miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和黏附的影響

劉華長(zhǎng)，楊彥立，薛增明，任 珊

血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管內(nèi)膜的表面，是血管壁與血液之間的天然屏障，對(duì)維持人體生命活動(dòng)的運(yùn)行具有重要作用。研究[1-3]顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移、黏附和凋亡與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、膿毒癥等諸多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA(miRNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，近年研究表明，miRNA表達(dá)異常可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附等功能，參與血管發(fā)育、新血管形成、血管炎癥等的調(diào)節(jié)，與多種心血管疾病病理生理進(jìn)程有關(guān)[4]。有研究[5]指出，在模擬微重力條件下，miR-503-5p可以通過(guò)抑制B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)表達(dá)，在一定程度上誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示miR-503-5p可能參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到血液中各種危險(xiǎn)因子刺激后產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，本研究以促炎因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞，探討miR-503-5p對(duì)IL-1β刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和黏附的影響和作用機(jī)制，以期為臨床基于血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)防心血管疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；IL-1β購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；miR-503-5p抑制物及其對(duì)照由上海吉瑪制藥公司提供；Opti-MEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于大連TAKARA生物科技公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)于北京索萊寶生物科技公司；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海貝博生物；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司；兔源細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)抗體、鼠源血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)抗體、鼠源β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；兔源半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體和兔源裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購(gòu)于上海艾博抗生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的F12K培養(yǎng)基在含5% CO2、濕潤(rùn)的、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將HUVECs分為4組：正常對(duì)照(NC)組為正常培養(yǎng)的HUVECs；IL-1β組參照CHEN等[6]實(shí)驗(yàn)方法用10 ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)HUVECs 24 h；IL-1β+anti-miR-con組為轉(zhuǎn)染anti-miR-con后進(jìn)行IL-1β誘導(dǎo)；IL-1β+anti-miR-503-5p組為轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p后進(jìn)行IL-1β誘導(dǎo)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟：將常溫溶解好的anti-miR-503-5p加入到500 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，同時(shí)將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000加入到500 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置孵育5 min。將二者混合后，室溫靜置孵育20 min。將混合好的脂質(zhì)體加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h后，吸取舊的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果后繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)miR-503-5p表達(dá) Trizol試劑提取各組細(xì)胞的miRNA，利用一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為擴(kuò)增模板，按照SYBR Premix Ex Taq使用說(shuō)明進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物序列如下：miR-503-5p上游5′-CCT ATT TCC CAT GAT TCC TTC ATA-3′，下游5′-GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG-3′；內(nèi)參U6上游5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，下游5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。2-ΔΔCt法量化miR-503-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞，按照5×103個(gè)/孔的密度種植到96孔板，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各取出一板細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔490 nm處吸光度值(OD)。

1.6 黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力 細(xì)胞按照上述分組處理后，進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌單核細(xì)胞THP-1 2次，調(diào)整為1×106個(gè)/毫升的單細(xì)胞懸液。向1 mL THP-1細(xì)胞懸液中加入5 μL的Calcein AM染料，培養(yǎng)箱孵育30 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次已標(biāo)記的THP-1細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，取200 μL THP-1細(xì)胞加入含有內(nèi)皮細(xì)胞的24孔板中，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min，PBS洗滌2次。熒光顯微鏡下拍照，計(jì)算黏附細(xì)胞數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS液輕柔吹打洗滌細(xì)胞2次，向細(xì)胞沉淀中加入適量的1×結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/毫升。吸取100 μL細(xì)胞懸液至一新管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。補(bǔ)加400 μL的1×結(jié)合緩沖液混勻后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，取5×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell上室，24孔板下室用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化劑。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取出小室，用無(wú)菌棉簽擦去未過(guò)膜細(xì)胞，用4%多聚甲醛、結(jié)晶紫分別進(jìn)行固定和染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞過(guò)膜情況，拍照，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 Western blotting檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況 RIPA裂解緩液提取各組細(xì)胞的總蛋白。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并利用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜裝置將分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜后，加入一抗溶液(ICAM-1、VCAM-1、β-actin為1∶500稀釋，caspase-3和Cleaved caspase-3為1∶1 000稀釋)4 ℃條件下孵育膜過(guò)夜。用洗膜緩沖液清洗膜3次后，加入二抗溶液室溫孵育膜1 h。用化學(xué)發(fā)光試劑室溫下孵育膜15 min，X線曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs在24～72 h細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞中miR-503-5p表達(dá)顯著升高；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs在24～72 h細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞中miR-503-5p表達(dá)顯著降低(P<0.01)。在同一處理組，培養(yǎng)24 、48、72 h細(xì)胞活力逐漸升高(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

2.2 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs在24～72 h時(shí)細(xì)胞黏附數(shù)顯著增加(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs在24～72 h時(shí)細(xì)胞黏附數(shù)顯著減少(P<0.01)。同一處理組，培養(yǎng)24 、48、72 h內(nèi)皮細(xì)胞黏附數(shù)量逐漸增加(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響

2.3 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)圖1～2、表3)。

表3 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、caspase-3和Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.4 anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs遷移細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

2.5 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，IL-1β組HUVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與IL-1β+anti-miR-con組比較，IL-1β+anti-miR-503-5p組HUVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)圖3、表5)。

表5 轉(zhuǎn)染anti-miR-503-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1的影響

3 討論

多項(xiàng)研究[7-8]表明，miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究[9-11]顯示，一氧化氮(NO)是血管舒張和血流調(diào)控的重要因子，miR-182、miR-155通過(guò)調(diào)節(jié)NO的釋放，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，通過(guò)改變miRNA表達(dá)可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，預(yù)防高血壓病人的血管炎癥和血管舒張功能受損。低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮微顆粒通過(guò)攜帶miR-19b進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞抑制其靶基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2(TGFβ2)表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及血管形成，對(duì)早期動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展具有抑制作用[12]。miR-381可促進(jìn)氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受炎癥損傷[13]。miR-503-5p是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前對(duì)miR-503-5p的研究主要集中在腫瘤方面。研究顯示，卵巢癌[14]、肝癌[15]等惡性腫瘤中miR-503-5p表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制其增殖、遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，遏制腫瘤進(jìn)展。本研究探討miR-503-5p在IL-1β誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和黏附的作用發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-503-5p的表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-503-5p抑制物下調(diào)miR-503-5p表達(dá)可提高血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力和遷移能力。以上結(jié)果說(shuō)明，抑制miR-503-5p表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移具有促進(jìn)作用。

caspases是一個(gè)高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段起著重要作用。在細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激下caspase-9、Caspases-8等凋亡啟動(dòng)因子活化，通過(guò)一系列途徑促進(jìn)效應(yīng)因子caspase-3活化，剪切細(xì)胞凋亡過(guò)程中許多關(guān)鍵酶，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。因此，caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3的激活產(chǎn)物cleaved caspase-3表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率顯著升高，抑制miR-503-5p表達(dá)可降低cleaved caspase-3表達(dá)水平，減輕IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。靜息狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或僅表達(dá)低水平的黏附分子，對(duì)白細(xì)胞募集具有抵抗作用。在各種刺激作用下，內(nèi)皮細(xì)胞活化并表達(dá)多種黏附分子如VCAM-1、ICAM-1，這些黏附分子可募集白細(xì)胞，調(diào)節(jié)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附，進(jìn)而導(dǎo)致早期心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。本研究顯示，IL-1β誘導(dǎo)后細(xì)胞黏附分子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)、增加，而抑制miR-503-5p表達(dá)可降低VCAM-1和ICAM-1水平，減輕IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附。以上研究說(shuō)明，抑制miR-503-5p表達(dá)可保護(hù)IL-1β誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷和凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-503-5p表達(dá)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，保護(hù)其免受IL-1β誘導(dǎo)的炎性損傷和凋亡。這些發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步了解血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制，并為臨床開(kāi)發(fā)基于血管內(nèi)皮細(xì)胞的心血管疾病防治策略提供新的視角。