)果見表4、5。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到過敏性哮喘的相關(guān)靶點，最后通過在線韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，圖3）得到天南星和過敏性哮喘的共有基因。

表3 天南星及其炮制品中8種單一指標(biāo)成分含量測定結(jié)果(n = 3)

Table 3 Determination results of eight kinds of single index components in raw AR and its processed products(n = 3)

樣品質(zhì)量分數(shù)/(μg?g?1) 次黃嘌呤腺苷胸腺嘧啶核苷鳥苷尿苷夏佛塔苷異夏佛塔苷肌苷 樣11.0991.2840.9411.4261.2993.0222.3980.736 樣20.7590.4290.1720.1150.4040.3760.2550.948 樣30.6470.2170.3170.3180.2050.4860.511? 樣40.886?0.959??0.8740.2990.164 樣50.981?0.9340.121?1.6750.576? 樣60.9060.2070.1180.3240.2031.0390.401? 樣7?0.104???1.2300.694? 樣81.1480.9580.1060.4201.1482.1681.120?

“?”表示化學(xué)成分含量極低，未檢測出

“?” means that the content of chemical components is extremely low, not detected

2.11.2 活性成分靶點的預(yù)測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查得天南星中每個活性成分所對應(yīng)的靶蛋白，再將靶蛋白導(dǎo)入到PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）和SwissTarget Prediction（http://www. swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫獲取每個靶蛋白所對應(yīng)的靶基因，最后將得到的靶基因進行合并，刪除相同基因保留唯一項，得結(jié)果即為天南星活性成分的靶點。

表4 TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到的化學(xué)成分

Table4 Chemical constituents retrieved from TCMSP database

編號化合物OB/%DL類別 MOL0131468,11,14-二十二碳三烯酸甲酯（8,11,14-docosatrienoic acid, methyl ester）42.230.30苷類 MOL013156[(2R)-2-[[(2R)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯丙?；鵠氨基]甲基]-3-苯基丙基]乙酸酯［(2R)-2-[[[(2R)-2-(benzoylamino)-3-phenylpropanoyl]amino]methyl]-3-phenylpropyl] acetate］38.880.56苷類 MOL00151024-菜油甾醇（24-epicampesterol）37.580.71甾醇 MOL000358β-谷甾醇（β-sitosterol）36.910.75甾醇 MOL000359谷甾醇（sitosterol）36.910.75甾醇 MOL000449豆甾醇（stigmasterol）43.830.76甾醇 MOL000953十八烷基-[2-(三甲基氮雜鎓基)乙氧基]次膦酸酯（CLR）37.870.68甾醇

表5 Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索得到的化學(xué)成分

Table 5 Chemical constituents retrieved from PubChem database

PubChem CID化合物相對分子質(zhì)量類別 190淀粉（amylum）135.13糖類 11390178D-甘露庚酮糖（D-mannoheptulose）210.18糖類 457801γ-谷甾醇（γ-sitosterol）414.70甾醇 6251D-甘露醇（D-mannitol）182.17甾醇 305膽堿（choline）104.17生物堿 44568343秋水仙堿（colchinine）415.40生物堿 442658夏佛塔苷（schaftoside）543.50黃酮 3084995異夏佛塔苷（isoschaftoside）546.50黃酮 12285902掌葉半夏堿F（pedatisectine F）214.22生物堿

圖3 成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.11.3 疾病靶點的篩選 以“allergic asthma”為檢索詞，在GeneCard數(shù)據(jù)庫中獲得過敏性哮喘的相關(guān)靶點，并整合數(shù)據(jù)。

2.11.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的建立與分析建立天南星活性成分、作用靶點、疾病相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中，利用該軟件的“merge”工具構(gòu)建天南星治療過敏性哮喘的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖4。

2.11.5 潛在活性成分預(yù)測 將天南星的活性成分的靶點和過敏性哮喘的相關(guān)靶點上傳至在線韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，Version 2.1.0）進行映射即兩者取交集，獲得天南星治療過敏性哮喘的潛在成分。進一步依據(jù)檢索到的過敏性哮喘潛在靶點和天南星相關(guān)靶點映射藥對中可能存在治療作用的潛在活性成分共10個，結(jié)果見表6。

3 討論

天南星的毒性成分報道較多為草酸鈣針晶、生物堿和凝集素蛋白。而其功效成分還未研究清楚，但有學(xué)者表明，黃酮、多糖和皂苷都具有一定的活性[21,33,51]。因此，采用HPLC法和紫外分光-光度法，對炮制前后天南星中主要化學(xué)成分的含量進行測定。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出天南星共有10個化學(xué)成分與過敏性哮喘有關(guān)。這些化學(xué)成分包括β-谷甾醇、膽固醇、腺嘌呤、γ-谷甾醇、夏佛塔苷等。因為天南星中有些化學(xué)成分含量較低，檢測成分含量時有一定的難度，因此檢測天南星中的大類成分。

實驗結(jié)果表明，加少量白礬長時間浸泡樣品（樣3）草酸含量最高，可能與長時間浸泡使草酸鈣針晶更易溶出被檢測到。單純加大量白礬煎煮（樣7）最低，說明加入白礬以及加熱處理會破壞草酸鈣針晶甚至使草酸流失。白礬長時間浸泡樣品（樣6）與各樣品比較差異不大，說明在白礬不加熱情況下對草酸含量影響不大。而單純水煮（樣8）、單純生姜煮（樣5）及生姜白礬共煮（樣4）草酸含量差異不大，但姜礬共煮（樣4）破壞草酸鈣針晶程度遠大于單純白礬煎煮（樣7），與樣4在煎煮前長時間浸泡使草酸鈣針晶易于析出更容易被破壞有關(guān)。實驗結(jié)果僅以草酸含量推測草酸鈣針晶缺乏更直接的證據(jù)，但也能從側(cè)面反映出浸泡時間長短和白礬加熱處理對草酸鈣針晶影響較大。

圖4 天南星“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

表6 天南星治療過敏性哮喘潛在活性成分

Table 6 Potential active ingredients of AR in treatment of allergic asthma

編號化合物類別 18,11,14-二十二碳三烯酸甲酯（8,11,14-docosatrienoic acid, methyl ester）苷類 2掌葉半夏堿F（pedatisectine F）生物堿 3[(2R)-2-[[(2R)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯丙?；鵠氨基]甲基]-3-苯基丙基]乙酸酯［(2R)-2-[[[(2R)-2-(benzoylamino)-3-phenylpropanoyl]amino]methyl]-3-phenylpropyl] acetate］甾醇 4秋水仙堿（colchinine）生物堿 5夏佛塔苷（schaftoside）黃酮 6γ-谷甾醇（γ-sitosterol）甾醇 7十八烷基-[2-(三甲基氮雜鎓基)乙氧基]次膦酸酯（CLR）甾醇 8D-甘露醇（D-sitosterol）甾醇 9淀粉（amylum）糖類 1024-菜油甾醇（24-epicampesterol）甾醇

黃酮類成分溶于水導(dǎo)致各樣品含量均有不同程度降低；單純生姜處理（樣5）及姜礬法（樣4）相比其他處理樣品含量高，有可能生姜中引入黃酮類成分，且加入白礬后可能使黃酮類成分降低，但礬水煎煮（樣7）和純水煎煮（樣8）含量接近，說明白礬對黃酮影響不大，因此還需進一步分析。白礬長時間浸泡（樣6）含量最低，可能是反復(fù)水處理導(dǎo)致成分流失。

皂苷類成分易溶于水導(dǎo)致各樣品含量均有不同程度降低；單純生姜處理（樣5）相比其他處理樣品含量高，有可能生姜中引入黃酮類成分，姜礬法（樣4）、礬水煎煮（樣7）和純水煎煮（樣8）含量接近，說明白礬會影響生姜中皂苷成分與天南星的結(jié)合。白礬長時間浸泡（樣6）含量與其它樣品差異不大，提示皂苷類成分易溶于水，前期水處理已損失較多，是否加熱對皂苷類成分影響不大。

生物堿易受水處理和加熱的影響，單純水煎煮（樣8）含量最低，加入白礬和生姜加熱處理一定程度會影響生物堿的損失，且白礬效果優(yōu)于生姜。

多糖易溶于熱水，單純生姜處理（樣5）及姜礬法（樣4）相比其他處理樣品含量高，有可能生姜中引入多糖類成分，且礬水煎煮（樣7）高于純水煎煮（樣8）含量，說明白礬對多糖有一定的影響，具體原因還需進一步分析。

蛋白遇熱易變性失活，功效會降低，在不同pH值下被分解。礬水煎煮（樣7）和姜礬法（樣4）相比其他處理樣品含量低，加熱或白礬浸泡也有不同程度的降低，且加熱對蛋白影響小于白礬對蛋白的影響。生姜煎煮法與生天南星差別不大，通過與郁紅禮等報道[13]分析，生姜本身對天南星凝集素蛋白影響不大，但是本實驗測定的是總蛋白含量，生姜中本身也有一定量蛋白，兩者間相互影響，還需進一步研究分析。

尿苷、腺苷、胸腺嘧啶核苷、鳥苷、次黃嘌呤、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、肌苷等8種化學(xué)成分在炮制過程中含量發(fā)生變化。結(jié)果表明，姜礬法（樣4）處理使腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷的含量在炮制之后幾乎檢測不到，有可能加熱、加入生姜和白礬對腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷的影響較大。加入白礬處理（樣3、6、7）一定程度影響8種成分含量，加入白礬溶液反復(fù)處理（樣6）對腺苷、鳥苷、肌苷影響較大，幾乎檢測不到3種成分的含量。單純水煎煮（樣8）對8種成分的含量影響不大，由于夏佛塔苷和異夏佛塔苷屬于黃酮類成分，礬水煎煮（樣7）和純水煎煮（樣8）含量接近，說明白礬對黃酮類成分的影響不大。肌苷在炮制后含量幾乎檢測不到，說明炮制對肌苷的影響最大。姜礬法（樣4）處理時含量增加，可能是因為加入生姜和白礬產(chǎn)生了物質(zhì)使得肌苷含量增加。但具體原因還需要進一步分析。

毒性藥在炮制時首要考慮的是降低毒性，但在降低毒性的同時也要盡可能地保留原有功效。雖然在減毒工藝以及毒性成分的研究上取得了一定的進展，但是對于天南星藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及炮制過程對化學(xué)成分變化尚不明確，因此應(yīng)當(dāng)充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，進一步揭示天南星炮制過程中有效成分的變化規(guī)律，明確炮制減毒存效的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)化其炮制工藝，確保臨床用藥安全有效。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on chemical composition changes ofbefore and after processing

QI Chun-yan1, 2, WANG Jing1, WU Xu1, 2, ZHANG Qiao1, 2, SONG Yi-jun1, 2, ZHAO Chong-bo1, 2, WU Jian-hua1, 2

1. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. Shaanxi Traditional Chinese Medicine Processing Technology Heritage Base, Xianyang 712046, China

Six kinds of chemical components were determined and analyzed simply from Tiannanxing (, AR) before and after processing.Scanning electron microscope, UV, HPLC and BCA protein concentration determination kit were used to study the morphology of calcium oxalate needle crystals, the contents of oxalic acid, flavonoids, saponins, alkaloids, polysaccharides, protein, uridine, adenosine, thymidine, guanosine, hypoxanthine, chafotalin, isochafotalin and inosine before and after processing of AR.Needle crystal structure of calcium oxalate processed by addingchanged obviously; The content of oxalic acid was the highest when it was soaked with a small amount of, and the lowest when it was only boiled with a large amount of; The content of total flavonoids was the highest in raw AR and the lowest in long-time soaking; The content of total saponins was the highest in raw AR, and the lowest in simple decoction with a large amount of; The content of total alkaloids in AR was the highest and that in water decoction was the lowest; The content of polysaccharide inwas the highest, while that in water was the lowest; The content of total protein was the highest in raw and the lowest in. Chemical components such as uridine, adenosine, uridine, and shafutaside changed in different degrees during processing.Six kinds of chemical components in RA have different degrees of changes in the processing process, and the addition oftreatment has the greatest impact on the components. The order of adding excipients and water decoction treatment can change the content of chemical components in AR, which provides a reference for the research on the processing mechanism of AR.

; processing; HPLC; UV-spectrophotometry; calcium oxalate; oxalic acid; flavonoids; saponin; alkaloids; polysaccharide; protein; uridine; adenosine; thymidine; guanosine; hypoxanthine; schaftoside; isoschaftoside;inosine;;

R283.1

A

0253 - 2670(2022)01 - 0087 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.012

2021-06-03

國家自然科學(xué)基金青年項目（81803732）；陜西省教育廳自然科學(xué)專項（20JK0598）；陜西省科技廳重點研發(fā)計劃項目（2021SF-385）

祁春艷，碩士研究生，從事中藥炮制與飲片質(zhì)量標(biāo)準研究。Tel: 18097388619 E-mail: 1824060853@qq.com

趙重博，博士，副教授，從事中藥炮制與飲片質(zhì)量標(biāo)準研究。Tel: (029)38185172 E-mail: zhao_chongbo@126.com

吳建華，碩士，副教授，從事中藥炮制與飲片質(zhì)量標(biāo)準研究。E-mail: 549536693@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]