液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜法分析29種芬太尼類物質(zhì)及其碎裂機理

董振霖, 楊春光, 徐 天, 代 弟, 高 鷺, 楊 璐, 王秋艷

(大連海關技術中心, 遼寧 大連 116001)

芬太尼(fentanyl)是一種人工合成的強效麻醉性阿片類鎮(zhèn)痛藥,屬于新精神活性物質(zhì),其衍生物種類繁多,在2019年5月前,我國對25種芬太尼類物質(zhì)和2種前體物質(zhì)N-苯乙基-4-哌啶酮(NPP)和4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)實行管控。隨著芬太尼衍生品種的不斷增加,我國自2019年5月1日起將芬太尼類物質(zhì)整類列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》中進行管控。

目前,芬太尼類物質(zhì)的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)[1,2]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3,4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5-20]及液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[21-27]等。HPLC靈敏度低,定性能力不足。GC-MS受檢測方法限制,前處理繁瑣,定性手段單一。LC-MS/MS應用較普遍,報道也較多,缺點是定性手段單一,疑似陽性樣品尚需其他手段確證,羅耀等[15]采用LC-MS/MS檢測固體和液體樣品中27種芬太尼,Strayer等[19]采用LC-MS/MS檢測血液中21種芬太尼類似物和代謝物,檢測品種雖然較多,但存在仍需其他手段輔助確證的缺點。HPLC-HRMS檢測芬太尼類物質(zhì)既有穩(wěn)定的定量能力,同時又兼具良好的鑒別和確證能力。張偉亞等[23]采用HPLC-HRMS無標準品快速篩查32種芬太尼,鄧慧芬等[27]采用HPLC-HRMS檢測27種芬太尼,檢測品種均側(cè)重于2019年5月1日前列管的25種芬太尼和2種前體物質(zhì),存在檢測品種覆蓋范圍窄的缺點。

整類芬太尼類物質(zhì)檢測的難點在于一是品種繁多,目前全球公布已發(fā)現(xiàn)的芬太尼品種近150種,且目前中國整類列管,二三十種芬太尼類物質(zhì)的檢測無法覆蓋整類檢測的要求;二是芬太尼類物質(zhì)標準品因為其高度敏感性、高度管控性和價格極其昂貴,實驗室根本無法購買到全部標準品。本方法嘗試將整類近150種芬太尼按相對分子質(zhì)量、分子結(jié)構和碎裂規(guī)律進行分類。將化合物相對分子質(zhì)量按順序排列,相對分子質(zhì)量不同的化合物分子結(jié)構相近、二級碎片的碎裂規(guī)律可能相似的歸為一類,如乙酰、丙酰、丁酰芬太尼等歸為一類,選取1種購買標準品,其他不能歸類的相對分子質(zhì)量不同、分子結(jié)構差異較大化合物都單獨購買標準品。相對分子質(zhì)量相同的異構體類化合物,分子結(jié)構和碎裂規(guī)律相近的,歸為一類購買1種標準品,但分子結(jié)構和碎裂規(guī)律可能差異較大的每一類也需選取1種購買標準品,按此歸類思路將近150種芬太尼分成29大類,購買到代表性的29種芬太尼標準品。本方法除對29種芬太尼進行準確定性和定量檢測外,根據(jù)29種芬太尼類物質(zhì)的二級譜圖,解析每一個碎片的碎裂途徑,詳細總結(jié)了整類芬太尼物質(zhì)的碎裂規(guī)律,嘗試在無標準品的情況下,為芬太尼類物質(zhì)的整類篩查檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TripleTOF 5600+液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀和Analyst TF1.7工作站(美國AB Sciex公司); MSA225S-1CE-DA分析天平(德國Sartorius公司,感量0.01 mg); JY3002分析天平(上海精密科學儀器公司,感量0.01 g); MS 3 Digital渦旋混合器(德國IKA公司); PRO VF-T超純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司); Hermle Z323K離心機(德國Hermle公司);移液器(10～100 μL、20～200 μL、100～1 000 μL,德國Eppendorf公司)。

乙腈和甲醇(色譜純)購自美國Thermo Scientific公司;甲酸(色譜純)購自北京迪科馬科技有限公司。

29種芬太尼標準品(見表1):硫代芬太尼、α-甲基硫代芬太尼、4-甲氧基乙酰芬太尼、4-甲氧基丙烯酰芬太尼、4-甲氧基甲氧乙酰芬太尼、4-甲氧基四氫呋喃芬太尼和庚酰芬太尼固體標準品,純度均大于95%,購自上海原思標物科技有限公司;其余22種芬太尼標準品(100 mg/L,溶劑為甲醇)購自天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 標準溶液配制

分別準確吸取22種100 mg/L液體標準溶液1 mL,用甲醇定容至10 mL,配成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標準儲備溶液;分別準確稱取7種固體標準品1 mg(精確至0.01 mg),用甲醇定容至10 mL,配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備溶液,于4 ℃避光保存。

分別吸取上述29種標準儲備溶液適量,置于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為200 μg/L的混合標準儲備溶液,于4 ℃避光保存。將混合標準儲備溶液用10%乙腈水溶液稀釋成適當濃度的混合標準工作溶液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

藥品和白色粉末類、蛋白質(zhì)和乳飲料類:稱取試樣0.2 g(精確至0.01 g,固體樣品稱量前需搗碎或研磨等混合均勻,液體樣品稱量前需搖勻),置于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙腈提取溶液,在渦旋器上渦旋2 min,以4 000 r/min離心5 min,取上清液2 mL過濾膜(0.20 μm,有機相),待測。

含糖固體或粉末類、飲用水類、果蔬飲料類、保健飲料類、茶飲料類、酒類:提取溶液為10 mL 10%乙腈水溶液,其余操作同上。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:40 ℃;流動相A為0.08%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～5.0 min, 5%B～80%B; 5.0～8.0 min, 80%B; 8.0～8.1 min, 80%B～5%B; 8.1～10.5 min, 5%B。進樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;質(zhì)譜校正方式:甲酸鈉溶液外標法校正;校正周期:甲酸鈉校正液和其他測試溶液穿插進樣(每進一針標準溶液或樣品前需要先進一針甲酸鈉溶液校正質(zhì)譜質(zhì)量數(shù));采集模式:一級質(zhì)譜和信息依賴觸發(fā)的二級質(zhì)譜同時采集(TOF MS-IDA-TOF MS/MS);掃描范圍:m/z50～650;電噴霧電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 550 ℃;霧化氣壓力(GS1): 345 kPa;輔助氣壓力(GS2): 414 kPa;氣簾氣壓力(CUR): 276 kPa;去簇電壓(DP): 80 V;碰撞能(CE): (30±5) V。

1.5 定性檢測

1.5.1高分辨質(zhì)譜庫建立

輸入29種芬太尼類物質(zhì)的化學式和中英文名稱,由高分辨質(zhì)譜軟件計算得到每個化合物母離子的理論精確質(zhì)量數(shù)([M+H]+),構建為一級化合物譜庫,見表1。

分別單獨采用29種芬太尼類物質(zhì)的標準工作溶液,在IDA-TOF MS/MS模式下采集其二級碎片離子譜圖,將其導入高分辨質(zhì)譜庫,構建為二級化合物譜庫,29種化合物的二級離子信息見表1。

1.5.2鑒別

在TOF MS模式下(一級),樣品溶液中待測物保留時間與對應濃度標準溶液的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi);待測物母離子精確質(zhì)量數(shù)實測值與理論值偏差小于或等于5×10-6,則可初步判斷試樣中含有該種芬太尼類物質(zhì)。

1.5.3確認

對于初步鑒別出的陽性芬太尼類物質(zhì),在IDA-TOF MS/MS模式下檢測其二級碎片離子,如果至少有2個及以上豐度較高的碎片離子與譜庫中相對應碎片離子的相對豐度一致,即偏差不超過表2中規(guī)定的范圍,且待測物子離子二級碎片離子與二級譜庫的匹配度得分(library score)在60分以上(匹配時二者CE值應確保相同)的情況下,可判定為試樣中存在該種芬太尼類物質(zhì)。

表 2 確認分析時相對離子豐度的最大允許偏差Table 2 Maximum allowable deviations of relativeion abundance in qualitative detection

2 結(jié)果與討論

2.1 芬太尼類物質(zhì)的碎裂規(guī)律

根據(jù)29種化合物的二級質(zhì)譜圖,對每個化合物的每個碎片進行質(zhì)譜解析,從而總結(jié)出芬太尼類化合物的一般碎裂規(guī)律,具體如下。其中芬太尼、硫代芬太尼和舒芬太尼的二級質(zhì)譜圖及其每個碎片離子的碎裂機理見圖1。

圖 1 芬太尼、硫代芬太尼和舒芬太尼的二級質(zhì)譜圖及其碎裂機理Fig. 1 MS2 spectra and fragmentation mechanisms of fentanyl, thiofentanyl, and sufentanili: induced cleavage; rH: single H rearrangement; r2H: double H rearrangement; re: elimination reaction.

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

(1)芬太尼類化合物母離子穩(wěn)定性非常好,絕大多數(shù)化合物在CE值達到30 V后,母離子才能有效碎裂。

(2)上述3種芬太尼誘導斷裂(i)形成的m/z188、105、194、111、238離子豐度比都較高,誘導斷裂均來自酰胺基和哌啶基,且酰胺基的誘導能力明顯強于哌啶基。除哌啶基對位含有其他取代基的化合物外,絕大多數(shù)芬太尼物質(zhì)誘導斷裂均為主要斷裂方式,豐度比最高的碎片均由誘導斷裂而來。

(3)芬太尼和硫代芬太尼中m/z281、287的碎片離子是發(fā)生單H重排(rH)失去丙?；乃槠x子,在庚酰芬太尼和環(huán)丙基芬太尼等化合物中均有類似的重排發(fā)生,該類離子豐度比雖不高,但具有特異性和規(guī)律性,丙?；⒏；戎辨溚闊N取代基和環(huán)丙酰基等環(huán)烷烴類取代基均有類似特異性離子出現(xiàn),直鏈烷烴取代基碳數(shù)越多,離子豐度越高,例如庚酰芬太尼中m/z281離子豐度比明顯高于芬太尼。

(4)芬太尼和硫代芬太尼中m/z216、146、132碎片離子均為發(fā)生雙H重排(r2H)后雙鍵斷裂形成的碎片離子,雙H重排離子雖然豐度比也不高,也同樣具有特異性和規(guī)律性,絕大多數(shù)芬太尼都含有該類離子,特別是雙H重排得到的m/z216碎片離子,對于酰胺上取代基不同的化合物通過雙H重排得到的碎片則會不同,具有明顯的特異性,有助于確定取代基的基團組成,與之相似碎裂規(guī)律形成的離子有庚酰芬太尼m/z272、環(huán)丙基芬太尼m/z228、苯基芬太尼m/z264和甲氧基乙酰芬太尼m/z232等的碎片離子。

(5)上述3個化合物中m/z134、140均為消除反應(re)產(chǎn)物離子,苯乙基取代基比噻吩乙基取代基更容易發(fā)生消除反應(豐度比更高),消除反應也是該類化合物中非常普遍的碎裂方式。

(6)對比研究29種芬太尼二級碎片離子,m/z146、134的碎片是苯乙基取代類芬太尼均會產(chǎn)生的兩個碎片,具有顯著的規(guī)律性。

(7)除上述3種芬太尼外,舒芬太尼這類在哌啶基對位含有甲氧基取代基的化合物碎裂離子均非常多,誘導斷裂離子不一定是豐度比最高的離子,更容易發(fā)生單H重排失去CH3OH中性分子的碎裂模式,形成離子的m/z為355。類似的還有瑞芬太尼這類在哌啶基團對位含有COOCH3取代基的化合物,碎裂離子也較多,也更容易發(fā)生單H重排失去HCOOCH3或CH3OH中性分子的碎裂模式,形成離子的m/z為317或345。

(8)β-羥基芬太尼、β-羥基硫代芬太尼這類含有羥基取代基的化合物,具有顯著特征的脫水離子產(chǎn)生,形成的離子m/z分別為335和341。

根據(jù)上述總結(jié)的芬太尼物質(zhì)碎裂規(guī)律和特點,可以嘗試輔助進行整類芬太尼類物質(zhì)的篩查檢測。

步驟1:通過查閱文獻和資料,盡可能多搜集整類芬太尼類物質(zhì),建立收集到的芬太尼類物質(zhì)一級譜庫,完成非靶標篩查至靶標篩查的轉(zhuǎn)換,再將未知樣品LC-QTOF-MS檢測后,進行一級譜庫篩查,篩查是否含有精確分子量和同位素分布均滿足要求的疑似陽性芬太尼類物質(zhì)。

步驟2:如有疑似陽性芬太尼類物質(zhì),根據(jù)該化合物結(jié)構式和上述碎裂規(guī)律,可以大致推導出該化合物的幾個主要碎片離子,再與實際得到的二級碎片離子進行比較，判斷是否一致;也可以反向?qū)Ρ?采用實際得到的該疑似芬太尼二級碎片離子,根據(jù)上述規(guī)律研究每個碎片離子是否符合該疑似化合物的碎裂規(guī)律。通過這兩個步驟可以輔助判定該疑似化合物是否為陽性。

例如:假設根據(jù)步驟1篩查出疑似物4-氯環(huán)丁基芬太尼(不常見品種),參照本文29種芬太尼中與其結(jié)構和碎裂機理類似的芬太尼、環(huán)丙基芬太尼和對氟脫丙酰芬太尼3個化合物的二級碎片和上述碎裂機理規(guī)律的總結(jié),綜合比較和推理,可以從理論上推測出4-氯環(huán)丁基芬太尼大概率含有m/z188、105、146、276、134二級碎片離子,再與實際檢測獲得的二級碎片離子進行比對，判斷是否一致。或者反向比對,通過實際得到的二級碎片離子,根據(jù)上述裂解規(guī)律總結(jié)研究每個碎片離子是否都符合裂解規(guī)律,并都能合理解釋,也可判定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱

同分異構體因相對分子質(zhì)量相同,若色譜峰重合,采用高分辨質(zhì)譜無法進行準確定性和定量,需要HPLC對異構體進行分離。29種芬太尼物質(zhì)中,β-羥基芬太尼、甲氧基乙酰芬太尼和4-甲氧基乙酰芬太尼屬于同分異構體且分離比較困難。本實驗選取10根不同規(guī)格和型號的色譜柱(Kinetex C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)、Atlantis dC18(150 mm×2.1 mm, 3 μm)、Poroshell EC-C18(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)、ZORBAX Eclipse PlusC18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)、BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)、Atlantis T3(150 mm×2.1 mm, 3 μm)、Xselect CSH C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)、Kinetex EVO C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)和Sunfire C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm))，嘗試分離這3種化合物。除研究3種異構體分離外,同時考察了出峰最早的去甲芬太尼和出峰最晚的庚酰芬太尼在10根不同色譜柱上的峰形和保留能力。采用不同色譜柱時,在1.4.1節(jié)色譜條件下,5種芬太尼的提取離子色譜圖見圖2。在不同色譜柱上,5種芬太尼出峰順序依次為去甲芬太尼、4-甲氧基乙酰芬太尼、β-羥基芬太尼、甲氧基乙酰芬太尼和庚酰芬太尼。

由圖2可知,采用Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)時,3種異構體分離效果最好,接近基線分離,其他色譜柱分離情況均不理想。同時在該色譜柱上,去甲芬太尼和庚酰芬太尼峰形良好,二者均無明顯的峰拖尾和峰展寬,保留時間也比較理想,其他24種化合物在該色譜柱上也峰形良好,所有化合物容量因子均介于1.5～5.0之間,效果較好。因此本方法最終選擇Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)。

2.2.2流動相起始比例

在采用Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)、流速為0.4 mL/min的條件下,去甲芬太尼、丁酰去甲芬太尼和去甲舒芬太尼混合標準溶液(50 μg/L)分別按5%乙腈和10%乙腈起始比例梯度洗脫程序進行測試分析(見圖3)。實驗表明，起始比例不同,對出峰較早、極性較強的上述3種化合物峰形影響較大。采用10%乙腈起始比例梯度洗脫程序,3種化合物半峰寬均較寬,去甲芬太尼的峰展寬更顯著,5%乙腈起始比例梯度洗脫程序3種化合物,色譜峰半峰寬均較窄,峰形更佳,因此本方法選取5%乙腈起始比例的梯度洗脫程序。在優(yōu)化后確定的色譜條件下,29種芬太尼的保留時間見表1,提取離子色譜圖見圖4。

圖 2 5種芬太尼在不同色譜柱上的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the five fentanyl analogs on different columnsa. Kinetex C18 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); b. Atlantis dC18 (150 mm×2.1 mm, 3 μm); c. Poroshell EC-C18 (150 mm×3.0 mm, 2.7 μm); d. ZORBAX Eclipse Plus C18 (150 mm×3.0 mm, 3.5 μm); e. BEH C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); f. ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mm×3.0 mm, 3.5 μm); g. Atlantis T3 (150 mm×2.1 mm, 3 μm); h. Xselect CSH C18 (150 mm×3.0 mm, 3.5 μm); i. Kinetex EVO C18 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); j. Sunfire C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm).Peak identifications: 1. norfentanyl; 2. 4-methoxy acetyl fentanyl; 3. β-hydroxy fentanyl; 4. methoxyacetyl fentanyl; 5. heptanoyl fentanyl.

圖 3 不同梯度洗脫程序下3種芬太尼的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the three fentanyl analogs with different gradient elution programs Mobile phases in Fig. 3a and Fig. 3b: (A) 0.08% formic acid aqueous solution and (B) acetonitrile; gradient elution program: in Fig. 3a, 0-5.0 min, 5%B-80%B, 5.0-8.0 min, 80%B, 8.0-8.1 min, 80%B-5%B, 8.1-10.5 min, 5%B; in Fig. 3b, 0-5.0 min, 10%B-80%B, 5.0-8.0 min, 80%B, 8.0-8.1 min, 80%B-5%B, 8.1-10.5 min, 10%B.Peak identifications: 1. norfentanyl; 2. butyryl norfentanyl; 3. norsufentanil.

圖 4 29種芬太尼混合標準溶液(10.0 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of the 29 fentanyl analogs (10.0 μg/L) in mixed standard solution

2.3 基質(zhì)效應

本方法前處理采用直接提取稀釋法,樣品中可能會存在一定的基質(zhì)效應干擾。本實驗對降糖藥、露露、葡萄糖粉、珍露保健飲料和巧克力5種基質(zhì)進行了考察,并以目標物在空白基質(zhì)液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來評估基質(zhì)效應。當結(jié)果為80%～120%時,表明無基質(zhì)效應;高于120%,表明有基質(zhì)增強效應;低于80%,則表明有基質(zhì)抑制效應。結(jié)果顯示,29種芬太尼在5種基質(zhì)中的基質(zhì)效應為75.2%～119.5%,無基質(zhì)增強效應,存在一定的基質(zhì)抑制效應,但基質(zhì)抑制效應不明顯?？紤]到芬太尼類物質(zhì)檢測基質(zhì)較特殊,空白基質(zhì)不易獲得,基質(zhì)匹配定量在日常檢測中的應用會受到限制。因此,本實驗未采用基質(zhì)匹配進行定量,采用溶劑標準溶液進行定量。

2.4 方法學考察

2.4.1線性范圍

將29種芬太尼混合標準儲備溶液,用10%乙腈水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10和20 μg/L的標準工作溶液,在1.4節(jié)條件下進行檢測,以峰面積對標準溶液中各組分的質(zhì)量濃度繪制工作曲線。29種芬太尼在1～20 μg/L范圍內(nèi)呈線性關系,相關系數(shù)(r)均大于0.995。

2.4.2檢出限、回收率、精密度

本方法按照信噪比(S/N)≥3確定檢出限(LOD),均為0.01 mg/kg。根據(jù)歐盟文件SANTE/11813/2017規(guī)定,定量限(LOQ)為加標回收試驗中回收率和RSD均滿足性能要求(回收率70%～120%和RSD≤20%)的最低加標水平。

實驗選取空白降糖藥、露露、葡萄糖粉、珍露保健飲料和巧克力樣品進行0.05、0.1和0.5 mg/kg 3個水平的加標回收試驗,每個水平做6個平行樣品(n=6),按本方法進行檢測,加標回收率和精密度數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明,29種芬太尼在5種基質(zhì)中回收率為85.2%～112.9%,RSD為1.9%～19.8%,說明方法準確度高,重復性好,適用于藥品類、含糖固體或粉末類、飲料類、飲用水類和酒類等樣品的檢測。

表 3 29種芬太尼的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 29 fentanyl analogs (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

由上述可知,本方法最低加標水平為0.05 mg/kg, 29種芬太尼在5種基質(zhì)中平均回收率和RSD均滿足要求,且信噪比(S/N)>10,因此確定本方法LOQ均為0.05 mg/kg。

2.5 實際樣品的檢測

建立的方法應用于大窯灣海關和大連郵局海關可疑樣品的檢測,共檢測葡萄糖粉(白色粉末)樣品11批次、純凈水樣品2批次、舊報紙樣品(報紙樣品可參照藥品和白色粉末類、蛋白質(zhì)和乳飲料類步驟進行前處理)2批次、可疑白色藥片3批次和珍露保健飲料(黑色液體)1批次,檢測結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本文建立了飛行時間高分辨質(zhì)譜定性和定量檢測29種芬太尼類物質(zhì)的分析方法,該方法檢測速度快,定性準確,靈敏度高,實用性強,能夠滿足公安緝毒、刑偵、郵局海關和機場海關等對芬太尼監(jiān)控的檢測技術要求,具有較好的應用價值。本文詳細研究了29種芬太尼化合物每個碎片離子的碎裂機理,總結(jié)出芬太尼類化合物的碎裂規(guī)律和特點,對整類芬太尼類物質(zhì)的篩查檢測,具有一定的參考價值。