油用牡丹組培快繁研究

任曉琴，楊靜慧，通信作者，劉艷軍，張景新，馬昕，馮國(guó)華

油用牡丹組培快繁研究

任曉琴1，楊靜慧1，通信作者，劉艷軍1，張景新2，馬昕2，馮國(guó)華3

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392；2. 天津市薊州林業(yè)局，天津 301900；3. 天津市公路局直屬處，天津 300074）

為建立油用牡丹組培快繁體系，本研究以油用牡丹腋芽為外植體，采用不同濃度的消毒劑進(jìn)行表面消毒，獲得無(wú)菌苗；將無(wú)菌苗分別接種到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行側(cè)芽的增殖培養(yǎng)；將獲得的再生苗接種到含有不同濃度的生長(zhǎng)素培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。結(jié)果顯示：采用15%的安替福民，處理5 min，獲得的消毒效果最好；在MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3培養(yǎng)基上油用牡丹再生芽增殖效果最好；在MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC培養(yǎng)基上再生苗生根效果最好。本試驗(yàn)結(jié)果可以為油用牡丹的組培研究奠定基礎(chǔ)。

油用牡丹；組培；腋芽；MS培養(yǎng)基

牡丹屬于芍藥科芍藥屬，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名貴木本花卉，具有較高的欣賞價(jià)值、藥用價(jià)值和油用價(jià)值[1]。近年來(lái)，相關(guān)調(diào)研發(fā)現(xiàn)油用牡丹‘鳳丹’可作為木本糧油植物資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，油用牡丹一般產(chǎn)油量是1.1×103kg/hm2，遠(yuǎn)高于芝麻、油茶等，并且油用牡丹籽油多項(xiàng)指標(biāo)超過(guò)了橄欖油[2-3]。因此，油用牡丹受眾人喜愛(ài)，但在繁殖方面存在一些弊端。油用牡丹雖然有性繁殖系數(shù)大，但實(shí)生苗變異大，不能較好的保存母本優(yōu)良性狀，若對(duì)牡丹進(jìn)行無(wú)性繁殖，受植物材料、外界環(huán)境影響因素較多[4]。繁殖成活率較低。因此，組織培養(yǎng)是牡丹繁殖方式的最有效手段之一。本研究旨在建立油用牡丹組培快繁體系，為今后油用牡丹的組培研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用油用牡丹‘鳳丹’植株由薊州區(qū)油用牡丹生產(chǎn)基地提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒處理試驗(yàn)

4月中旬，將田間的3年生油用牡丹植株移栽至花盆，在溫室條件下培養(yǎng)30 d，待植株新梢長(zhǎng)到20 cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)剪取帶有葉柄的莖段為外植體。先用70%的酒精消毒處理，再將其放在含有不同濃度的安替福民消毒液中分別消毒3、5、8、10 min，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3次。將消毒處理好的外植體接種到MS培養(yǎng)基上，將接種好的三角瓶置于溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，24 h連續(xù)光照下培養(yǎng)。7 d后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[5]。

1.2.2 油用牡丹側(cè)芽增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

待油用牡丹腋芽萌發(fā)后，重新轉(zhuǎn)移到新的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。再生苗長(zhǎng)到3 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有不同激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)采用三角瓶的容器為100 mL，每瓶中接種3個(gè)芽苗，每個(gè)處理重復(fù)10次。培養(yǎng)條件與上一步驟相同。30 d后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 組培苗生根培養(yǎng)試驗(yàn)

為了獲得良好的油用牡丹組培生根苗，試驗(yàn)采用不同生長(zhǎng)素進(jìn)行生根誘導(dǎo)，同時(shí)采用不同滲透壓進(jìn)行輔助試驗(yàn)[6]。當(dāng)增殖后的油用牡丹組培苗長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，從外植體上剪下，將其接種到生根培養(yǎng)基上，每30個(gè)為一個(gè)試驗(yàn)處理組合。培養(yǎng)條件為：溫度24 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為1 000 lx。30 d后對(duì)生根結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油用牡丹外植體表面消毒試驗(yàn)結(jié)果

7 d后，接種到MS培養(yǎng)基上的油用牡丹外植體出現(xiàn)不同變化，具體消毒情況見(jiàn)表1。

表1 油用牡丹外植體消毒處理結(jié)果

從表1可以看出，不同濃度安替福民及不同消毒時(shí)間對(duì)于油用牡丹外植體消毒效果的影響存在較大差異。首先，采用較低濃度消毒液時(shí)，外植體污染率較高。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸下降，但外植體的死亡率增加，說(shuō)明低濃度消毒液進(jìn)行表面消毒，并不能收到理想的結(jié)果。同時(shí)，從試驗(yàn)結(jié)果還可看出，油用牡丹外植體長(zhǎng)時(shí)間浸泡在消毒液中，會(huì)造成外植體的玻璃化現(xiàn)象，從而增加了外植體的死亡率；當(dāng)增加安替福民的濃度時(shí)，消毒效果明顯增強(qiáng)。但當(dāng)消毒液濃度超過(guò)20%時(shí)，會(huì)對(duì)外植體造成傷害，死亡率也達(dá)到44%，說(shuō)明油用牡丹外植體對(duì)安替福民較為敏感。因此，采用相對(duì)較低濃度的消毒液，在較短時(shí)間內(nèi)消毒效果明顯提高。從表中1知，采用15%的安替福民、消毒5 min時(shí)，獲得的消毒效果最好，除了個(gè)別外植體死亡外，其他都可以實(shí)現(xiàn)表面消毒。

2.2 油用牡丹側(cè)芽增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)表面消毒后，將油用牡丹外植體轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中加入30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂粉；pH值調(diào)節(jié)到5.8。待腋芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，將其從外植體上切下，接種到增殖培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)30 d的培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)基上外植體側(cè)芽萌發(fā)及生長(zhǎng)情況出現(xiàn)不同變化，具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 油用牡丹側(cè)芽增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

注：培養(yǎng)基具體配方為：1. MS；2. MS＋1.0 mg/L BA；3. MS＋0.5 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；4. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；5. MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA；6. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋0.5 g/L AC；7. MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3

從表2可以看出，不同激素與培養(yǎng)基添加劑對(duì)油用牡丹側(cè)芽增殖培養(yǎng)產(chǎn)生不同的影響。首先，采用MS培養(yǎng)基時(shí)，側(cè)芽基本不萌發(fā)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，植株出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。甚至褐變死亡；當(dāng)只使用分裂素BA時(shí)，植株生長(zhǎng)緩慢，側(cè)芽少數(shù)萌發(fā)，但萌發(fā)出的芽基本為玻璃化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸萎縮死亡；當(dāng)采用BA與IAA配合使用時(shí)，側(cè)芽萌發(fā)率明顯增加，增殖系數(shù)相應(yīng)提高，但萌發(fā)出的側(cè)芽生長(zhǎng)勢(shì)較弱，多數(shù)出現(xiàn)玻璃化。為消除玻璃化對(duì)油用牡丹再生芽生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)選用2種添加劑進(jìn)行玻璃化的防治，分別加入一定量的活性炭和硝酸銀[5]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入硝酸銀效果明顯，然而活性炭對(duì)玻璃化影響不大。加入硝酸銀后，不但可以抑制再生芽的玻璃化現(xiàn)象，同時(shí)也可增加側(cè)芽的萌發(fā)效率和生長(zhǎng)速度。因此，選擇MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3為油用牡丹增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方較合適。

2.3 組培苗生根培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果

將生長(zhǎng)健壯的油用牡丹再生苗轉(zhuǎn)接到含有不同生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中加入30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂粉；pH值調(diào)節(jié)到5.8。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，在組培苗的基部出現(xiàn)再生根，不同培養(yǎng)基上再生根的數(shù)量和生長(zhǎng)情況不同，具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同激素對(duì)油用牡丹組培苗生根的誘導(dǎo)結(jié)果

注：培養(yǎng)基具體配方為：1. MS；2. 1/2 MS；3. 1/2 MS＋0.5 mg/L IAA；4. 1/2 MS＋0.1 mg/L NAA；5. MS＋ 0.1 mg/L NAA；6. MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC

從表3可以看出，不同激素對(duì)于油用牡丹組培苗生根影響有較大差異。首先，若不加生長(zhǎng)素，采用MS或1/2 MS組培苗均不能生根，說(shuō)明油用牡丹生根較困難；當(dāng)采用IAA或NAA誘導(dǎo)生根時(shí)，組培苗出現(xiàn)生根現(xiàn)象。從生根數(shù)量和生長(zhǎng)速度來(lái)看，NAA明顯優(yōu)于IAA，當(dāng)再生根繼續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間后，組培苗逐漸停止生長(zhǎng)，并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。為此，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的活性 炭[5]，試驗(yàn)結(jié)果顯示，再生根生長(zhǎng)正常，并有側(cè)根產(chǎn)生，因此，選擇MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC作為油用牡丹組培苗的生根培養(yǎng)基較合適。

3 討論

3.1 油用牡丹組培苗玻璃化現(xiàn)象原因分析

在本試驗(yàn)中，油用牡丹組培苗經(jīng)常出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。一般組培苗玻璃化的原因主要有：一是對(duì)激素的反應(yīng)，由于激素會(huì)對(duì)一些植物外植體產(chǎn)生一定的毒害作用，造成玻璃化現(xiàn)象，這個(gè)可以更換其他激素加以解決；二是內(nèi)源乙烯過(guò)多[7]。也有可能是衰老、氣體交換不暢等，可以加入乙烯抑制劑防止，如DTT、Vc、PVP等。另外，組織內(nèi)的微生物污染也可造成植物材料的玻璃化現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，油用牡丹組培苗玻璃化可能由內(nèi)生菌引起，如植物植料表面所帶有的各種細(xì)菌、真菌等微生物或是不能清除的植物材料內(nèi)部的微生物（包括侵入的細(xì)菌、真菌、內(nèi)生菌、病毒、類(lèi)菌原體等）。在試驗(yàn)中雖然加入抗生素加以抑制，但油用牡丹對(duì)抗生素比較敏感，不但不能緩解玻璃化，還會(huì)加重這一現(xiàn)象。為此，本試驗(yàn)采用硝酸銀來(lái)抑制內(nèi)生菌，從而達(dá)到緩解玻璃化的現(xiàn)象。且硝酸銀對(duì)油用牡丹毒害性較小[8]，同時(shí)可以抑制內(nèi)生菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果比較理想，但使用時(shí)濃度不宜過(guò)大，否則會(huì)加劇玻璃化。

3.2 油用牡丹外植體選擇方法

本試驗(yàn)選擇油用牡丹新梢作為外植體，其原因有以下幾點(diǎn)：第一，油用牡丹休眠芽?jī)?nèi)生菌較多，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的污染問(wèn)題，雖然休眠芽可以消除消毒液對(duì)外植體的傷害，但內(nèi)生菌采用表面消毒很難殺滅[9]。因此，采用新梢作為外植體，通過(guò)低濃度安替福民，較短時(shí)間的消毒，可以收到理想的消毒效果；其次，油用牡丹休眠芽在一般條件下很難萌發(fā)，因此在選擇外植體的時(shí)候不建議選用休眠芽[10]。另外，油用牡丹新梢生長(zhǎng)速度較快，獲取外植體后，可以在很短時(shí)間內(nèi)獲得再生芽，加快進(jìn)度，有利于試驗(yàn)順利進(jìn)行。

3.3 活性炭對(duì)油用牡丹生根的影響

油用牡丹再生苗生根困難，在使用生長(zhǎng)素后，雖然可以獲得一定數(shù)量的再生根，但多數(shù)不能正常生長(zhǎng)，可能是再生苗傷口部位出現(xiàn)玻璃化，從而使這些組培苗的次生代謝物對(duì)組培苗再生根產(chǎn)生毒害作用，引起再生根玻璃化和死亡，不能實(shí)現(xiàn)組培苗順利生根[11-12]。為此，本試驗(yàn)采用在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭，一方面吸附有毒物質(zhì)，減少其對(duì)組培苗的毒害。另一方面，有助于組培苗的生根，而在一些試驗(yàn)中通常加入活性炭來(lái)誘導(dǎo)生根[13]。因此，在本試驗(yàn)加入活性炭，再生根出現(xiàn)側(cè)根生長(zhǎng)的現(xiàn)象對(duì)組培苗的移栽成活率有較大的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)油用牡丹進(jìn)行組培快繁關(guān)鍵步驟試驗(yàn)，獲得一般組培苗的培養(yǎng)方法概括如下：首先，選擇生長(zhǎng)健壯的油用牡丹新梢作為外植體，采用15%的安替福民作為消毒劑，處理5 min，可以獲得的消毒效果良好的外植體；將消毒后的無(wú)菌苗在MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得生長(zhǎng)健壯的再生苗；將3～5 cm高的再生苗接種到MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC的培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)30 d可以獲得生根良好的組培苗。本試驗(yàn)結(jié)果可為油用牡丹的組培研究提供參考。

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Study on tissue culture and rapid propagation of

Ren Xiaoqin1, YANG Jinghui1,Corresponding Author, Liu Yanjun1, Zhang Jingxin2, Ma Xin2, Feng Guohua3

（1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Jizhou Forestry Bureau, Tianjin 301900, China; 3. Tianjin Highway Bureau Direct Branch, Tianjin 300074, China）

In order to establish the rapid propagation system oftissue culture, this study usedaxillary buds as explants and used disinfectant of different concentrations for surface disinfection to obtain bacteria-free seedlings.The results showed that the best disinfection effect was obtained when 15% antihuman was used as disinfectant for 5min. In MS＋1.0 mg/L BA＋0.5 mg/L IAA＋5 mg/L AgNO3medium, the regeneration bud proliferation effect ofwas the best.The best rooting effect was observed in MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 g/L AC medium. The results of this experiment can lay a foundation for the study of tissue culture of.

; tissue culture; axillary bud; MS culture medium

1008-5394（2021）04-0019-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.005

S688.9

A

2019-09-24

天津市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目（18JCTPJC68000）;天津市科技特派員項(xiàng)目（17ZXBFNC00310）

任曉琴（1995—）女，碩士在讀，主要從事園藝植物栽培生理研究。E-mail：xiaoqin990714@163.com.

楊靜慧（1961—）女，教授，博士，主要從事園藝植物栽培和生理生化研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。

責(zé)任編輯：楊霞